Summary
감염의 사이트에서 활성화 된 내피 세포에 백혈구 준수는 호스트의 염증 반응의 중요한 구성 요소입니다. 수 있습니다 호중구 결합 분석은이 보고서에 설명
Abstract
혈관 내피 세포는 염증 반응에 중요한 역할을한다. 염증의 급성 단계 동안, 내피 세포 (내피)는 호스트 매개로 직접 보존 미생물 구성 요소 또는 호스트 파생 위험 분자에 의해 활성화됩니다. 활성화 된 내피 표현 사이토 카인, 케모카인 동원과 접착 분자는, 감염이나 부상의 사이트에서 백혈구를 활성화하고 유지합니다. 호중구 도착하는 최초의 백혈구이며, 두 세포의 표면에 존재하는 접착 분자의 다양한 통해 내피을 준수합니다. 호중구의 주요 기능은 직접 미생물의 위협을 제거하는 추가 요인의 출시를 통해 다른 백혈구의 채용을 촉진하고, 상처 복구를 시작하는 것입니다. 따라서 내피 세포에 자신의 모집 및 첨부 염증 반응의 개시에 중요한 단계입니다. 이 보고서에서, 우리는 사용하는 체외 호중구 접착 분석에 대해 설명합니다calcein 정적 조건에서 미세 혈관 내피 세포의 활성화 정도를 정량하는 인간의 기본 호중구 AM-레이블. 이 방법은 형광 분광 광도계로 정량 동일한 샘플을 직접 호중구 바인딩보다 질적 평가를 위해 형광 현미경을 사용하여 시각화 할 수있는 추가적인 장점이 있습니다.
Introduction
혈관 내피 세포는 혈액 순환과 직접 접촉에 있기 때문에, 그것은 유일하게 감염이나 부상시 신속한 염증 반응을 시작할 수 있습니다. 내피 세포 (내피) 보존 세균의 구성 요소와 위험 분자의 다양성을 인식하고 표현 패턴 인식 수용체, 그리고 TNFα와 같은 호스트에 염증 매개체에 대한 수용체. 이들 수용체의 활성화는 내피는 사이토 카인 (예를 들어, IL-6, IL-8, CXCL1 및 CCL2) 분비하고, 그들의 세포 표면 1에서 부착 분자 (예를 들어, E / P-셀렉틴, VCAM-1, ICAM-1)를 상향 조절을 유도 2. 이 분자는 모든 전염성 에이전트의 호스트를 삭제하고 조직 수선에게 3,4을 시작하기 위해 감염과 부상의 사이트에 백혈구의 국산화를 촉진한다. 감염 호중구 반응은 혈관 내피 세포와 응답 사이의 잘 조율 된 상호 작용을 포함 호중구. EC의 활성화에 따라, IL-8 분비 감염이나 부상 5,6의 사이트에 집으로 호중구 수있는 내피 세포에서 혈관 그라데이션을 형성하고 있습니다. E / P-셀렉틴를 중재 호중구 캡처 및 호중구 세포 표면에 glycomolecules 상대적으로 약한 연결을 통해 압 연입니다. 이러한 상호 작용은 그 동족 수용체 IL-8 바인딩과 함께, 강력한, 인테-매개 부착과 내피 세포 표면 7-10 호중구 결국 체포를 용이하게합니다. 체포 후 호중구가 직접 병원균을 제거 병원균의 확산을 방지하기 위해 호중구 세포 트랩을 생성, 상처 치유를 촉진하고 단핵구, 대 식세포 및 수지상 등의 백혈구를 모집하는 추가 요인을 풀어 감염의 특정 사이트에 혈관 밖으로 마이그레이션 할 수 있습니다 세포 11-17.
