Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

定量的な Published: August 23, 2013 doi: 10.3791/50677
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Department of Anesthesia and Perioperative Care, University of California, San Francisco, 2Graduate Program in Biomedical Sciences, University of California, San Francisco

Summary

感染部位における活性化内皮への好中球の順守は、ホストの炎症反応に不可欠なコンポーネントです。を可能にした好中球結合アッセイは、この報告書に記載

Abstract

血管内皮は、炎症反応に不可欠な役割を果たしている。炎症の急性期の間に、内皮細胞（ECの）保存された微生物成分又は宿主由来の危険分子による宿主メディエーター直接によって活性化される。活性化されたECの特急サイトカイン、動員ケモカインおよび接着分子は、感染症やけがの部位で白血球を活性化し、維持する。好中球は到着する最初の白血球であり、両方の細胞の表面に存在する接着分子のさまざまな内皮に付着する。好中球の主な機能は、直接、微生物の脅威を除去するための追加の因子の放出を介して他の白血球の動員を促進し、創傷修復を開始することである。したがって、内皮への採用とアタッチメントは、炎症応答の開始に重要なステップです。本稿では、用いたin vitro好中球接着アッセイで説明カルセインAM-標識された一次ヒト好中球は、静的条件下で微小血管内皮細胞の活性化の程度を定量する。この方法は、蛍光分光光度計で定量し、同じサンプルは、直接結合好中球のより定性的評価のために蛍光顕微鏡を用いて可視化することができるというさらなる利点を有する。

Introduction

血管内皮の循環血液と直接接触しているので、一意的に感染または損傷時に迅速な炎症反応を開始させる位置している。内皮細胞（ECS）の保存された細菌成分と危険分子の多様性、ならびにTNFαなどの炎症性メディエーターホストに対する受容体を認識する明白なパターン認識受容体。これらの受容体の活性化は、分泌性サイトカイン（ 例えば、IL-6、IL-8、CXCL1およびCCL2）へのECを誘導し、そしてその細胞表面1の接着分子（ 例えば、E / P-セレクチン、VCAM-1およびICAM-1）をアップレギュレートする、2。これらの分子は、すべての感染性病原体の宿主をクリアし、組織修復を3,4を開始するために感染や傷害部位への白血球の局在を促進する。感染に好中球応答が血管内皮と応答の間でよく調整された相互作用を伴う好中球。 EC活性化、ILアポン8が分泌され、感染症やけが5,6のサイトに家に好中球を可能に内皮に血管内の勾配を形成する。 E / P-セレクチン好中球の取り込みを仲介し、好中球の細胞表面上にglycomoleculesと比較的弱い団体を通じてローリング。これらの相互作用は、その同族受容体へのIL-8結合とともに、堅牢な、インテグリン媒介アタッチメントおよび内皮細胞表面7-10に好中球の最終的な逮捕を容易にします。停止した後、好中球は、直接病原体を排除するために、感染の特定の部位への脈管構造から移動病原体の拡散を防ぐために好中球細胞外トラップを生成し、創傷治癒を促進し、単球、マクロファージおよび樹状などの他の白血球を補充する追加の因子を放出することができ細胞11-17。

microvへの好中球の接着を定量するためのインビトロ方法は、この報告書に記載ascularはTNFα宿主炎症性メディエータによる活性化した後にECを。このアッセイは、ECの活性化のではなく、好中球を評価するために設計されている。初代ヒト好中球は、第密度勾配分離を用いて単離され、次いで、カルセインアセトキシメチル（AM）で標識される。生細胞加水カルセイン内エステラーゼは、492から495 nmおよび513から516 nmの18の放射の励起と高蛍光カルセイン分子にAM。蛍光標識された好中球は、その後、EC単層と共にインキュベートし、非付着性好中球は、その後、除去される。残りの結合した好中球の蛍光は、その後、蛍光分光光度計を用いて測定し、ウェルあたりの総好中球の蛍光入力のパーセントとして計算される。この方法は、分光光度法で使用される結合したカルセイン-標識された好中球を直接より定性的なEC交流から読み出さを与えるために蛍光顕微鏡を用いて可視化することができるというさらなる利点を有するtivati​​on。このアッセイは、静的条件下で行われるので、好中球の接着カスケードに生じるごく初期のイベントが評価される。これは、そのE-セレクチンとの相互作用が中断されたときTNFα処理ヒト肺微小血管EC（HMVEC-肺）単層への好中球の順守を大幅に低減されることを示すために、E-セレクチン遮断抗体を使用して、この報告書で確認された。

