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Neuroscience

Transsynaptic Tracing da obiettivi periferiche con Pseudorabies virus seguito da tossina colerica e Biotinilato Dextran ammine doppia etichettatura

Published: September 14, 2015 doi: 10.3791/50672

Abstract

Tracing Transsynaptic è diventato un potente strumento utilizzato per analizzare efferenze centrali che regolano obiettivi periferici attraverso circuiti multi-sinaptici. Questo approccio è stato più ampiamente utilizzato nel cervello utilizzando virus pseudorabbia patogeno suina (PRV) 1. PRV non infetta grandi scimmie, inclusi gli esseri umani, per cui è più comunemente usato negli studi di piccoli mammiferi, in particolare roditori. Il PRV152 pseudorabbia ceppo esprime la maggiore proteina fluorescente verde (eGFP) gene reporter e attraversa solo sinapsi funzionali retrograda attraverso la sequenza gerarchica delle connessioni sinaptiche di distanza dal sito di infezione 2,3. Altri ceppi PRV sono distinte proprietà microbiologiche e possono essere trasportati in entrambe le direzioni (PRV-Becker e PRV-Kaplan) 4,5. Questo protocollo si occuperà esclusivamente di PRV152. Fornendo il virus in un sito periferico, come i muscoli, è possibile limitare l'ingresso del virus in tha cervello attraverso un insieme specifico di neuroni. Il modello risultante segnale di eGFP in tutto il cervello quindi risolve i neuroni che sono collegati alle cellule infette inizialmente. Come la natura distribuita del tracciato transsynaptic con virus pseudorabbia fa interpretare i collegamenti specifici all'interno di una rete identificata difficile, vi presentiamo un metodo sensibile e affidabile utilizzando ammine biotinilate destrano (BDA) e tossina del colera subunità b (CTB) per confermare le connessioni tra le cellule identificate utilizzando PRV152. Rilevazione immunochimica di BDA e CTB con perossidasi e DAB (3, 3'-diaminobenzidina) è stato scelto perché sono efficaci a rivelare i processi cellulari tra cui dendriti distali 6-11.

Introduction

Tracing Transsynaptic è diventato un potente strumento utilizzato per analizzare efferenze centrali che regolano obiettivi periferici attraverso circuiti multi-sinaptici. Questo approccio è stato più ampiamente utilizzato nel cervello dei roditori utilizzando virus pseudorabbia patogeno suina (PRV), in particolare il ceppo attenuato PRV-Bartha descritta per la prima nel 1961 12. Qui, vi presentiamo un protocollo per l'identificazione della rappresentazione corticale motore dei muscoli specifici o gruppi muscolari con un ceppo virale pseudorabbia ricombinanti (PRV152) che esprime la proteina fluorescente verde (eGFP) gene reporter 2. Il metodo descritto sfrutta il comportamento dei virus neurotropi, che producono progenie infettiva che sinapsi trasversali ad infettare altri neuroni all'interno di un circuito funzionale 3,4,13. PRV152, che è isogenic con PRV-Bartha, attraversa solo sinapsi retrograda attraverso la sequenza gerarchica delle connessioni sinaptiche di distanza dal sito di infezione 3,5 </ sup>. Controllando il proprio sito periferico di infezione è possibile limitare l'ingresso del virus nel cervello attraverso uno specifico sottoinsieme di neuroni motori. Come sequenzialmente virus infetta catene di neuroni collegati, il modello risultante segnale di eGFP in tutto il cervello si risolverà la rete di neuroni che sono collegati alle cellule infette inizialmente.

Un ulteriore vantaggio di utilizzare virus per tracciamento neurale è l'amplificazione della proteina reporter (eGFP in questo caso) all'interno delle cellule infette. Questa amplificazione del segnale fornisce un livello di sensibilità che consente di rilevare anche proiezioni sparse. Ad esempio, una proiezione sparse dalla corteccia motoria vibrissa ai motoneuroni facciali che controllano i baffi è stato trovato in ratti utilizzando viralmente espresso proteina fluorescente verde 14; studi precedenti non sono riusciti a trovare questo proiezione utilizzando traccianti classici senza giornalista amplificazione del gene 11,15. purtroppo, Molti vettori virali tracing, come quello usato nello studio citato, non attraversano sinapsi, limitando così il loro uso per tracciare i circuiti multi-sinaptici.