microv에 호중구 부착을 정량 할 수있는 체외 방법은이 보고서에 설명ascular는 TNFα 호스트 염증 매개체에 의해 활성화 된 후 ECS. 이 분석은 내피의 활성화, 그리고 호중구을 평가하기 위해 설계되었습니다. 인간의 기본 호중구 먼저 밀도 기울기 분리를 사용하여 격리하고, 다음 calcein 아세 톡시 (AM)로 표시되어 있습니다. 살아있는 세포 가수 분해 calcein에서 에스 테라 제는 492-495 nm의 513-516 nm의 18의 배출 여기에 높은 형광 calcein 분자 오전. 찬란 - 라벨 호중구는 다음 EC 단층으로 배양되고, 비 부착 호중구는 이후에 제거됩니다. 나머지 바운드 호중구의 형광 그 형광 분광 광도계를 사용하여 측정하고, 잘 당 총 호중구 형광 입력의 비율로 계산됩니다. 이 방법은 분광 광도계에 사용되는 바인딩 calcein - 라벨 호중구가 직접 EC의 AC 읽어 더 많은 정성을 제공하는 형광 현미경을 사용하여 시각화 할 수있는 추가적인 장점이 있습니다tivation. 이 분석은 정적 인 조건에서 수행되기 때문에, 호중구 부착 폭포에서 발생 만 매우 초기 이벤트가 부과됩니다. 이 TNFα 처리 인간의 폐 혈관 EC (HMVEC 폐)에 해당 호중구 준수 E-셀렉틴과의 상호 작용이 중단 될 때 단일 층이 대폭 감소를 표시하는 E-셀렉틴 차단 항체를 사용하여이 보고서에서 확인됩니다.
TNFα에 더하여, 우리는 성공적으로 수신자 같은 수용체 1 / 2 작용제 펩티도 글리 칸과 연관된 지단백 (PAL), murein 지방 단백질 (MLP)와 Pam3Cys에 의해 인간 제대 정맥 EC (HUVEC) 활성화의 범위를 결정하기 위해이 분석을 사용했습니다 Pam3Cys 19,20으로 HMVEC 폐 활성화. 또한, 우리는 성공적으로이 방법론의 다양한 호환되는 제안, 키나제 억제제와 HMVEC 폐의 표면과 세포질 단백질의 RNAi를 매개 최저 한 후이 분석을 사용 생화학 screeninG의 분석 20. 요약하면,이 분석은 체외에서 염증 매개 물질에 의해 EC 활성화의 범위를 액세스 할 재현성, 더 많은 기능을 방법을 사용하기 쉽게 제공합니다.
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Protocol
1. 도금 및 미세 혈관 내피 세포의 유지 보수
- 해동 및 제조 업체에 따라 혈관 내피 세포 성장 지침을 제공. 이 프로토콜에서는, 세포는 EGM-2 MV 미디어 (론자)에서 재배되었고, 그것은 모든 실험은 통과 번호로 인한 변형을 최소화하기 위해 해동 후 2 주 내에서 수행하는 것이 좋습니다. HMVEC 폐를 가진 우리의 실험은 9-4 구절 사이에 수행됩니다.
- 1 일 : 세포가 80 % ~ 90 % confluency에 도달하면 trypsinize 및 ML 당 120,000 세포에 resuspend을. 48도, 폴리스티렌 조직 배양 플레이트 (들)에 플레이트 잘 당 36,000 세포 (0.3 mL를). 배경 형광 판독 값을 얻기 위해 백혈구와 함께 배양되지 않습니다 HMVEC의 우물이 (가) 있습니다. 특히 형광 분석, 교대 행 또는 열을 위해 디자인 된 48 - 웰 플레이트를 사용하지 않는 이웃 우물에서 어떤 빛 오염을 최소화 할 수 있습니다. 참고 : 웰스 폴리 라이시로 사전 코팅 할 수 있습니다NE, 콜라겐이나 fibronectin의.
- 주 2 : 신선한 매체를 추가합니다.
- 3 일 : 위상차 현미경으로 세포가 (즉, "조약돌"외관과 작은 세포 파편) 건강한 확인하고, 그들은 100 % 합류 (그림 1)입니다. 세포가 100 % 합류하지 않은 경우 그들은 준비가 될 때까지 매일 미디어를 변경합니다.
- HMVEC 단층 치료 준비가되면, 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 한 번 세포를 세척하고 적절한 우물에 염증 작용제를 포함하는 신선한 EGM-2 MV 미디어 또는 미디어 0.3 ML를 추가합니다. 이 프로토콜에 HMVEC 폐는 TNFα 처리 하였다 3 시간 동안 [100 NG / ML] (PeproTech, 뉴저지)이 EC에 21 잘 설명 활성제이기 때문에. 주 : 당신의 활성화 HMVEC 세포 (단계 4.1)와 calcein 레이블이 호중구 (단계 3.5) 오전 그래서 당신은 시간 실험을하는 것은 동시에 사용할 준비가 권장됩니다. 그것은 neutroph를 분리하고 라벨을 우리에게 약 2.5 시간 소요ILS.