TNFαに加えて、我々は正常Toll様受容体1/2アゴニストペプチドグリカン関連リポタンパク質（PAL）、ムレインリポタンパク質（MLP）とPam3Cysによってヒト臍帯静脈EC（HUVEC）活性化の程度を決定するために、このアッセイを使用しているPam3Cys 19,20によってHMVEC-肺の活性化。さらに、我々は正常にこの方法論は、さまざまな互換性があることを示唆し、キナーゼ阻害剤とHMVEC-肺における表面および細胞質タンパク質のRNAiによるノックダウンした後に、このアッセイを使用した生化学的およびscreeninグラムアッセイ20。要約すると、このアッセイは、in vitroで炎症性メディエーターによってECの活性化の程度にアクセスするため、使いやすい、再現性、より機能的な方法を提供します。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1。微小血管内皮細胞のメッキとメンテナンス

  1. 命令を供給メーカーによるとあなたの微小血管内皮細胞を解凍し、成長する。このプロトコルでは、細胞をEGM-2 MVメディア（ロンザ）で増殖させた、そしてそれは全ての実験は、継代数に起因するいかなる変動を最小限に抑えるために解凍から2週間以内に行われることが推奨される。 HMVECロンと私たちの実験は4〜9の通路との間で行われている。
  2. 1日目：細胞が80〜90％コンフルエントに達したとき、トリプシン処理及び1ml当たり120,000細胞で再懸濁します。 48ウェル、ポリスチレン組織培養プレート（S）にプレートウェルあたり36,000細胞（0.3ミリリットル）を。バックグラウンド蛍光測定値を得るために、好中球とインキュベートされることはありません HMVECの井戸を含めます。特に蛍光アッセイ、交互の行または列用に設計された48ウェルプレートを用いた場合を除き、隣接する井戸からの光の汚染を最小限に抑えることができます。注：ウェルズポリlysiでプレコートすることができますね、コラーゲンやフィブロネクチン。
  3. 2日目：新鮮な培地を追加します。
  4. 3日目：位相差顕微鏡で、細胞（ すなわち 、 "玉石"の外観と少し細胞の破片）健康的であり、彼らが100％コンフルエント（ 図1）であることを確認します。細胞が100％コンフルエントでない場合、彼らは準備が整うまで、毎日メディアを変更してください。
  5. HMVEC単層が治療のために準備ができたら、ハンクス平衡塩溶液（HBSS）で1回細胞を洗浄し、適切なウェルに炎症性アゴニストを含有する新鮮なEGM-2 MVメディアまたはメディア0.3 mlを加える。このプロトコルではHMVEC-肺をTNFαで処理した3時間[100 ngの/ mlの]（ぺプロテック、ニュージャージー州）、これはECの21のよく説明ベーターであるため。注：これは、（ステップ3.5）、好中球のラベルが付いたAM、時間あなたの実験をので、あなたの活性化HMVEC細胞（ステップ4.1）とカルセインことをことをお勧めしますが、同時に使用する準備が整いました。それはneutrophを分離し、標識するために私たちに約2.5時間かかりますILS。

2。 Polymorphprepを使用して好中球分離

  1. 以前に22説明したように好中球を分離し、または全血から多形核顆粒球を分離するため、既製の密度勾配液で。 Nuzzi、 らによるプロトコルに従ってPolymorphprepを採用。全血23 1mlあたり約2〜3×10 6の好中球の利回り2007年の結果は。注：赤血球を除去するために過剰な赤血球溶解、デキストラン沈降を回避するためには、密度勾配遠心24の前に行ってもよい。
  2. RTへPolymorphprep密度勾配液を持参してください。
  3. 例えば、ヘパリン、クエン酸塩またはEDTAなどの抗凝固剤の存在下で、健康な人間のボランティアからの全血30mlのを収集します。血液は、2時間以内に使用され、18-22℃の間で保管してください
  4. 15ミリリットルコニカルチューブ内の密度勾配溶液5mlを超える全血の層5ミリリットル（
  5. 18-22で30分間450×gで遠心℃、ゆっくりスピードアップとダウンの遠心分離機（ すなわち遠心ブレーキをオフにする）、および好中球の活性化を減少させ、層の混合を防ぐために振動を防ぐためによくチューブのバランスをとることを確認してください。長い遠心倍以上の遠心力がペレット化赤血球に向かってさらに下方に移動するように、好中球を含む下位の白血球層をもたらす。
  6. 好中球（ 図2B）を含む層の汚染を防止するために、PBMCを含有プラズマ及び上部白血球バンドを吸引。
  7. 好中球を含む白血球下位層を除去するために1〜2ミリリットル血清ピペットを使用してください。 50mlのPBSを30ml（のCa 2 +およびMg 2 +なし）に好中球のレイヤーを結合コニカルチューブ。
  8. PBSで50ミリリットル（のCa 2 +およびMg 2 +なし）にボリュームを起動し、18〜22歳で10分間、450×gで遠心℃、