Pur presentando notevoli vantaggi per identificare la rete di cellule che partecipano a un circuito del motore, la natura distribuita transsynaptic tracciare con PRV-152 rende interpretazione collegamenti specifici all'interno del circuito difficile. Pertanto, vi presentiamo un metodo semplice per la convalida collegamenti specifici all'interno dei circuiti identificate utilizzando PRV-152 per doppia etichettatura con ammine biotinilate destrano (BDA) e tossina del colera subunità b (CTB). L'uso combinato di BDA e CTB è un approccio consolidato per tracciare le connessioni tra specifici gruppi di neuroni 6-8,11. Quando usati insieme, queste due rivelatori possono essere visualizzati nella stessa sezione con un DAB due colori (3, 3'-diaminobenzidina) Procedura 16. Alto peso molecolare BDA (BDA10kDa) è stato scelto per questo protocollo perché yields etichettatura dettagliata dei processi neuronali 6,7,9. Ulteriori vantaggi BDA10kDa includono quanto segue: è preferenzialmente trasportato nella direzione anterograda 6-8; può essere trasportato da iontoforetica o pressione di iniezione 6-8; può essere visualizzato da un semplice avidina-HRP biotinilato (ABC) Procedura 17; e può essere ripreso dalla luce o microscopia elettronica 6,7,18. Rilevazione immunochimica di CTB con perossidasi e DAB è stato scelto per l'etichettatura retrograda dei motoneuroni, perché è efficace nel rivelare i processi cellulari tra cui dendriti distali 10,19. Recentemente abbiamo usato questo approccio per identificare il percorso del motore vocale nei topi e per rivelare un collegamento sparse da corteccia motoria primaria per i motoneuroni laringei, che in precedenza era assume siano assenti 20.

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Protocol

NOTA: Tutte le procedure sugli animali sono stati esaminati e approvati dal Istituzionale Cura e uso di animali Comitato Duke University.

1. Memorizzazione Pseudorabies Virus

  1. Otteniamo virus vivo (PRV152) dal laboratorio del Dr. Lynn Enquist alla Princeton University in un titolo di 1 x 10 9 pfu / m. Il protocollo per generare il virus è stato pubblicato 2.
  2. Aliquota il virus a 20 ml per tubo all'interno di un armadietto BSL-2 biosicurezza e conservare a -80 ° C in adeguate condizioni di biosicurezza.
  3. Scongelare una aliquota di PRV immediatamente prima di iniettare.

2. Preparazione chirurgica per iniezioni nel muscolo

  1. Un'anestesia generale per iniezione intramuscolare di ketamina-xilazina (100 mg / kg ketamina; 10 mg / kg xilazina) e mantenere un piano anestetico appropriato utilizzando isofluorano.
  2. Proteggere le cornee con un unguento oftalmico.
  3. Preparare tegli sito chirurgico secondo la tecnica asettica da taglio capelli e disinfezione del sito chirurgico con alternanza di macchie di Betadine e il 70% di alcol (almeno 3 cicli). Assicurarsi di utilizzare teli sterili per coprire aree chirurgiche. Assicurati di rispettare tecniche sterili durante tutta la procedura.
  4. Fare un incisione cutanea e rivelare il muscolo di interesse. Ad esempio, per accedere al muscolo laringea cricotiroidea è necessario prima rimuovere la parte sovrastante del muscolo sternoioideo.
  5. Sigillare eventuali muscoli sezionati con adesivo tessuto Vetbond.