2. Polymorphprep를 사용하여 호중구의 분리
- 이전 22 설명 된 호중구를 분리, 또는 전체 혈액에서 다형 과립구를 분리하는 기성품 밀도 기울기 솔루션. Nuzzi, 외 의해 프로토콜에 따라 Polymorphprep을 채용. 전체 혈액의 23 ML 당 약 2-3 X 10 6 호중구의 생산량 2007 결과. 참고 : 적혈구를 제거하기 위해 과도한 적혈구 용해, 덱스 트란 침강을 방지하려면이 밀도 기울기 원심 분리 24 이전에 수행 할 수 있습니다.
- RT에 Polymorphprep 밀도 기울기 솔루션을 가지고.
- 의 면전에서 건강한 인간 자원에서 전체 혈액의 30 ML를 수집 헤파린, 구연산 또는 EDTA로 항 응고. 혈액은 2 시간 이내에 사용하고, 18-22 ° C. 사이에서 유지되어야한다
- 15 ML 원뿔 튜브의 밀도 기울기 용액 (5 ㎖를 통해 전체 혈액의 5 층 ML
- 18-22시 30 분 450 XG에 원심 분리기 ° C. 천천히 속도를 아래로 원심 분리기 (즉, 원심 브레이크를 해제) 및 호중구의 활성화를 줄이고 레이어의 혼합을 방지하기 위해 진동을 방지하기 위해 잘 튜브의 균형을해야합니다. 이상 원심 분리 시간 이상 원심력 펠렛 적혈구쪽으로 더 아래로 마이그레이션하는 호중구를 포함하는 낮은 백혈구 층에서 발생합니다.
- 호중구 (그림 2B)를 포함하는 레이어의 오염을 방지하기 위해 말초 혈액을 포함하는 플라즈마 상 백혈구 밴드를 대기음.
- 호중구를 포함하는 낮은 백혈구 층을 제거하는 1-2 ML 혈청 피펫을 사용합니다. PBS의 30 ML에 호중구 층을 결합 50ml에 (칼슘없이 + 및 마그네슘 2 +)원뿔 튜브.
- PBS 50 ML (칼슘없이 + 및 마그네슘 2 +) 18-22시 10 분 450 XG에 원심 분리기 ° C.에 볼륨을 가지고
참고 : 단계 2.9 및 2.10은 선택 사항이지만 매우 좋습니다.
- 뜨는을 대기음. 적혈구를 용해하기 위해 30 초 동안 멸균 물 8 ㎖에 호중구를 resuspend을 즉시 배 PBS 2 ML (칼슘없이 + 및 마그네슘 2 +) 부드럽게 손으로 혼합이.에서 세포를 배양하지 마십시오에 세포 현탁액을 추가 이상 30 초 동안 물 상당한 호중구 죽음이 발생할 수 있기 때문이다.
- 18-22에서 5 분 250 XG에 원심 분리기 ° C.
- PBS의 10 ML (칼슘없이 + 및 마그네슘 2 +)과 18-22에서 5 분 250 XG에서 다시 원심 분리기 ° C. 한 번 세포를 씻으
- RPMI-1640 10 ㎖에 호중구를 resuspend을 (페놀 레드없이) 트리 판 블루를 사용하여 살아있는 세포를 계산E 염색 제외 방법. 이 호중구의 활성화가 발생할 수 있으므로 ML 당 5 × 10 6보다 큰 세포 밀도의 연장 기간을 피하십시오.
3. Calcein AM와 호중구 레이블
- 6 × 10 5 호중구는 48 - 웰 플레이트 잘 당 사용됩니다.
- 계산 후, 50 ML 원뿔 튜브에 재 부유 세포를 전송하고 2-4 페놀 레드 무료 RPMI-1640 ML 당 X 10 6 세포 호중구를 희석.
- calcein 3 μM (calcein AM 품절 즉, 2.98 μL (1 MG / ML) 당 ML 미디어)의 주식 솔루션 AM 추가하고 부드럽게 튜브를 가볍게 치면 잘 섞는다. 이상 5 μM는 calcein 호중구에서 누수가 발생합니다 오전. 주 : 비 형광 calcein AM이 높은 형광 분자 calcein (즉, 죽은 세포가 형광을하지 않을 것이다) 생산 내생 에스 테라 제에 의해 세포 내에서 쪼개 있습니다.