注：ステップ2.9と2.10はオプションですが、強く推奨。

  1. 上清を吸引。赤血球を溶解するために30秒間の滅菌水8mlに好中球を再懸濁し、すぐに5倍の2mlのPBS（のCa 2なし+およびMg 2 +）と優しく手でミックス。で細 ​​胞をインキュベートしない]に細胞懸濁液を追加30秒より長くのための水の重要な好中球の死が発生する可能性があるため。
  2. 18-22で5分間250 xgで遠心℃、
  3. 10mlのPBS（Ca 2 +のおよびMg 2 +なし）で1回細胞を洗浄し、18〜22歳で5分間250 xgで再び遠心℃、
  4. RPMI-1640（フェノールレッドなし）10ml中の好中球を再懸濁し、トリパンブルーを用いて生細胞を数える電子色素排除法。これは、好中球の活性化につながる可能性があるので、1mlあたり5×10 6より大きい細胞密度の長時間は避けてください。

3。カルセインAMと好中球のラベル

  1. 6×10 5好中球は、48ウェルプレートのウェルあたりに使用される。
  2. カウントした後、50ミリリットルコニカルチューブに再懸濁した細胞を転送し、フェノールレッドを含まないRPMI-1640で1mlあたり2-4×10 6細胞に好中球を希釈。
  3. カルセインが3μm（カルセインAM株式すなわち 2.98液（1 mg / ml）でml当たりのメディア）に原液AM加え、穏やかにチューブをフリックでよく混ぜる。以上5μMはカルセイン好中球からの漏れが発生しますAM 注：非蛍光カルセインAMが高い蛍光分子カルセイン（ つまり死んだ細胞が蛍光を発することはありません）を生成するために、内因性エステラーゼにより細胞内で切断される。
  4. アルミホイルでチューブをカバーとfをインキュベートまたは37℃で30分間、暗注C：長いインキュベーション時間は接着アッセイの過程で好中球から解放され、よりカルセインになることがあります。
  5. 18-22°Cで5分間450×gで遠心分離し、RPMI-1640（フェノールレッドなし、37℃に予熱）10mlで2倍の好中球を洗う。 40μM無菌フィルターは18-22で塊を除去した後、5分間450 xgで再び遠心分離するのに二回目の洗浄のために細胞を再懸濁した後、最初の好中球を渡​​す℃に
  6. 1mlあたり2×10 6好中球で。（37℃に予め温めずにフェノールレッド）RPMI 1640中で好中球を再懸濁し

4。好中球結合アッセイ

  1. フィルター滅菌を0.5ml（0.22μm）をRPMI 1640（フェノールレッドなし）ウェルあたり3％BSAを含むと3倍HMVEC単層を洗浄します。
  2. メディアを吸引し、6×10 5カルセイン標識好中球（細胞サスペンシオ0.3 mlを加える48ウェルプレートの適当なウェルに好中球なしN）、またはRPMI 1640 0.3mlの（フェノールレッドなし）、 注：これは1cm 2あたり8×10 5の好中球と同等です。
  3. 37°C、5％CO 2インキュベーター内で20分間インキュベートする。
  4. 総好中球蛍光（PRE洗浄）：485 nmでの励起波長および発光FLUOstarにおける520nmの（フルオレセインフィルターセット）の波長、またはそれと同等の分光光度計を用いて各ウェルの蛍光強度を測定する。直前のインキュベーション終了点までこのステップを実行注：このプロトコルでは、放出される光のカルセインの励起および検出が覆わウェルの上部から行われたが、両方はまた、ウェルの底部から行うことができる。
  5. 0.5ミリリットルウェルあたりのPBS（W / Ca 2 +のおよびMg 2 +）と5倍HMVEC単層および好中球を含むウェルを洗ってください。メディアや洗浄を削除反転プレートによって、残りの液体を除去するためにペーパータオルの上に優しくパッティング。
  6. バックウェルあたりRPMI 1640 0.3ミリリットル（フェノールレッドなし）を追加します。
  7. 付着性好中球蛍光（POSTウォッシュ）：ステップ4.4のように、各ウェルの蛍光強度を測定します。
  8. パーセント順守とウェルあたり相対遵守を決定する：