3. Iniezione di PRV in muscolare

  1. Caricare il 10 microlitri sistema Microsiringa NanoFil con una soluzione PRV appena scongelato, inserire un ago in acciaio inossidabile 34 G, e montare con cautela sul dispositivo stereotassico.
  2. Lentamente liberare lo spazio morto e verificare che la soluzione esce dalla punta microsiringa. Smaltire come rifiuto liquido bioharzard.
  3. Utilizzando un microP stereotassicadispositivo ositioning posizionare con cura la punta microsiringa nel muscolo di interesse e lentamente riempire il muscolo fino a leggero gonfiore è visibile. La velocità di iniezione varierà a seconda della dimensione del muscolo e del volume da iniettare. Ad esempio, cinque iniezioni di 200 nl (1 ml totale) ad una velocità di 4 nl / sec devono essere effettuate 1 min a parte nello stesso sito per riempire il muscolo cricotiroideo. Spostare la siringa al prossimo muscolo di interesse (il cricoarytenoid laterale in questo caso) e ripetere la procedura di iniezione. Solo puntura ogni muscolo una volta.
  4. Ritrarre la microsiringa dopo cinque minuti.
  5. Sigillare la pausa nella fascia con adesivo tessuto Vetbond.
  6. Dopo che tutte le iniezioni sono state completate, chiudere la ferita con adesivo tessuto Vetbond. A seconda delle linee guida locali institional uso animale, suture o clip ferita può essere utilizzato.
  7. Monitorare l'animale fino decubito sternale e fornire l'analgesia, cibo, acqua, e la cura come richiesto da yle nostre linee guida sull'uso degli animali istituzionali.
  8. Dopo il tempo di sopravvivenza determinato sperimentalmente (in questo caso, 90 hr etichettare 2 ° ordine dei neuroni corticali), sacrificare l'animale da sovradosaggio pentobarbital e nei profumi transcardially con soluzione fisiologica 0,9% seguita da 4% di formaldeide in PBS 0,1 M.
  9. Rimuovere e post-fissare il cervello in 4% di formaldeide per 24 ore.
  10. Cryoprotect cervello in tampone fosfato contenente il 30% di saccarosio per almeno 48 ore.

4. immunochimica Rilevamento di eGFP

  1. Tagliare sezioni a 40 micron su un microtomo a slitta e salvare sezioni galleggianti in 0.1M PBS. Sezioni più sottili, ad esempio 30 micron, possono essere utilizzate quando colorazione sezioni montate.
  2. Placare le sezioni per 30 min a 0,3% H 2 O 2 in PBS al riparo dalla luce.
  3. Bloccare antigeni non specifici nelle sezioni per 30 min in PBS contenente 0,3% Tween 20 con siero normale di capra dal Kit Vectastain Elite (VE kit).
  4. Lavare sezioni tre volte in PBS per 5 minuti, poi incubare per 1 ora in anticorpo secondario di capra anti-coniglio dalla VE kit a RT.
  5. Preparare la soluzione ABC dal VE kit secondo le istruzioni del produttore.
  6. Lavare sezioni tre volte in PBS per 5 minuti, poi reagire per 1 ora in soluzione ABC dal VE kit a RT.
  7. Lavare sezioni tre volte in tampone fosfato per 10 min, e sviluppare per 8 min in tampone fosfato, pH 7,4, contenente lo 0,05% DAB (3, 3'-diaminobenzidina) e 0,015% H 2 O 2.
  8. Montare sezioni su vetrini SuperFrost Plus e li disidratano attraverso una serie graduata alcol (70%, 95%, 100% e 100% per 5 minuti ciascuno).
  9. Cancellare sezioni attraverso due lavaggi xilene (5 min ciascuno) e applicare il coprioggetto i vetrini con mezzo di montaggio Permount.
  10. Immagine sezioni montati su un microscopio. Il prodotto di reazione DAB inside le cellule dovrebbero apparire marrone. Immagini digitalizzate possono essere colore invertito per evidenziare i processi sottili.

5. Preparazione chirurgica per iniezione di traccianti in regioni cerebrali Scoperto da PRV Tracing

  1. Un'anestesia generale per iniezione intramuscolare di ketamina-xilazina (100 mg / kg ketamina; 10 mg / kg xilazina) e mantenere un piano anestetico appropriato utilizzando isofluorano.
  2. Proteggere le cornee con un unguento oftalmico.
  3. Fissare la testa in un telaio stereotassico appropriata.
  4. Preparare il sito chirurgico secondo la tecnica asettica da taglio capelli e disinfezione del sito con alternanza macchie di Betadine e il 70% di alcol (almeno 3 cicli).
  5. Effettuare una incisione del cuoio capelluto e ritrarre la pelle sopra la regione del cervello di interesse.
  6. Eseguire una piccola craniotomia alle opportune coordinate stereotassica. Ad esempio, le coordinate per corteccia motoria laryngeally collegato individuato da PRV tracciando in unn topo adulto sono 1,2 millimetri laterale e 0,2 mm rostrale a Bregma.