- 알루미늄 호일로 튜브를 커버와 f를 품다또는 37 30 분 ° 어둠 주에 C :. 긴 배양 시간은 접착 분석의 과정을 통해 호중구에서 해방되고 더 calcein이 발생할 수 있습니다.
- 18-22 ° C에서 5 분 450 XG에 원심 분리기 및 RPMI-1640 10 ㎖ (페놀 레드 않고, 37 미리 예열 ° C)의 2 배 호중구을 씻는다. 40 μM 살균 필터가 18-22에서 덩어리를 제거하고 5 분 450 XG에 한 번 더 원심 분리 할 수 있지만 두 번째 세척에 대한 세포를 현탁 한 후, 최초의 호중구를 통과 ° C.
- ML 당 2 × 10 6 호중구에서. (37 ° C로 예열없이 페놀 레드) RPMI 1640 호중구를 resuspend을
4. 호중구 바인딩 분석
- 필터 소독 (0.22 μm의) RPMI 1640 0.5 ML (페놀 레드없이) 잘 당 3 % BSA를 포함하는와 배 HMVEC 단일 층을 씻으십시오.
- 미디어를 대기음 6 × 10 5 calcein - 라벨 호중구 (셀 suspensio의 0.3 ML를 추가. 48 - 웰 플레이트주의의 적절한 우물에 호중구가없는 RPMI 1640 N), 0.3 ML은 (페놀 레드없이) : 이것은 cm 2 당 8 × 10 5 호중구에 해당합니다.
- 37 ° C에서 20 분, 5 % CO 2 배양기에 대해 품어.
- 총 호중구 형광 (PRE 세척) : 485 ㎚의 여기 파장과 FLUOstar, 또는 이와 동등한 분광 광도계 520 nm의 (형광 필터 세트)의 발광 파장 각 우물의 형광 강도를 측정한다. . 직전에 배양 엔드 포인트에 참고이 단계를 수행하십시오 :이 프로토콜에서는, calcein의 여기 및 방출되는 빛의 검출이 밝혀 우물의 상단에서 수행되었다, 그러나 모두는 우물의 바닥에서 수행 할 수 있습니다.
- PBS의 잘 당 0.5 mL로 배 HMVEC 단층 및 호중구가 포함 된 우물 세척 (W / CA 2 + 및 마그네슘 2 +). 미디어 및 세척을 제거반전 플레이트 및 종이 타월로 가볍게 두드려하면 남아있는 액체를 제거합니다.
- 다시 잘 당 RPMI 1640 0.3 mL를 (페놀 레드없이)을 추가합니다.
- 자기편 호중구 형광 (POST 세척) 단계 4.4에서뿐만 아니라 각각의 형광 강도를 측정한다.
- 퍼센트 준수하고 잘 당 기준 준수를 확인합니다 :
참고 :이 단계에서, calcein - 라벨 호중구의 이미지가 표준 형광 필터 장착 된 형광 현미경 능력을 사용하여 얻을 수 있습니다. 그림 4의 이미지는 Pro7 소프트웨어 (Q 이미징) Q는 캡처를 사용 Retiga 2000R 카메라 (Q 영상)를 탑재 올림푸스 IX51 도립 현미경 하였다.
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Representative Results
호중구 바인딩 분석을 사용하여 신뢰성, 재현성 결과를 얻기 위해서는 그림 1 HMVEC 폐에 그림과 같이 건강과 미세 혈관 내피 세포의 confluency에이 분석의 날에 최적이다하는 것이 필수적이다. 또한, 낮은 통로 번호 혈관 내피는 (이하 9 구절 즉,)를 사용하는 것이 필수적이며, 따라서, 우리는 해동 2 주 이내에 모든 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 호중구의 건강은 세포가 어떤 방식으로 구성하는 경우 calcein AM은 형광 calcein 분자에 대사되지 않습니다 특히 이후, 또한 가장 중요합니다. 우리는 판 블루 배제 방식을 사용하며, 세포의 상당 부분 (즉, 스테인드) 죽은 경우 분석을 진행하지 않습니다.