注：この段階で、カルセイン-標識された好中球の画像は標準フルオレセインフィルターを備えた蛍光顕微鏡を使用することができることによって得ることができる。 図4の画像は、Pro7ソフトウェア（Qイメージング）、Qは-キャプチャ使用Retiga 2000Rカメラ（Qイメージング）を搭載したオリンパスIX51倒立顕微鏡で得た。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

好中球結合アッセイを使用して、信頼性、再現性のある結果を得るためには、 図1のHMVEC-肺に示すように、健康および微小血管内皮細胞のコンフルエントには、アッセイの当日に最適であることが不可欠である。また、低継番号微小血管のECは（9未満通路すなわち ）が使用されることが不可欠であり、従って、我々は、解凍から2週間以内にすべての実験を行うことをお勧めします。好中球の健康状態は、細胞が何らかの方法で構成されている場合、カルセインAMは、蛍光カルセイン分子に代謝されることはありません、特に以来、また、最も重要なのです。私たちは、トリパンブルー排除法を使用しており、細胞のかなりの割合（ すなわちステンド）死んでいる場合、検定を続行しないでください。

好中球を単離する方法はいくつ密度勾配および抗原ベースのカラム分離方法、のいずれかを含むがあるこれらは、この手順のために十分です。我々は、AxisシールドからPolymorphprep既製密度勾配液を使用することにしました。 図2に見られるように、好中球は遠心分離後に下層内にある間に、PBMCを、トップ層に存在している。 PBMC層は、それらの除去の際顆粒球の汚染を避けるために吸引される。水が残っている赤血球を溶解するために添加されるステップ2.9は、任意であることに留意することが重要である。それはすべての混入赤血球を除去するために理想的である間しかし、それは、好中球は、かなりの死が発生する可能性の後に30秒以上の純水に座っていないことが重要です。

最後に、好中球は、予め温めておいた（37°C）RPMI-1640培地（フェノールレッドなし）で洗浄し、再懸濁し、30分間、カルセインAM用と共にインキュベートする。蛍光読み取りを妨害することがフェノールレッドなしでメディアを使用することが重要である。 neutr数ophilsがウェルに添加すると蛍光測定値前後の洗浄は分光光度計の直線範囲内であることを提供するのではなく、任意であり、どちらかの好中球の付着を促進するか、または防ぐための治療との違いは、（下記参照）再現性を確認することができる。私たちは、10,000〜1,000,000ラベル好中球（ 図3A）を分析するとき蛍光OD 520nmのが線形範囲内にあることを見つける。興味深いことに、我々はまた、より多くの好中球は、TNFαので処理HMVEC-肺単層に追加されるパーセントの付着が増加することを発見[100 ngの/ mlの] 3時間（ 図3B）のために。我々は、接着の割合が有意に（データは示さず）、この時点の後に増加しないことが判明ので、我々は、20分間一緒にHMVEC-肺をインキュベートすることを選択し、カルセイン標識された好中球。注目すべきは、このアッセイでは、我々は標準的な、明確なポリスチレン48ウェルプレートを使用し、tの間の蛍光クロスオーバー測定値のレベルがわかっ彼ウェルは、総蛍光入力（データは示さず）の0.5％以下に達するなかった。それにもかかわらず、我々は（ステップ1.2を参照）は、クロスオーバーの測定値を最小化するために、実験を設計し、可能な場合、または非常に少なくとも、意図的にもっと敏感な実験のための蛍光分光光度計の測定値のために作られた48ウェルプレートを使用することを推奨します。

好中球数がウェルに加えていることを実証するには、あまりにも長い間数が追加されたように、むしろ任意で分光光度計の直線範囲内であれば、我々は、p38の有無にTNFα処理HMVEC-肺と好中球接着アッセイを行った好中球の変化する入力量（ すなわち 40,000 /ウェル200,000 /ウェルまたは1,000,000 /ウェル）25を使用して-MAPK阻害BIRB7906、。 P38-MAPK以前に処理されたヒトTNFαのECにおけるE-セレクチン発現に必要であることが示されており、その阻害は、したがって、TNFα活​​性化されたHMVEC-肺好中球の結合を減少させるべきである26。実際には、これは（ 図3C）私たちが観察するものです。我々はより多くの好中球が追加されるパーセントの付着が増加し、パーセントの付着は、このような間ドナーのバリエーション、合流で好中球の質とHMVECの密度は、相対的な遵守などの様々な要因により、実験間で異なる可能性があることを見つけることが、条件の間にかかわらず添加好中球数（ 図3Cおよびデータは示さず）の各独立した実験において、比較的一定のままである。それは間の実験の一貫性のためのポジティブコントロールからの相対パスとして接着データを表示するために優れている理由これらのデータはまた、例示している。