6. L'iniezione di Biotinylated Destrano ammine in Cervello

  1. Preparare 7,5% ammine destrano biotinilati (BDA) sciogliendo 25 mg di BDA (10.000 MW) in 333 ml di soluzione fisiologica sterile.
  2. Caricare il sistema micropipetta Nanoject II con la soluzione BDA sufficiente per le iniezioni pianificate.
  3. Lentamente liberare lo spazio morto e verificare che la soluzione sta per uscire dal punta micropipetta.
  4. Utilizzando un dispositivo microposizionamento stereotassico abbassare con attenzione la punta micropipetta nella regione del cervello di interesse e iniettare lentamente BDA. Regolare la velocità di iniezione in funzione della dimensione della regione da etichettare. Ad esempio, 12 iniezioni di 4,6 nl dovrebbero essere fatto in quattro sedi diverse 0,2 millimetri a parte (rostro-caudale direzione) per coprire la corteccia motoria laryngeally collegato in topi adulti. Il volume di iniezione finale dovrebbe essere regolata in base alle dimensioni della regione del cervello di interesse, Tenendo presente che l'etichetta può diffondersi dal nucleo di iniezione per diffusione attraverso i tessuti cerebrali e lungo i processi di neuroni marcati.
  5. Sigillare la craniotomia con cemento dentale, e chiudere la ferita del cuoio capelluto con adesivo tessuto Vetbond.
  6. Monitorare l'animale fino decubito sternale e fornire l'analgesia, cibo, acqua, e alle cure richieste dalle vostre linee guida sull'uso degli animali istituzionali.

7. L'iniezione di tossina colerica subunità b in muscolare

  1. Preparare 1% tossina colerica subunità b (CTB) sciogliendo 1 mg di CTB in 100 ml di soluzione fisiologica sterile.
  2. Sei giorni dopo l'iniezione BDA nel cervello, eseguire la preparazione chirurgica come descritto sopra per iniezioni PRV nel muscolo.
  3. Caricare il 10 microlitri sistema Microsiringa NanoFil con la soluzione CTB, inserire un ago in acciaio inossidabile 34 G, e con attenzione montare sul dispositivo stereotassico.
  4. Eseguire le microiniezioni nel muscolo (s) di interesse come precedentemente dedescritto per PRV.
  5. Monitorare l'animale fino decubito sternale e fornire l'analgesia, cibo, acqua, e alle cure richieste dalle vostre linee guida sull'uso degli animali istituzionali.
  6. Tre giorni dopo l'iniezione CTB, sacrifica l'animale per overdose pentobarbital e profumato transcardiaca con soluzione fisiologica 0,9% seguito dal 4% di formaldeide in 0,1 M PBS.
  7. Rimuovere e post-fissare il cervello in 4% di formaldeide per 24 ore.
  8. Cryoprotect cervello in tampone fosfato contenente il 30% di saccarosio per almeno 48 ore.

8. Individuazione di BDA e CTB nelle stesse sezioni

  1. Tagliare sezioni a 40 micron su un microtomo e salvare sezioni galleggianti in 0.1M PBS.
  2. Placare le sezioni per 30 min a 0,3% H 2 O 2 in PBS al riparo dalla luce.
  3. Preparare la soluzione ABC dal VE kit secondo le istruzioni del produttore.
  4. Lavare sezioni tre volte in PBS per 5 minuti, poi reagire per 1 ora in soluzione ABC a RT. Lavare sezioni tre volte in tampone fosfato per 10 min, e sviluppare per 8 min in tampone fosfato, pH 7,4, contenente lo 0,05% DAB (3, 3'-diaminobenzidina), 0,015% H 2 O 2, e 0,05% di cloruro di nichel. Il prodotto di reazione DAB all'interno delle cellule dovrebbe apparire nero.
  5. Sezioni di blocco per 30 minuti in PBS contenente 0,3% Tween 20 con siero normale di coniglio dal Kit Vectastain Elite.
  6. Incubare bloccato sezioni per 2 ore in capra anti-CTB (1: 10.000) a temperatura ambiente.
  7. Lavare sezioni tre volte in PBS per 5 minuti, poi incubare per 1 ora in anticorpo secondario di coniglio anti-capra dalla VE kit a RT.
  8. Preparare la soluzione ABC dal VE kit secondo le istruzioni del produttore.
  9. Lavare sezioni tre volte in PBS per 5 minuti, poi reagire per 30 min in soluzione ABC a RT.
  10. Lavare sezioni tre volte in tampone fosfato per 10 min, e sviluppare fino a 8 min in tampone fosfato, pH 7,4, contenente lo 0,05% DAB (3, 3'-diaminobenzidine) e 0,015% H 2 O 2. Il prodotto di reazione DAB all'interno delle cellule dovrebbe apparire marrone.
  11. Montare sezioni su vetrini SuperFrost Plus e li disidratano attraverso una serie graduata alcol (70%, 95%, 100% e 100% per 5 minuti ciascuno).
  12. Cancellare sezioni attraverso due lavaggi xilene (5 min ciascuno) e applicare il coprioggetto i vetrini con mezzo di montaggio Permount.
  13. Immagine sezioni montati su un microscopio.