이 밀도 기울기 및 항원 기반의 열 분리 방법 등 호중구를 분리하는 방법은 여러 가지가 있으며, 모든이이 절차에 충분합니다. 우리는 축 쉴드에서 Polymorphprep 기성품 밀도 기울기 솔루션을 사용하기로 결정했습니다. 그림 2에서 볼 수 있듯이 호중구는 원심 분리 한 후 하위 계층 내에있는 동안 말초 혈액은, 상위 계층에 존재한다. PBMC 층들은 제거시 과립구의 오염을 방지하기 위해 흡입됩니다. 그것은 물이 남아있는 적혈구를 용해하기 위해 추가되는 단계 2.9, 선택적주의하는 것이 중요합니다. 이 모든 오염 적혈구를 제거하는 이상적입니다 반면 그러나, 그것은 호중구 상당한 사망이 발생할 수있는 후 30 초 이상 순수한 물에 앉아하지 않는 것이 중요합니다.
마지막으로, 호중구는 calcein 사전 예열 (37 ° C) RPMI 1640 미디어 (페놀 레드없이)에서 세척 및 현탁 30 분을 위해 오전과 배양한다. 그것은 형광 독서를 방해 할 수 있습니다 페놀 레드없이 매체를 사용하는 것이 중요합니다. neutr의 수ophils가 우물에 추가하면 형광 판독 사전 및 사후 세척 분광 광도계의 선형 범위 내에있는 것을 제공하지 않고 임의이며, 어느 호중구 부착을 촉진하거나 방지 치료의 차이는 (아래 참조) 재현성 확인 될 수 있습니다. 우리는 10,000 1,000,000 표시 호중구는 (그림 3A) 분석 할 때 형광 OD 가진 520nm의 선형 범위 내에 있는지 찾을 수 있습니다. 흥미롭게도, 우리는 또한 더 많은 호중구는 TNFa 치료 HMVEC 폐 단층에 추가되는 백분율의 준수가 증가한다는 것을 발견 [100 NG / ML] 3 시간 (그림 3B)합니다. 우리가 접착의 비율이 현저하게이 시점 (데이터 표시되지 않음) 이후 증가하지 않는 것을 발견 이후 우리는 20 분 동안 함께 HMVEC - 폐 calcein - 라벨 호중구을 배양하기로 결정했습니다. 참고로,이 분석에서 우리는 표준, 분명 폴리스티렌 48 - 웰 플레이트를 사용 발견 t 사이의 형광 크로스 오버 독서의 수준그 우물은 전체 형광 입력 (데이터 표시되지 않음)의 0.5 % 이상에 상당하지 않았다. 그럼에도 불구하고 가능하다면, 우리는 더 민감한 실험에 형광 분광 광도계 판독 의도적으로 만들어진 48 - 웰 플레이트를 사용하는 것이 좋습니다, 또는 적어도 실험을 설계하면 (단계 1.2 참조) 크로스 오버 판독 값을 최소화 할 수 있습니다.
우물에 추가 호중구의 수가 너무 오래 추가 번호 분광 광도계의 선형 범위 내이기 때문에 다소 임의 입증하기 위해, 우리는 P38의 부재 또는 존재 TNFα 처리 HMVEC 폐와 호중구 접착 분석을 수행 호중구의 다양한 입력 양 (예 : 40,000 / 음, 200,000 /도 또는 1,000,000 /도) 25를 사용하여-MAPK 억제제 BIRB7906. P38-MAPK는 이전에 TNFα 처리 인간 내피에서 E-selectin의 발현에 필요한 것으로 표시되었습니다, 그 억제 따라서 TNFα 활성화 HMVEC 폐에 호중구 바인딩을 감소시켜야한다26. 사실, 이것은 우리가 (그림 3C) 관찰하는 것입니다. 우리는 호중구가 추가 될 %의 부착이 증가하고 비율의 준수와 같은 간 기증자의 변화, 합류 호중구의 품질과 HMVEC의 밀도, 상대적으로 준수 등 다양한 요인으로 인해 실험 사이에 다를 수 있습니다 찾을 수 있지만, 조건 사이의 관계 (그림 3C와 데이터가 표시되지 않음) 추가 호중구의 수와 각각의 독립된 실험에서 비교적 일정하게 유지됩니다. 그것은 간 실험의 일관성 긍정적 인 컨트롤을 기준으로 접착 데이터를 표시하는 것이 좋습니다 왜 이러한 데이터는 예시.