完全にこのアッセイがどのように機能するかを説明するために、我々は、TNFα処理HMVEC-肺コントロール抗体またはE-セレクチン遮断抗体のいずれかとプレインキュベートして好中球接着アッセイを行った。 E-セレクチンは、TNFαのをキャプチャneutrで処理した後EC表面上に発現される好中球表面1,27上に存在glycomoleculesとの静電相互作用を介して血管系からophils。 図4cに、図4B、視覚にグラフで、 図4Aに数値的に示されているように、TNFα処理HMVEC-肺はTNFα処理HMVEC-肺より〜75％未満の好中球は、プレインキュベートバインドE-セレクチン抗体と共にプレインキュベートコントロールIgGと。これは、E-セレクチンたち静的接着アッセイでHMVEC-肺に好中球をテザリングに重要な役割を果たしていることを示唆している。

図1
図1。健康、コンフルエントHMVEC-肺単層の例は、 "玉石"の外観と単層の合計コンフルエントに注意してください。画像は、フィッシャーサイエンティフィックMICROMASTER倒立デジタル顕微鏡で4Xと10Xの倍率で撮影された。 図2
図2。多核顆粒球が（好中球）の個別下バンドを結成しながら遠心分離後、末梢血単核球は、明確な上限バンドを形成することを全血とPolymorphprep遠心分離（）の前に重層し、遠心分離（B）後に分離は注意してください。

図3
図3。好中球数の関係と蛍光OD 520nmのが線形で、TNFα処理HMVEC-肺増加する好中球のパーセント接着より好中球が追加されますので、P38-MAPKはTNFα活性化HMVEC-肺単層に好中球の遵守を促進する（）グラフリネアを描いた二桁以上の蛍光OD 520nmの好中球数の間のrが関係。 10,000〜1,000,000好中球を分析する際0.996のR2の値は、好中球数と蛍光OD 520nmの間の線形関係を示している。（B）カルセイン-標識された好中球の数を変化させパーセントの付着のグラフィカル表現が未処理またはTNFα処理に添加した（ 100 ngの/ mlで、48ウェルプレートで3時間）HMVEC-肺単層（C）HMVEC-肺単層のためのp38-MAPK阻害剤BIRB796（10 mM）を（アクソンMedchem）またはDMSO（コントロール）でプレインキュベートした。 BIRB796（10 mM）を連続的に存在することでしばらく前に3時間TNFαは（100 ngの/ ml）の治療に1時間。相対的な付着は、ステップ4.8と同様にして算出した。データは平均±SDとして表す。グラフパッドプリズムt検定対を統計分析（n = 3）で（TNFα処理された対プラスBIRB796TNFα処理）のために使用した。 p値** <0.01; ***＆＃60;。0.001 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。

図4
図4のE-セレクチンは、好中球への付着を促進するTNFαの処理HMVECロン。HMVEC-肺をTNFαで処理した[100 ngの/ mlの] 3時間。 BSAは、（ステップ4.1）を3％含むRPMI1640でHMVEC-肺を洗浄した後、いずれかのヒツジIgG [50μgの/ mlの]（5-001-であり、R＆Dシステムズ）またはE-セレクチンポリクローナル抗体（PAB）[50mgの/溶液]は（AF724、R＆D Systems）を20分間、適切なウェルに添加した。 6×10 5好中球は、追加の20分間、ウェル毎に添加される前にHMVEC-肺単層を、次いで、もう一度RPMI-1640で洗浄した。（パーセント）と相対接着を決定するために計算が示されている。カルセイン発光はOD 520 nmで測定される。背景OD 520nmの平均TNFα治療および好中球が存在しない場合にHMVEC-肺に由来しています。（B）未処理またはTNFα処理HMVEC-肺単層にカルセイン標識好中球の相対的なパーセント順守のグラフィカル表現プレインキュベーション後のいずれかの制御とIgG抗体またはE-セレクチンブロッキングpAbの。データは平均±SDとして表す。グラフパッドプリズムt検定対を統計分析（n = 3）でために使用した。計算されたp値<0.001であった。（C）未処理およびTNFα処理HMVEC-肺単層コントロールIgGまたはE-セレクチンpAbのいずれかでプレインキュベートに結合したカルセイン標識好中球の画像。ウェルをPBSで洗浄する前に、6×10 5好中球を含む例では、（PRE洗浄）が示されている。透光顕微鏡画像、フルオレセインフィルターを用いて、基準の同じフィールドの蛍光画像が、右側の列に示されている設定され、左側の列に示されている。イメージはRetiga 2000Rカメラ（Qイメージング）を搭載オリンパスIX51倒立顕微鏡上で10倍の倍率で撮影された。 PREウォッシュ=合計好蛍光OD 520nmの （ステップ4.4）; POSTウォッシュ=接着性好中球蛍光OD 520nmの （ステップ4.7）; PMN -多核顆粒;平均-平均; IgG抗体-ヒツジIgGコントロール;E-sel/α-E-selectin - E-セレクチンpAbのを阻止する。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