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Representative Results

Colorazione per eGFP dovrebbe cominciare mostrando segnale debole in neuroni motori primari di circa 72 ore dopo l'iniezione PRV152 nel muscolo. La replica e il trasporto transsynaptic del virus sono titer- e dipendenti dal tempo 4. Circa 90 ore dopo l'iniezione, eGFP colorazione rivelerà segnale più forte nelle cellule infettate ordine 2 nd. Tempi di sopravvivenza più lunghi rivelerà 3 ° e cellule di ordine superiore, ma i tempi di sopravvivenza sono limitati dalla letalità di PRV a circa 5 giorni dopo l'inoculazione.

Figura 1a mostra neuroni infettati con PRV152 esprimere eGFP in nucleo ambiguo, che ospita i motoneuroni laringe, 94 ore dopo l'iniezione di PRV152 in due dei sette muscoli della laringe. Poiché il virus è entrato nel cervello attraverso i neuroni che innervano i muscoli infetti, altre piscine motoneuroni fonazione, come il nucleo ipoglosso, non esprimono eGFP (Figura 1b).

"jove_content"> Figura 2 mostra il trasporto retrogrado del virus di 2 ° ordine tronco encefalico neuroni successivi all'infezione primaria nucleo ambiguo. L'iniezione unilaterale, e lo schema risultante dell'etichetta nel tronco cerebrale mostra infezione della ambiguus nucleo ipsilaterale e Nucleo del tratto solitario (Figura 2a). Interneuroni reticolari sono stati infettati e colorate con forza per eGFP (Figura 2b). Questi interneuroni collegano varie strutture, tra cui le piscine motoneuroni fonatorio e il nucleo ambiguus controlaterale; tuttavia, i loro obiettivi efferenti rimangono non marcato perché il virus si diffonde solo nella direzione retrograda.

La figura 3 mostra i neuroni premotori infetti nella corteccia motoria che esprimono eGFP controlaterale al sito di iniezione periferica. Perché PRV152 si diffonde attraverso i circuiti multi-sinaptici che influiscono su motoneuroni laringei in nucleo ambiguo, si può be suppone che solo la popolazione di cellule che compongono la rappresentazione corticale motore della muscolatura laringea sono stati infettati. La mancanza di segnale di eGFP nel resto della sezione mostrata (e la maggior parte del proencefalo non illustrato) dimostra la specificità del etichettatura.

Figura 4 mostra assoni BDA-marcato nel tronco cerebrale a livello di nucleo ambiguo. Gli assoni in contatto con i neuroni motori CTB-positivi retrogrado etichettati da iniezioni in muscoli laringei. Gli assoni sono mostrati formare varicosità e boutons terminali putativi vicino i dendriti e soma di neuroni motori laringei. Ulteriori esperimenti usando la microscopia elettronica o elettrofisiologia sono necessari per determinare se questi varicosità rappresentano boutons sinaptica.

La figura 5a mostra una iniezione bilaterale di BDA inserito nel corteccia motoria laryngeally collegato come identificato da transynaptic retrograda tracciando con PRV152. Bec ausa BDA non è direzionale specifico, entrambe le connessioni afferenti ed efferenti possono essere etichettati. Ad esempio, sia un campo di proiezione (anterograda) e corpi cellulari (retrograda) etichetta sono visti nel talamo (figura 5b).

Figura 1
Figura 1: I neuroni infettati con PRV152 Esprimere eGFP (verde) e colina acetiltransferasi immunopositive motoneuroni (rosso) in (a) ambiguus (Amb) e (b) ipoglosso (XII) Nuclei del mouse Brainstem 94 ore dopo l'iniezione di PRV152 nel cricotiroidea e laterale Cricoarytenoid laringei muscoli. RF = formazione reticolare. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 2:. Psuedorabies Virus (PRV152) infezione nel tronco cerebrale di un topo 86 ore dopo l'iniezione di PRV152 nei muscoli cricotiroidea e laterale Cricoarytenoid laringei (a) I neuroni che esprimono migliorati verdi proteina fluorescente (bianco, colori invertiti dalle immagini brightfield originali di sezioni colorate ) in nucleo ambiguus (Amb) ipsilaterale al muscolo iniettato, la formazione circostante reticolare (RF) e il nucleo solitari (Sol), ma non il nucleo ipoglosso (XII). (B) Amb e interneuroni reticolari a maggiore ingrandimento (frecce rosse, corpi cellulari in RF). Barre di scala: 1 mm per una; 100 micron per b. (Modificata da Arriaga et al. 2012). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 3:. Corticali Piramidale neuroni Esprimere eGFP (bianco, colori invertiti da originali immagini brightfield di sezioni colorate) in corticale strato V della M1 dopo l'iniezione di Psuedorabies Virus (PRV152) nei muscoli cricotiroidea e laterale Cricoarytenoid laringei Barre di scala: 1 mm per pannello principale; 200 micron per incasso. (Modificata da Arriaga et al. 2012).

Figura 4
Figura 4:. M1 assoni nel tronco encefalico (a), di potere basso di una sezione tronco encefalico coronale contenente motoneuroni CTB-etichettati Amb (marrone) da una iniezione nei muscoli laringei e assoni M1 (nere) da una iniezione di BDA in M1. BDA assoni etichettati può essere visto in pista cortico-piramidali (Pyr). Abbreviazioni: Amb, nucleo ambiguo; Pyr, piramidi; MRF, rformazione eticular mediale direttamente a Amb; DRF, reticolare dorsale formazione di Amb. (B) Alto ingrandimento di BDA etichettato assone (nero, punte di freccia) da M1 che fa contatto (freccia) su un Amb motoneuroni (CTB marroni). (C) M1 assoni (nero) che corre lungo (frecce) e vicino (punte di freccia) una grande Amb motoneurone dendrite che irradia da Amb. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5: al sito di iniezione e ulteriori connessioni bidirezionali rivelate da BDA iniezioni non visti con riduttore di pressione transynaptic tracciato. (a) ammina destrano (BDA) iniezioni bilaterali biotinilati (nero) in corteccia motoria primaria (M1) hanno rivelato un campo denso terminale proiezione (nero) nello striato sottostante. (b) Cortiassoni cal da M1 terminano nel nucleo laterale ventrale del talamo (VL); Un gruppo di cellule del talamo (marrone scuro e segnato da freccia bianca testa) che il progetto alla regione canto M1 si osserva anche in VL. La capsula interna (IC) ha etichettato assoni provenienti dalla corteccia. Barre di scala: 1 mm per una; 200 micron per b. (Modificata da Arriaga et al. 2012). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Ci sono una serie di questioni che devono essere presi in considerazione al momento di pianificare un esperimento utilizzando PRV152 4,21. Ancora più importante, il virus della pseudorabbia è letale. Come accennato in precedenza, le grandi scimmie, inclusi gli esseri umani non sono suscettibili alle infezioni, ma cure appropriate devono essere esercitati per proteggere gli altri animali. Topi adulti in genere sopravvivono cinque a sette giorni dopo l'inoculazione con il ceppo PRV152 attenuato. Pertanto, PRV152 non è appropriato per gli esperimenti che richiedono tempi di sopravvivenza di più di una settimana. Inoltre, gli animali infetti in genere mostrano segni di malattia durante il periodo di sopravvivenza, limitando in tal modo l'utilità di PRV152 per gli esperimenti che richiedono l'osservazione di comportamenti normali.

Inoltre, PRV152 innesca una risposta immunitaria citotossica 22. Poiché la replicazione e trasmissione del virus sono titer- e dipendente dal tempo 4, il modello di neuroni rivelata dalla rilevazione immunochimica di viraproteine ​​litri o il gene reporter eGFP cambiano nel corso del periodo di sopravvivenza come cellule progressi attraverso fasi dell'infezione. Cinque giorni dopo l'inoculazione nel muscolo, 3 ° o 4 ° neuroni ordine possono essere rilevabili, ma i primi neuroni infettate possono diventare apoptotico. Così il tempo ottimale di sopravvivenza deve essere determinato sperimentalmente per ogni studio. Si raccomanda di eseguire una analisi di serie per determinare la progressione dell'infezione attraverso un circuito e il punto di tempo per etichettare i neuroni specifici di interesse senza rischiare cellule morte o animale.

Uno dei fattori più importanti che influenzano il successo di etichettatura con PRV è il titolo virale. Riduzioni marcate nel numero di cellule infette sono stati riportati quando diminuendo il titolo di PRV-Bartha da 1,4 x ottobre 5-07 x 10 4 pfu / ml 23. Pertanto, si consiglia di utilizzare i titoli di cui sopra 1 x 10 7 pfu / ml e tenuta aliquotate virus a -80 ° C fino a quando non viene utilizzato per mantenere la sua infettività. Anche quando si utilizza un alto titolo, si dovrebbe tenere a mente che non tutti i tipi di cellule possono essere permissiva per l'infezione. Pertanto, le cellule identificate da PRV tracing non possono essere completamente rappresentative degli ingressi a un target infetto.

Il metodo descritto si concentra sull'utilità di PRV per analizzare efferenze centrali regolano bersagli periferici, in particolare i muscoli, attraverso circuiti multi-sinaptici. Altri circuiti neurali, come visiva e autonomo 24, sono adatti per questa tecnica, perché possono anche essere infettati da inoculo periferico. Tuttavia, PRV può essere utilizzato efficacemente per l'iniezione diretta nel sistema nervoso centrale quando alcuni problemi sono attentamente considerati, come discusso ampiamente in una recensione precedente 3. Gli autori riferiscono che PRV-Bartha e ceppi correlati ampiamente riempiono le pergole dendritiche dei neuroni infetti, rendendo PRV152 adatto per identifying afferenti a dendriti distali. Questa proprietà del virus rende la tecnica descritta particolarmente utile per dedurre un primo elenco di ingressi dendriti distali situate al di fuori della regione di corpo cellulare che è tipicamente studiati con traccianti convenzionali.

Quando il tracciamento da bersagli periferici, innervazione simpatica dovrebbe essere considerato un possibile confondere. Pertanto, si consiglia inizialmente confrontando modelli di etichettatura in animali normali e sympathectomized per determinare se l'etichettatura PRV di ingressi simpatici influenzerà interpretazione dei risultati.

Segnale in cellule infettate da eGFP espressi da PRV152 possono essere esposte direttamente mediante microscopia a fluorescenza senza necessità di immunoistochimica; tuttavia, questo segnale è soggetto a fotometabolismo e degrada nel tempo. Il vantaggio principale di immunoistochimica combinata con DAB colorazione per tratto tracciamento è la natura permanente dei prodotti di reazione. Mentre ianche possibile utilizzare anticorpi contro le proteine ​​virali per rilevare le cellule infette, diversi elementi virali non saranno necessariamente co-localizzare con l'altro 25 o con il segnale eGFP. Pertanto, si consiglia di utilizzare anticorpi contro eGFP per preservare il modello di etichettatura osservato da fluorescenza.

Poiché tutte le afferenze di una cellula infetta sono destinate a diventare condotti per il passaggio transsynaptic virus, compresi quelli che contattare dendriti distali, abbiamo ritenuto importante per selezionare un tracciante convenzionale che macchia in modo affidabile tali dendriti per la successiva conferma dei relè nel circuito identificato. Abbiamo scelto CTB per questo scopo, che non fornisce una buona colorazione dei dendriti e forte contrasto sia con il neuropil circostante e gli assoni discendenti dalla corteccia motoria. Anche se è possibile invertire la colorazione degli assoni macchiati e corpi cellulari (BDA = marrone; CTB = nero), troviamo che nero fornisce la migliore contrast per la visualizzazione sottili assoni calibro.

Un punto importante da tenere a mente quando si interpretano i modelli di etichettatura BDA è che BDA10kDa è usato principalmente come un tracciante anterograda, ma può anche etichettare le cellule retrograda (Figura 6) 6. Inoltre, BDA può essere trasportato in una cella retrogrado poi distribuiti lungo un assone collaterale di un altro sito terminale. Se tali collaterali assoni sono presenti nella stessa regione bersaglio proiezione regione iniettato, allora è difficile distinguerli da etichettatura anterograda.

Una nota tecnica finale è che la siringa di metallo 34 G NanoFil esegue meglio di un bel calibro, tirato pipetta di vetro per l'iniezione di traccianti nei muscoli, ma provoca troppi danni meccanici quando viene utilizzato per le iniezioni intracerebrali in piccoli animali. Si consiglia pertanto di utilizzare la siringa in metallo per le iniezioni periferiche e la pipetta di vetro per le iniezioni centrali.

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Acknowledgments

Ringraziamo il Dott Toshio Terashima di Università di Kobe, in Giappone, per l'insegnamento della tecnica di chirurgia laringea, e il dottor Lynn Enquist della Princeton University per la fornitura di PRV-Bartha. La ricerca è stata sostenuta da premio pioniere NIH DP1 OD000448 Erich D. Jarvis e un premio NSF Graduate Research Fellowship a Gustavo Arriaga. Le cifre precedente lavoro opportunamente accreditati sono utilizzati sotto la PLoS ONE accesso aperto licenza Creative Commons (CC-BY) in accordo con le politiche editoriali della rivista.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
NanoFil Microinjection System World Precision Instruments IO-Kit 34 G option
Stereotaxic frame David Kopf Instruments Model 900
Nanoject II Auto-Nanoliter Injector Drummond Scientific Company 3-000-204
Sliding microtome Leica SM2010 R
Name Company Catalog Number Comments
VetBond 3M 1469SB
Isofluorane (Forane) Baxter  1001936060
Betadine Swab Stick Cardinal Health 2130-01 200 count
Permount Mounting Medium Fisher Scientific SP15-500
SuperFrost Plus slides Fisher Scientific 12-550-15
Biotinylated dextran amines Invitrogen D-1956 10,000 MW
Pseudorabies virus Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University) PRV152 Titer >1 x 107
Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat) List Biological Laboratories 703
Cholera Toxin B Subunit List Biological Laboratories 103B
Anti-eGFP Open Biosystems ABS4528
3, 3'-diaminobenzidine Sigma-Aldrich D5905 10 mg tablets
Ethanol Sigma-Aldrich E7023 200 proof
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775 Dilute to 4%
Hydrogen peroxide Sigma-Aldrich H3410 30%
Ketamine HCl & Xylazine HCl Sigma-Aldrich K4138 80 mg/ml & 6 mg/ml
Nickel chloride Sigma-Aldrich 339350
Phosphate buffer Sigma-Aldrich P3619 1.0 M; pH 7.4
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P5493 10x; pH 7.4
Sodium Pentobarbital Sigma-Aldrich P3761 50 mg/ml dose
Sucrose Sigma-Aldrich S9378
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Xylenes Sigma-Aldrich 534056 Histological grade
VECTASTAIN Elite ABC Kit Vector Laboratories PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat)
Optixcare opthalmic ointment Vet Depot 1017992

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References

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Neuroscienze Numero 103 virus pseudorabbia la tossina del colera ammine destrano biotinilati circuito di tracciamento neuroanatomia.
Transsynaptic Tracing da obiettivi periferiche con Pseudorabies virus seguito da tossina colerica e Biotinilato Dextran ammine doppia etichettatura
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Arriaga, G., Macopson, J. J.,More

Arriaga, G., Macopson, J. J., Jarvis, E. D. Transsynaptic Tracing from Peripheral Targets with Pseudorabies Virus Followed by Cholera Toxin and Biotinylated Dextran Amines Double Labeling. J. Vis. Exp. (103), e50672, doi:10.3791/50672 (2015).

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