완전히이 분석의 작동 방법을 설명하기 위해, 우리는 함께 호중구 접착 분석을 수행 TNFα 처리 HMVEC 폐 미리 배양 제어 항체 또는 E-셀렉틴 차단 항체 하나와 함께. E-셀렉틴은 TNFa와 캡처 neutr 치료 후 EC 표면에 표현된다glycomolecules와 정전기 상호 작용을 통해 혈관에서 ophils는 호중구 표면 1.27에 제시한다. 같은 그림 4B에 시각적으로 그림 4C에서 그래픽, 그림 4A에 숫자로 나타나, TNFα 처리 HMVEC - 폐는 TNFα 처리 HMVEC 폐 미리 배양보다 ~ 75 % 이하 호중구 바인딩 E-selectin과 항체를 미리 배양 제어 IgG를 가진. 이 E-셀렉틴은 우리의 고정 접착 분석에 HMVEC 폐에 호중구 테 더링에 중요한 역할을 제안합니다.
그림 1. 건강, 합류 HMVEC 폐 단층의 예. "조약돌"외관과 단층의 confluency에 총을합니다. 이미지는 피셔 과학 MICROMASTER 반전 된 디지털 현미경 4X와 10X 배율에서 촬영했다. 
그림 2. 전체 혈액과 Polymorphprep 원심 분리하기 전에 계층 (A)와 (B) 원심 분리 후 분리. 참고 다형 과립구가 (호중구) 별개의 낮은 밴드를 형성하면서 원심 분리 한 후, 말초 혈액은 별개의 상단 밴드를 형성합니다.
그림 3. 호중구 수와 형광 OD 가진 520nm 사이의 관계는 선형이며, 더 많은 호중구와 같은 TNFα 처리 HMVEC 폐 증가에 호중구의 백분율 부착이 추가됩니다 P38-MAPK는 TNFα 활성화 HMVEC 폐 단층에 호중구 부착을 촉진 (A) 그래프입니다. 리네아을 묘사두 자릿수 이상 형광 OD 가진 520nm와 호중구의 숫자 사이에 R을 관계. 0.996의 R2 값은 10,000 1,000,000 호중구가 분석 호중구 수와 형광 OD 가진 520nm 사이의 선형 관계를 나타냅니다. calcein - 라벨 호중구의 다양한 번호가 추가 된 퍼센트 준수의 (B) 그래픽 표현 치료 또는 TNFα 처리 ( 100 NG / ML;. 48 잘 접시에 3 시간) HMVEC 폐 단층 (C) HMVEC 폐 단층을위한 P38-MAPK 억제제 BIRB796 (10 MM) (축삭 Medchem) 또는 DMSO (제어)로 사전 배양 TNFa하기 전에 1 시간 (100 NG / ML) 3 시간에 대한 치료 BIRB796 (10 MM)의 지속적인 존재에있는 동안. 상대 준수는 단계 4.8로 계산되었다. 데이터는 평균 ± SD로 표현됩니다. GraphPad 프리즘 t-test를 짝은 통계 분석 (N = 3) (TNFα 처리 대 플러스 BIRB796 TNFα 처리)에 사용되었다. P 값 (P-value) ** <0.01 *** &# 60;. 0.001 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 4. E-셀렉틴은에 호중구의 부착을 촉진 TNFa 처리 된 HMVEC 폐. HMVEC - 폐는 TNFα 처리 하였다 [100 NG / ML] 3 시간 동안. 3 % BSA (단계 4.1), 하나 양 IgG의 [50 ㎍ / ㎖] 포함 된 RPMI 1640 HMVEC 폐를 세척 한 후 (5-001-A; R & D 시스템) 또는 E-selectin의 클론 항체 (PAB)으로 [50 ㎎ / ML]는 (AF724, R & D 시스템)는 20 분에 해당하는 우물에 추가되었습니다. 6 × 10 5 호중구가 추가 20 분마다 잘 추가되기 전에 HMVEC 폐 단층 그런 다음 한 번 더 RPMI 1640으로 세척 하였다. (A) %와 상대적 준수를 결정하는 계산이 표시됩니다. Calcein발광은 OD 520 nm에서 측정한다. 