成功した好中球/微小血管内皮細胞接着アッセイのための最も重要なステップは次のとおりである：1）低継数（<9）、健康な内皮細胞の使用は、低密度（ すなわち <5×10 6個の細胞で孤立した好中球を維持2） / ml）と分離の2時間以内にそれらを使用して、それぞれ、3）気難しいカルセインAMで標識された好中球の洗浄および好中球からのカルセインのECの汚染や損失を最小限に抑えるためにタイムリーにカルセインAMで標識された好中球の使用は、 。

我々は、よく表面積（48ウェルプレートのウェルあたりすなわち 60万好中球）の組織培養の1cm 2あたり8×10 5好中球を追加します。我々は60万好中球の入力は当社の分光光度計の直線範囲内にあることを見つけ、そして相対的な癒着が測定されたとき確実にデータを再生する。しかしながら、好中球結合が非常に似て減少が観察される40,000、200,000 1,000,000好中球をウェル当たり添加するのp38-MAPK阻害アッセイ（ 図3C）は 、600,000未満の好中球を用いることができることを示唆している。

プロトコルは、好中球自体は予め活性化や、もちろんあなたの特定のアッセイがそれを必要とする場合にオプションで任意の方法で扱われていないためだけ内皮活性化の程度を評価し、本明細書に記載。私たちは、TNFαの処理HMVEC-肺でE-セレクチンの発現は以前の観察27と一致し、このアッセイにおける好中球の取り付けのために重要であること。示す好中球の表面に存在glycomoleculesへE-セレクチンの静電結合は比較的弱いですが、流れの条件の下で、これらの相互作用は、好中球およびECの1,7-10の間に高親和性インテグリン媒介添付ファイルを誘発すると考えられている。したがって、このアッセイはARその炎症の初期段階のより示すことができる血管系からの好中球を捕捉するために必要な電子。それにもかかわらず、我々は、この報告書にTNFαを用いて得られた我々の結果は、この静的アッセイの結果は、生理学的に適切であり、このアッセイことを示唆していることを示す、フローモジュール（データは示さず）を用いて得られたものに、非常に類似し、そうでない場合と同一であったことを確認したフローシステムへのアクセス権を持っていない研究者にとって特に有用である。

検出フルオロフォアとしてカルセインを用いて説明アッセイの変動が、1993年28,29に記載した。重要なことに、これらの初期の報告は、カルセインは細胞生存率に影響を及ぼさなかったことがわかっおよびその他のフルオレセイン由来の色素29,30と比較して、接着アッセイにおける細胞機能に少なくとも影響を与えた。また、細胞数は、我々が（ 図3A）28守っているものと一致して、蛍光強度に対して線形であることが報告された。初期の報告でも強調している蛍光アッセイの主な利点は、彼らは、精製白血球31-33の（CRでまたは51 例えば 111）放射性標識を必要としないということです。放射標識された細胞上カルセインAM-標識された細胞が完全に以前に28,29,34議論されている使用することの利点と一貫性。私たちが使用していますがカルセイン当社アッセイにおける好中球、エステラーゼ基質で利用可能ないくつかの他の細胞透過性色素を標識するためにAM。例えば、ライフテクノロジーズは、エキサイトは/様々な波長で発光することCellTraceカルセイン赤橙色（C34852）、カルセインバイオレット（C34858）と​​カルセインブルー（C34853）を販売しています。異なる色素それぞれが自分の長所と短所を持っている。例えば、カルセイン赤橙色AM染料は、加水分解18の前にいくつかの本質的な蛍光性を持っています。