배경 OD 가진 520nm 평균은 TNFα 처리 및 호중구의 부재 HMVEC 폐에서 파생됩니다. (B) 치료 또는 TNFα 처리 HMVEC 폐 단층에 calcein - 라벨 호중구의 상대 퍼센트 준수의 그래픽 표현을 사전 배양 한 후 두 제어 IgG의 또는 E-셀렉틴은 PAB를 차단. 데이터는 평균 ± SD로 표현됩니다. GraphPad 프리즘 t-test를 짝은 통계 분석 (n은 = 3)를 위해 사용되었다. 계산 된 P-값 <0.001이었다. (C) 치료 및 TNFα 처리 HMVEC 폐 단층 제어 IgG의 또는 E-셀렉틴 PAB 하나와 미리 배양에 바인딩 calcein - 라벨 호중구의 이미지. 잘 PBS로 세척하기 전에 6 × 10 5 호중구를 포함하는 예 (PRE 세척) 표시됩니다. 참조의 동일한 필드의 형광 이미지, 형광 필터를 사용하는 동안 반투명 가벼운 현미경 이미지는 오른쪽 열에 표시됩니다설정 왼쪽 열에 표시됩니다. 이미지는 Retiga 2000R 카메라 (Q 영상)를 탑재 올림푸스 IX51 거꾸로 현미경에 10X 배율에서 촬영했다. PRE 세척 = 총 호중구 형광 OD 가진 520nm (단계 4.4) POST 세척 = 부착 호중구 형광 OD 가진 520nm (단계 4.7) PMN - 다형 과립구, 평균 - 평균, IgG의 - 양 IgG의 통제; E-sel/α-E-selectin - E-셀렉틴 PAB를 차단. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
성공적으로 호중구 / 미세 혈관 내피 세포 접착 분석을위한 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 : 1) 낮은 통로 번호 (<10), 건강한 내피 세포의 사용, 낮은 밀도 (즉, <5 × 10 6 세포에서 분리 된 호중구를 유지 2) / ㎖) 및 분리 2 시간 이내에 그들을 사용하여, 각각 3) 까다로운 calcein AM-라벨 호중구의 세척 및 호중구에서 calcein의 EC 오염과 손실을 최소화하기 위해 적시에 calcein AM-라벨 호중구의 사용, .
우리는 조직 문화의 cm 2 당 8 × 10 5 호중구 잘 표면적 (즉, 60 호중구 잘 당 48 - 웰 플레이트)를 추가합니다. 우리는 60 호중구의 입력은 우리 분광 광도계의 선형 범위 내에 있는지 발견하고 상대 adherences 측정시 안정적으로 데이터를 재생합니다. 단, 호중구 바인딩 매우 유사한 감소에 관찰40,000 200,000 1,000,000 호중구가 잘 따라 추가 P38-MAPK 억제 분석 (그림 3C)는, 이하 600,000 호중구을 사용할 수있는 제안.
프로토콜은 여기에 설명 만 스스로가 미리 활성화되거나 물론 특정 분석에 필요한 경우 옵션을 어떤 방식으로 처리되지 않은 호중구 때문에 내피 세포의 활성화 정도를 평가한다. 우리는 HMVEC 폐 이전 관측 27와 일치,이 분석에서 호중구의 부착을 위해 중요하다에 E-셀렉틴의 발현이 TNFa 처리 된 것을 보여줍니다. 호중구 표면에 존재 glycomolecules에 E-셀렉틴의 정전 결합은 상대적으로 약한 있지만, 유동 조건 하에서, 이러한 상호 작용은 호중구와 내피 1,7-10 사이의 높은 친화력 인테-매개 부착을 유도하는 것으로 생각된다. 따라서이 분석은 염증의 초기 단계에 더 많은 지표가 될 수 있다는 AR혈관에서 백혈구를 캡처하는 데 필요한 전자. 그럼에도 불구하고, 우리는 생리학 관련이 보고서에서 TNFα 얻은 우리의 결과가이 정적 분석의 결과를 나타내는 흐름 모듈 (데이터 표시되지 않음)하여 얻은 것과 매우 유사하지 않을 경우 동일 함을 검증하고 제시 한이 분석 흐름 시스템에 액세스 할 수없는 연구에 특히 유용합니다.
검출 형광으로 calcein을 사용하여 기술 분석의 변화는, 1993 년 28,29에서 설명 하였다. 중요한 것은, 이러한 초기 보고서는 calcein이 세포 생존에 영향을 미치지 않는다는 것을 발견하고 다른 형광 파생 염료 29,30에 비해 접착 분석에서 세포의 기능에 가장 영향을 미쳤다. 또한 세포 수는 우리가 (그림 3A) 28 관찰 한 것과 일치, 형광 강도에 대하여 선형 것으로보고되었다. 초기 보고서는 강조 표시하는형광 분석의 주요 장점은 정제 된 백혈구 31-33의 (CR에 51 개 등 111) 방사선 물질이 필요하지 않은 것입니다. 방사성 동위 원소 세포에 calcein AM-라벨 세포를 사용의 장점과 일관성을 철저히 이전 28,29,34 논의되었다. 우리가 사용하지만 calcein 우리의 분석에서 호중구, 에스테르 가수 분해 효소 기질 사용할 수있는 여러 가지 다른 세포 투과 염료 레이블을하십시오. 예를 들어, 생명 기술 CellTrace calcein 레드 오렌지 (C34852), calcein 바이올렛 (C34858)와 흥분이 / 다양한 파장에서 방출하는 calcein 블루 (C34853)를 판매하고있다. 다른 염료는 각각 자신의 장점과 단점이 있습니다. 예를 들어, calcein 레드 오렌지 AM 염료 가수 18 이전에 몇 가지 고유의 형광을 가지고 있습니다.
우리는 세균과 내생 적 요인 (예 : TNFa 등)에 대한 응답으로 내피 세포의 염증 활성을 연구하기 위해이 방법을 사용하고 일우리는 적절한 컨트롤을 사용하여 분석을 수행하기에 충분한 양으로 확장 할 수있는 시체에서 수집 HMVECs을 사용하고 충분한 통계 분석을 수행하기 위해 복제합니다. 상상 컨대,이 분석은 또한 혈관 내피 세포에 백혈구 바인딩을 포함 내피 세포 기반의 질병 과정을 연구하는 도구로 사용할 수 있습니다. 환자 HMVECs을 사용하여 연구 할 수있는 질환의 예는 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 패혈증, 염증성 장 질환, 혈관염, 같은 항 호중구 세포질 항체 (ANCA) 관련 혈관염으로, 뇌 혈관 기형 35-40를 포함 . 예를 들어, HMVECs은 혈관염이나 패혈증 사후, 또는 잠재적 인 조직 검사 나 수술 기관의 절제, 다른 조건에서 평가 호중구에 그들의 바인딩을받은 내피 기반의 질병 프로세스와 환자와 인간에서 수집 할 수 있습니다. 그러나,이 분석은 충분해야합니다합류 단일 층을 형성하는 HMVECs, 따라서 HMVECs의 양을 확장하고 여러 구절 이후에 사용됩니다. 확장이 과정은 EC 기반의 질병을 가진 환자에서 일차 내피를 사용하여 연구를 설계에 고려 될 필요가 EC에있는 표현형의 변화로 이어질 수 있습니다. 그럼에도 불구하고,이 분석의 다양성은 많은 다른 부착과 백혈구 세포 유형에 적용 할 수 있습니다. 사실,이 분석, 또는 그것의 변형, 성공적으로 다른 내피 세포 유형과 사용, 그리고 단핵구, THP-1 인 Jurkat, HL-60 U937 28,31,41 등의 기본 세포와 세포 라인.되었습니다 이 분석은 신속하고 수행하기 쉽고 재현성이 매우 중요한 것으로 입증, 따라서 염증 매개체에 의해 내피 세포의 활성화를 감지하는 매우 유용한 도구입니다했다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
이 작품은 마취와 수술 전후 관리의 UCSF 부에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HMVEC-Lung | Lonza | CC-2527 | |
| EGM-2 MV | Lonza | CC-3202 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175-095 | Can be substituted with any vendor |
| 48-well Tissue Culture Plates | BD Falcon | 353078 | |
| PBS (without phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL001 | Can be substituted with any vendor |
| D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | Can be substituted with any vendor |
| RPMI-1640 (without phenol red) | Life Technologies | 11835-030 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield | 1114683 | |
| calcein AM | Life Technologies | C3099 | (0.995 mM) stock soln |
| Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 40 μM filters | VWR | 21008-949 | Can be substituted with any vendor |
| FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer | BMG LABTECH | - |
References
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