私たちは、細菌および内因性の要因（例えばTNFαのような）に対応して内皮の炎症性活性化を研究するために、このメソッドを使用し、目私たちは、適切なコントロールを使用してアッセイを行うために十分な量で拡大することができる死体、から収集HMVECsを使用し、十分な統計分析を実行するために複製します。多分、このアッセイはまた微小血管内皮への白血球の結合を伴う内皮系疾患過程を研究するためのツールと​​して使用することができる。患者からHMVECsを用いて研究されるかもしれない障害の例は、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、敗血症、炎症性腸疾患、血管炎、抗好中球細胞質自己抗体（ANCA）関連血管炎のような、脳血管奇形35-40を含む。例えば、HMVECsは、内皮に基づく疾患臓器の生検または外科的切除を受けたプロセス、およびそれらの結合を持つ患者とは異なる条件の下で評価した好中球への潜在的に血管炎や敗血症剖検でヒトから採取し、または可能性があります。しかしながら、このアッセイは、十分な必要がこうしてコンフルエントな単層を形成するためにHMVECsの量、とはHMVECsは、複数の継代後に拡大して使用されています。膨張このプロセスは、EC系疾患の患者からプライマリのECを用いた研究を設計する際に考慮される必要があるのECにおける表現型の変化につながる可能性がある。それにもかかわらず、このアッセイの多様性は、それが他の多くの付着および白血球細胞タイプに適合させることができる。実際には、このアッセイ、またはその変異体は、他の正常内皮細胞型、例えば、単球、THP-1、ジャーカット、HL-60およびU937 28,31,41のような初代細胞および細胞株で使用されている。このアッセイは、急速な実施が容易で、再現性が非常に敏感であることが証明され、したがって、炎症性メディエーターによって内皮細胞の活性化を検出するための非常に有用なツールであるいる。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

著者らは、開示することは何もありません。

Acknowledgments

この作品は、麻酔と周術期ケアのUCSF学科によってサポートされていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HMVEC-Lung Lonza CC-2527
EGM-2 MV Lonza CC-3202
HBSS Life Technologies 14175-095 Can be substituted with any vendor
48-well Tissue Culture Plates BD Falcon 353078
PBS (without phenol red) UCSF Cell Culture Facility CCFAL001 Can be substituted with any vendor
D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red) UCSF Cell Culture Facility CCFAL003 Can be substituted with any vendor
RPMI-1640 (without phenol red) Life Technologies 11835-030
Polymorphprep Axis-Shield 1114683
calcein AM Life Technologies C3099 (0.995 mM) stock soln
Trypan Blue Solution Sigma-Aldrich T8154
40 μM filters VWR 21008-949 Can be substituted with any vendor
FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer BMG LABTECH -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
  2. Collins, T., et al. Transcriptional regulation of endothelial cell adhesion molecules: NF-kappa B and cytokine-inducible enhancers. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 9, 899-909 (1995).
  3. Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
  4. Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
  5. Middleton, J., et al. Transcytosis and surface presentation of IL-8 by venular endothelial cells. Cell. 91, 385-395 (1997).
  6. Rot, A. Endothelial cell binding of NAP-1/IL-8: role in neutrophil emigration. Immunol. Today. 13, 291-294 (1992).
  7. Detmers, P. A., et al. Neutrophil-activating protein 1/interleukin 8 stimulates the binding activity of the leukocyte adhesion receptor CD11b/CD18 on human neutrophils. J. Exp. Med. 171, 1155-1162 (1990).
  8. Laudanna, C., Kim, J. Y., Constantin, G., Butcher, E. Rapid leukocyte integrin activation by chemokines. Immunol. Rev. 186, 37-46 (2002).
  9. Simon, S. I., Hu, Y., Vestweber, D., Smith, C. W. Neutrophil tethering on E-selectin activates beta 2 integrin binding to ICAM-1 through a mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway. J. Immunol. 164, 4348-4358 (2000).
  10. Zarbock, A., Ley, K. Mechanisms and consequences of neutrophil interaction with the endothelium. The American Journal of Pathology. 172, 1-7 (2008).
  11. Muller, W. A. Mechanisms of leukocyte transendothelial migration. Annu. Rev. Pathol. 6, 323-344 (2011).
  12. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
  13. Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. International Immunopharmacology. 10, 1325-1334 (2010).
  14. McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330, 362-366 (2010).
  15. Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
  16. Soehnlein, O., Lindbom, L., Weber, C. Mechanisms underlying neutrophil-mediated monocyte recruitment. Blood. 114, 4613-4623 (2009).
  17. Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Prakash, A., Xu, F., Hellman, J. Activation of endothelial TLR2 by bacterial lipoprotein upregulates proteins specific for the neutrophil response. Innate Immun. 18, 602-616 (2012).
  18. Haugland, R. P., Johnson, I. D., Basey, A. The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labelling Technologies. , 10, (2005).
  19. Shin, H. S., et al. Bacterial lipoprotein TLR2 agonists broadly modulate endothelial function and coagulation pathways in vitro and in vivo. J. Immunol. 186, 1119-1130 (2011).
  20. Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Lucero, J., Xu, F., Hellman, J. ERK5 protein promotes, whereas MEK1 protein differentially regulates, the Toll-like receptor 2 protein-dependent activation of human endothelial cells and monocytes. J. Biol. Chem. 287, 26478-26494 (2012).
  21. Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat. Rev. Immunol. 7, 803-815 (2007).
  22. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).
  23. Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol. Biol. 370, 23-36 (2007).
  24. Garcia-Garcia, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. A simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry. J. Vis. Exp. (74), e50410 (2013).
  25. Kuma, Y., et al. BIRB796 inhibits all p38 MAPK isoforms in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 280, 19472-19479 (2005).
  26. Westra, J., Kuldo, J. M., van Rijswijk, M. H., Molema, G., Limburg, P. C. Chemokine production and E-selectin expression in activated endothelial cells are inhibited by p38 MAPK (mitogen activated protein kinase) inhibitor RWJ 67657. International Immunopharmacology. 5, 1259-1269 (2005).
  27. Leeuwenberg, J. F., Jeunhomme, G. M., Buurman, W. A. Adhesion of polymorphonuclear cells to human endothelial cells. Adhesion-molecule-dependent, and Fc receptor-mediated adhesion-molecule-independent mechanisms. Clinical and Experimental Immunology. 81, 496-500 (1990).
  28. Akeson, A. L., Woods, C. W. A fluorometric assay for the quantitation of cell adherence to endothelial cells. Journal of Immunological Methods. 163, 181-185 (1993).
  29. Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion. Journal of Immunological Methods. 159, 93-100 (1993).
  30. De Clerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leucocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. Journal of Immunological Methods. 172, 115-124 (1994).
  31. Bevilacqua, M. P., Pober, J. S., Wheeler, M. E., Cotran, R. S., Gimbrone, M. A. Interleukin 1 acts on cultured human vascular endothelium to increase the adhesion of polymorphonuclear leukocytes, monocytes, and related leukocyte cell lines. The Journal of Clinical Investigation. 76, (1985).
  32. Schleimer, R. P., Rutledge, B. K. Cultured human vascular endothelial cells acquire adhesiveness for neutrophils after stimulation with interleukin 1, endotoxin, and tumor-promoting phorbol diesters. J. Immunol. 136, 649-654 (1986).
  33. Gamble, J. R., Harlan, J. M., Klebanoff, S. J., Vadas, M. A. Stimulation of the adherence of neutrophils to umbilical vein endothelium by human recombinant tumor necrosis factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8667-8671 (1985).
  34. Braut-Boucher, F., et al. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178, 41-51 (1995).
  35. Ait-Oufella, H., Maury, E., Lehoux, S., Guidet, B., Offenstadt, G. The endothelium: physiological functions and role in microcirculatory failure during severe sepsis. Intensive Care Medicine. 36, 1286-1298 (2010).
  36. Andonegui, G., et al. Endothelium-derived Toll-like receptor-4 is the key molecule in LPS-induced neutrophil sequestration into lungs. The Journal of Clinical Investigation. 111, 1011-1020 (2003).
  37. Sharma, J., et al. Lung endothelial cell platelet-activating factor production and inflammatory cell adherence are increased in response to cigarette smoke component exposure. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302, L47-L55 (2012).
  38. Deban, L., Correale, C., Vetrano, S., Malesci, A., Danese, S. Multiple pathogenic roles of microvasculature in inflammatory bowel disease: a Jack of all trades. The American Journal of Pathology. 172, 1457-1466 (2008).
  39. Gross, W. L., Trabandt, A., Csernok, E. Pathogenesis of Wegener's granulomatosis. Annales de Medecine Interne. 149, 280-286 (1998).
  40. Chen, Y., et al. Evidence of inflammatory cell involvement in brain arteriovenous malformations. Neurosurgery. 62, 1340-1349 (2008).
  41. Martens, C. L., et al. Peptides which bind to E-selectin and block neutrophil adhesion. J. Biol. Chem. 270, 21129-21136 (1995).

Tags

免疫学、発行78、細胞生物学、感染症、分子生物学、医学、医用生体工学、生物物理学、内皮、血管、好中球、炎症、炎症メディエーター、好中球、白血球の接着、内皮細胞は、検定
定量的な<em&gt;インビトロ</em静的な条件の下で活性化された初代ヒト微小血管内皮細胞への好中球の接着を測定するために&gt;アッセイ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wilhelmsen, K., Farrar, K., Hellman, … More

Wilhelmsen, K., Farrar, K., Hellman, J. Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions. J. Vis. Exp. (78), e50677, doi:10.3791/50677 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter