Summary
Нейтрофилов соблюдение активированного эндотелия в местах инфекции является неотъемлемым компонентом воспалительного ответа хозяина. Описанных в настоящем докладе является связывание нейтрофилов, что позволяет
Abstract
Сосудистый эндотелий играет важную роль в воспалительной реакции. Во время острой фазы воспаления, эндотелиальные клетки (ECS) активируются принимающими посредников или непосредственно консервативных компонентов микробного или хост-полученных молекул опасности. Активированный ЭК экспресс цитокинов, хемокинов и молекул адгезии, которые мобилизуют, активировать и сохранить лейкоцитов в месте инфекции или травмы. Нейтрофилы первый лейкоцитов, чтобы прибыть, и прилипать к эндотелию с помощью различных молекул адгезии, присутствующих на поверхности обоих элементов. Основные функции нейтрофилов непосредственно устранить микробных угроз, направленной на выпуск других лейкоцитов путем выпуска дополнительных факторов, и инициировать заживления ран. Таким образом, их набор и привязанность к эндотелия является важным шагом в инициации воспалительной реакции. В этом докладе мы описываем в пробирке адгезию нейтрофилов анализе с использованиемкальцеин AM меченных первичных человеческих нейтрофилов для количественной оценки степени эндотелия микрососудов клеточной активации в статических условиях. Этот метод имеет то дополнительное преимущество, что такие же образцы количественно с помощью флуоресцентной спектрометрии можно визуализировать непосредственно с помощью флуоресцентной микроскопии для более качественной оценки нейтрофилов обязательным.
Introduction
Так как сосудистый эндотелий находится в прямом контакте с циркулирующей кровью, уникально расположен инициировать быстрое воспалительной реакции во время инфекции или травмы. Эндотелиальные клетки (ECS) выражают распознающих рецепторов, которые распознают различные консервативные бактериальные компоненты и опасности молекул и рецепторов для хозяина воспалительных медиаторов, таких как TNF-alpha. Активация этих рецепторов вызывает ЭК секретируют цитокины (например, IL-6, IL-8, CXCL1 и CCL2) и усиливают молекул адгезии (например, E / P-селектина, VCAM-1 и ICAM-1) на своей поверхности один , 2. Эти молекулы всех облегчения локализации лейкоцитов к локализации инфекции и травмы, чтобы очистить множество инфекционных агентов и инициировать восстановление тканей 3,4. Нейтрофилов ответ на инфекцию предполагает слаженную взаимодействие между сосудистого эндотелия и ответы нейтрофилов. После активации ЕС, IL-8 секретируется и образует внутрисосудистого градиент на эндотелий, который позволяет нейтрофилов к дому, чтобы в месте инфекции или травмы 5,6. E / P-селектинами промежуточных нейтрофилов захвата и катится по относительно слабой ассоциации с glycomolecules нейтрофилов на клеточной поверхности. Эти взаимодействия, наряду с IL-8 связывания с его родственными рецепторами, облегчения надежной, интегрину-опосредованной привязанность и возможного ареста нейтрофилов на поверхности клеток эндотелия 7-10. После ареста, нейтрофилы могут мигрировать из сосудистой конкретных местах инфекции непосредственно устранения патогенных микроорганизмов, генерировать нейтрофилов внеклеточных ловушек для предотвращения распространения патогенных микроорганизмов, способствуют заживлению ран и отпустите дополнительные факторы, которые вербуют других лейкоцитов, таких как моноциты, макрофаги и дендритные Клетки 11-17.
Описанные в этом докладе, в пробирке метод для количественного нейтрофилов соблюдение мкВascular ECs после активации принимающей медиатор воспаления ФНО. Этот тест предназначен для оценки активацию ЭК, а не нейтрофилов. Первичные человеческие нейтрофилы выделяют с использованием первого разделения градиента плотности, а затем метили кальцеин ацетоксиметила (AM). Эстераз в живых клетках гидролизуют кальцеина AM к сильно флуоресцирующего кальцеин молекулы с возбуждением 492-495 нм и излучение 513-516 нм 18. Флуоресцентно меченных нейтрофилы затем инкубировали с монослои EC и не прилипшие нейтрофилов затем удаляются. Флуоресценции из оставшихся, связанного нейтрофилов затем измеряется с помощью флуоресцентного спектрофотометра, и рассчитывается как процент от общего числа нейтрофилов флуоресценции вход на лунку. Этот метод имеет то дополнительное преимущество, что связанное кальцеин меченных нейтрофилы использовали в спектрофотометрии может быть непосредственно визуализировали с помощью флуоресцентной микроскопии, чтобы дать более качественный считываются из EC переменногоактиваций. Так как это анализ проводят в статических условиях, только очень исходных событий, которые происходят в адгезии нейтрофилов каскад будет оцениваться. Это подтверждается в этом отчет, используя E-селектину блокирующих антител, чтобы показать, что нейтрофилы соблюдение ФНО обработанных легких человека микрососудистой EC (HMVEC-Lung) монослоя резко снижается, когда взаимодействие с E-селектину нарушается.
В дополнение к ФНО, мы успешно использовали эту пробу, чтобы определить степень пупочной вены человека EC (HUVEC) активация Toll-подобный рецептор 1/2 агонисты пептидогликан связанных липопротеинов (PAL), муреин липопротеинов (MLP) и Pam3Cys и HMVEC-Lung активации Pam3Cys 19,20. Кроме того, мы успешно использовали эту пробу с ингибиторы киназы и после RNAi-обусловленный нокдаун поверхности и цитоплазматических белков в HMVEC-Lung, предполагая, что эта методика является совместимым с различными биохимическими и screeninг анализов 20. Таким образом, этот анализ предоставляет простой в использовании, воспроизводимым, более функциональный способ доступа степень активации EC воспалительными медиаторами в пробирке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Покрытие и обслуживание эндотелиальные клетки микрососудов
- Оттепель и развить свой эндотелиальные клетки микрососудов в соответствии с прилагаемыми инструкциями производителей. В этом протоколе, клетки выращивали в EGM-2 МВ СМИ (Lonza), и рекомендуется, чтобы все эксперименты проводятся в течение двух недель оттаивания, чтобы минимизировать любые расхождения, обусловленные пассаж. Наши эксперименты с HMVEC-Lung выполняются проходы между 4 до 9.
- День 1: Когда клетки достигают 80-90% слияния, Trypsinize и ресуспендируйте на 120 000 клеток на мл. Пластина 36 000 клеток (0,3 мл) на лунку в 48-луночные, полистирол планшет для тканевых культур (ов). Включите скважин HMVEC, которые не будут инкубировали с нейтрофилами, чтобы получить показание фоновой флуоресценции. Если вы не используете 48-луночных планшетов, специально предназначенных для флуоресцентные анализы, чередующихся строк или столбцов не будет минимизировать любое загрязнение свет из соседних скважин. Примечание: Wells может быть предварительно покрытые поли-LysiСВ, коллагена или фибронектина.
- День 2: добавить свежую среду.
- День 3: фазово-контрастной микроскопией, подтвердить здоровые клетки (то есть "булыжника" Оформление и меньше мусора клетки), и они на 100% сливной (рис. 1). Если клетки не на 100% сливной измените носитель каждый день, пока они не будут готовы.
- После HMVEC монослоев готовы к обработке, промыть клетки один раз сбалансированным солевым раствором Хенка (HBSS) и добавляют 0,3 мл свежей EGM-2 сред М. или средой, содержащей воспалительных агонист в соответствующие лунки. В этом протоколе HMVEC-Lung обрабатывали TNF-[100 нг / мл] (PeproTech, Нью-Джерси) в течение 3 часов, так как это хорошо описано активатор ЭК 21. ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется время вашего эксперимента, чтобы ваш активированный HMVEC клетки (шаг 4.1) и кальцеин AM помечены нейтрофилов (шаг 3.5) готовы к использованию в то же время. Это приведет нас примерно 2,5 часа, чтобы изолировать и маркировать neutrophшек.
2. Выделения нейтрофилов использованием Polymorphprep
- Изолят нейтрофилов, как описано выше 22, или с готовой градиенте плотности решение изолировать полиморфноядерных гранулоцитов из цельной крови. Используя Polymorphprep в соответствии с протоколом по Nuzzi и др.. Итогам 2007 года с выходом приблизительно 2-3 х 10 6 нейтрофилов на мл цельной крови 23. Примечание: Во избежание чрезмерного лизиса эритроцитов, осаждение декстрана для удаления эффекта красных кровяных клеток может быть выполнено до центрифугирования в градиенте плотности 24.
- Принесите Polymorphprep решение градиентом плотности до комнатной температуры.
- Сбор 30 мл цельной крови от здорового человека добровольцев в присутствии антикоагулянта такие как гепарин, цитрата или ЭДТК. Крови следует использовать в течение 2 часов, то и дело между 18-22 ° C.
- Слой 5 мл цельной крови в течение 5 мл раствора с градиентом плотности в 15 мл коническую пробирку (
- Центрифугируют при 450 х г в течение 30 мин при температуре 18-22 ° С. Убедитесь, что скорость медленно вверх и вниз центрифуге (т.е. выключить центрифуги тормоза), и баланс трубы также для предотвращения вибрации, чтобы помочь уменьшить активацию нейтрофилов и предотвращения смешивания слоев. Более центрифугирования или более центробежных сил приведет к нижней лейкоцитов слой, который содержит нейтрофилы, мигрировать дальше вниз по направлению к гранулированным эритроцитов.
- Аспирируйте плазму и верхние лейкоцитов полосу, содержащую МНПК в целях предотвращения загрязнения слоя, содержащего нейтрофилы (рис. 2В).
- Используйте 1-2 мл серологические пипетки для удаления лейкоцитов нижнего слоя, содержащего нейтрофилы. Объедините слои нейтрофилов в 30 мл PBS (без Са 2 + и Mg 2 +) в 50 млконическую трубку.
- Довести объем до 50 мл с PBS (без Са 2 + и Mg 2 +) и центрифуге при 450 мкг в течение 10 мин при 18-22 ° C.
Примечание: Шаги 2,9 и 2,10 являются дополнительными, но настоятельно рекомендуется.
- Аспирируйте супернатант. Ресуспендируют нейтрофилов в 8 мл стерильной воды в течение 30 секунд для лизиса эритроцитов, сразу же добавить клеточной суспензии по 2 мл 5 раз PBS (без Са 2 + и Mg 2 +) и осторожно перемешать вручную. НЕ инкубации клетки воды дольше, чем 30 секунд, так как значительная смерти нейтрофилов может произойти.
- Центрифуга при 250 мкг в течение 5 мин при 18-22 ° C.
- Промыть клетки один раз 10 мл PBS (без Са 2 + и Mg 2 +) и снова центрифугируют при 250 х г в течение 5 мин при температуре 18-22 ° С.
- Ресуспендируют нейтрофилов в 10 мл RPMI-1640 (без фенола красного) и подсчета живых клеток с использованием трипанового голубэлектронной красителя методом исключения. Избегайте длительных периодов плотности клеток более 5 × 10 6 на мл поскольку это может привести к активации нейтрофилов.
3. Нейтрофилов маркировки Кальцеин AM
- 6 × 10 5 нейтрофилы использовали каждую лунку 48-луночного планшета.
- После подсчета, передавать клетки ресуспендировали в 50 мл коническую пробирку и разбавить нейтрофилов до 2-4 × 10 6 клеток на мл фенолового красного RPMI-1640.
- Добавить кальцеина AM маточного раствора до 3 мкМ (т.е. 2,98 мкл кальцеина AM наличии (1 мг / мл) на мл среды) и хорошо перемешать, осторожно слегка ударяя по пробирке. Более 5 мкм кальцеина AM приведет к утечке из нейтрофилов. Примечание: Номера флуоресцентный кальцеина AM расщепляют внутри клетки эндогенными эстераз производить очень флуоресцентной молекулы кальцеином (т.е. мертвых клеток не будет флуоресцировать).
- Крышка трубки с алюминиевой фольгой и инкубировать еили 30 мин при 37 ° С в темноте. Примечание: Более длительное время инкубации может привести к более кальцеин освобождается от нейтрофилов в течение адгезии анализа.
- Центрифуга при 450 х г в течение 5 мин при температуре 18-22 ° С, а мыть нейтрофилов 2x с 10 мл RPMI-1640 (без фенола красного; предварительно нагретой до 37 ° С). После ресуспендирования клеток на второй стирки, первый проход нейтрофилов хотя 40 мкм стерильный фильтр, чтобы удалить сгустки, а затем еще раз центрифугируют при 450 х г в течение 5 мин при температуре 18-22 ° С.
- Ресуспендируют нейтрофилов в среде RPMI 1640 (без фенола красного; предварительно нагревали до 37 ° С) при 2 × 10 6 нейтрофилов на мл.
4. Анализ связывания нейтрофилов
- Промыть 3 раза HMVEC монослоев 0,5 мл стерилизованным фильтрацией (0,22 мкм), RPMI 1640 (без фенола красного), содержащем 3% БСА на лунку.
- Аспирируйте СМИ и добавить 6 х 10 5 кальцеин меченных нейтрофилов (0,3 мл клеточной Suspensioп) или 0,3 мл среды RPMI 1640 (без фенола красного) без нейтрофилы, в соответствующие лунки 48-луночного планшета. Примечание: Это эквивалент 8 × 10 5 нейтрофилов на см 2.
- Выдержите в течение 20 мин при 37 ° C, 5% СО 2 инкубатора.
- Общее число нейтрофилов флуоресценцию (Предварительная стирка): Измерение интенсивности флуоресценции каждой лунки с длиной волны возбуждения 485 нм и длине волны излучения 520 нм (флуоресцеина набор фильтров) в Fluostar, или эквивалент, спектрофотометр. Этот шаг выполняется только до конечной точки инкубации Примечание: В этом протоколе кальцеин возбуждения и обнаружения излучаемого света были выполнены из верхней части обнаружили скважин, однако, и также может быть выполнена из нижней части скважины..
- Промойте лунки, содержащие HMVEC монослоя и нейтрофилов 5x 0,5 мл на лунку PBS (Вт / Ca 2 + и Mg 2 +). Выньте носители и промывныеопрокидыванием планшета и мягкими похлопывающими движениями на бумажные полотенца, чтобы удалить остатки жидкости.
- Плюс 0,3 мл RPMI 1640 (без фенола красного) на лунку.
- Адгезивные нейтрофилов флуоресценции (POST стирка): Измерение интенсивности флуоресценции каждой лунки, как на стадии 4.4.
- Определить соблюдение процентов и относительных соблюдение на гнездо:
Примечание: На этом этапе изображения кальцеин меченных нейтрофилов может быть получено с помощью флуоресцентного микроскопа, оборудованного способный со стандартными фильтрами флуоресцеина. Изображения на рисунке 4 были получены на Olympus IX51 инвертированный микроскоп оснащен камерой Retiga 2000R (Q Imaging) использованием Q-Capture Pro7 программного обеспечения (Q Imaging).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для того чтобы получить надежные и воспроизводимые результаты помощью анализа связывания нейтрофилов, важно, что здоровье и слияния на эндотелиальные клетки микрососудов являются оптимальными на день анализа, как показано с HMVEC-Lung на рисунке 1. Кроме того, крайне важно, чтобы низкий пассаж микрососудистые ЭК используются (то есть меньше, чем 9 проходов) и, соответственно, мы рекомендуем выполнять все эксперименты в течение двух недель оттаивания. Здоровье нейтрофилов также предельное значение, тем более кальцеина AM не будет метаболизируется до флуоресцентной молекулы кальцеин если клетки состоят каким-то образом. Мы используем тесте с трипановым синим и не действовать на результаты анализа, если значительная доля мертвые клетки (т.е. окрашенные).
Есть несколько способов, чтобы изолировать нейтрофилов, в том числе в градиенте плотности и антиген методы, основанные на разделительной колонны, и любой изэто должно быть достаточно для этой процедуры. Мы решили использовать Polymorphprep готовых градиента плотности раствора из Ось-Shield. Как можно видеть на фигуре 2, МНПК присутствуют в верхнем слое, в то время как нейтрофилы в нижнем слое после центрифугирования. Слой РВМС всасывается во избежание загрязнения гранулоцитов после их удаления. Важно отметить, что шаг 2.9, в которой добавлена вода, чтобы лизировать оставшиеся эритроциты, не является обязательным. Тем не менее, в то время как он идеально подходит для удаления всех загрязняющих эритроцитов, очень важно, что нейтрофилы не сидят в чистой воде в течение более 30 секунд, после чего значительная может наступить смерть.
Наконец, нейтрофилы инкубировали с кальцеина AM течение 30 минут, промывали и ресуспендировали в предварительно нагретой (37 ° C), RPMI-1640 среде (без фенола красного). Важно использовать средства массовой информации без фенолового красного, которое может повлиять на флюоресценции. Количество нейтрophils в лунки добавляли является достаточно произвольным при условии, что флуоресценция показаний до и после стирки в пределах линейного диапазона спектрофотометра, и различия между обработками, которые либо способствовать или предотвращать прилипание нейтрофилов может быть воспроизводимо установлено (см. ниже). Мы находим, что флуоресценция OD 520 нм находится в пределах линейного диапазона при 10000 до 1000000 помечены нейтрофилов анализируются (рис. 3А). Интересно, что мы также считаем, что процент приверженности как появляется все больше нейтрофилов добавляются в HMVEC-Lung монослоя получавших ФНО [100 нг / мл] в течение 3 часов (рис. 3В). Мы выбрали для инкубации HMVEC-Lung и кальцеин меченных нейтрофилы вместе в течение 20 мин, поскольку мы видим, что процент адгезии существенно не увеличится после этой временной точке (данные не показаны). Следует отметить, что в этом анализе были использованы стандартные, ясно полистирол 48-луночные планшеты и обнаружили, что уровень флуоресценции перекрестный показаний между тон скважин не составит более 0,5% от общей флуоресценции вход (данные не показаны). Тем не менее, мы рекомендуем использовать 48-луночных планшетах намеренно сделал для флуоресцентной показания спектрофотометра для более чувствительных экспериментов, если таковые имеются, или, по крайней мере, проектирование эксперимента, чтобы минимизировать перекрестное показаний (см. шаг 1.2).
Чтобы продемонстрировать, что количество нейтрофилов в лунки добавляли является достаточно произвольным при условии, что количество добавленного в пределах линейного диапазона спектрофотометра, мы провели анализ адгезию нейтрофилов с TNF-обработанных HMVEC-Lung в отсутствие или присутствие p38 МАРК-ингибитор BIRB7906, используя различные входные количества нейтрофилов (т.е. 40 000 / а, 200000 / ну или 1000000 / лунку) 25. р38 МАРК Ранее было показано, необходимы для экспрессии Е-селектина в ФНО обработанных человека ЭК, и ее ингибирование, следовательно, уменьшить нейтрофилов связывания с TNF, активированный HMVEC-Lung26. На самом деле, это то, что мы наблюдаем (рис. 3в). Хотя мы обнаружили, что процент соблюдение возрастает более нейтрофилов добавлены, и процент присоединение может отличаться от эксперимента к эксперименту, из-за различных факторов, таких как между донором вариации, качество нейтрофилов и плотность HMVEC в слиянии, относительное соблюдение между условиями остается относительно постоянным в каждом независимом эксперименте, независимо от числа нейтрофилов добавления (фиг.3С и данные не показаны). Эти данные также иллюстрируют Поэтому лучше, чтобы отобразить адгезии данные относительно положительного контроля для связи между экспериментальной последовательности.
Для того чтобы полностью показать, как работает этот анализ, мы провели анализ адгезии нейтрофилов с ФНО обработанных HMVEC-Lung предварительно инкубировали либо с контрольным антителом или E-селектину блокирующих антител. E-селектин экспрессирует на поверхности EC после лечения с помощью TNFa и захватывает нейтрophils из сосудистой посредством электростатических взаимодействий с glycomolecules, присутствующие на поверхности нейтрофилов 1,27. Как показано численно на фиг.4А, графически на фиг.4В и визуально на фиг.4С, TNF-обработанных HMVEC-Lung предварительно инкубировали с Е-селектина антитело, связанное ~ 75% меньше, чем нейтрофилы TNF-обработанных HMVEC-Lung предварительно инкубировали с контрольным IgG. Это предполагает, Е-селектина играет важную роль в закреплении нейтрофилов HMVEC-Lung в нашей статического анализа адгезии.
Рисунок 1. Пример здорового, сливающийся HMVEC-Lung монослоев. Обратите внимание на "булыжника" внешний вид и общее слияния монослоя. Снимки были сделаны на 4X и 10-кратным увеличением на Fisher Scientific Micromaster инвертированного цифрового микроскопа. 
Рисунок 2. Цельную кровь и Polymorphprep слоистых перед центрифугированием (А) и отделенный после центрифугирования (B). Следует отметить, что после центрифугирования РВМС образуют отдельный верхней полосы, в то время как полиморфноядерных гранулоцитов (нейтрофилов) образуют отдельный нижней полосы.
Рисунок 3. Отношения между числа нейтрофилов и флуоресценции OD 520 нм линейно; процентов адгезию нейтрофилов к ФНО обработанных HMVEC-Lung как появляется все больше нейтрофилов добавляются; p38-МАРК нейтрофилов способствует присоединению к TNF-альфа активированный HMVEC-Lung монослоя (А) График. изображающих LineaR отношения между флуоресценции OD 520 нм и нейтрофилов насчитывает более двух порядков. R2 значение 0,996 показывает линейную зависимость между число нейтрофилов и флуоресценции OD 520 нм при 10000 до 1000000 нейтрофилы проанализированы. (B) Графическое представление процентов соблюдение когда различные количества кальцеин меченных нейтрофилов были добавлены к необработанным или обработанным TNF-( 100 нг / мл;. 3 ч) HMVEC-Lung монослоев в 48-луночных планшетах (C) HMVEC-Lung монослои были предварительно инкубированы с р38 МАРК ингибитор BIRB796 (10 мМ) (Axon Medchem) или ДМСО (контроль) в течение за 1 час до ФНО (100 нг / мл) лечение в течение 3 часов, а в постоянном присутствии BIRB796 (10 мм). Относительное соблюдение рассчитывали как на шаге 4.8. Данные выражены как среднее ± SD. GraphPad Prism непарного т-тест был использован для статистического анализа (п = 3) (ФНО обработанных против TNF, обработанных плюс BIRB796). значение р ** <0.01; *** &# 60;. 0,001 Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 4. E-селектина способствует присоединение нейтрофилов к ФНО обработанных HMVEC-легкие. HMVEC-Lung обрабатывали TNF-[100 нг / мл] в течение 3 часов. После промывки HMVEC-Lung с RPMI 1640, содержащем 3% БСА (шаг 4.1), или овца IgG [50 мкг / мл] (5-001-A, R & D Systems) или E-селектина поликлональных антител (PAB) [50 мг / мл] (AF724, R & D Systems) добавляют в соответствующие лунки в течение 20 мин. HMVEC-Lung монослои затем еще раз промывают средой RPMI-1640 до 6 × 10 5 нейтрофилов на лунку в течение дополнительных 20 мин. (A) вычисления для определения процента и относительной соблюдение показаны. Кальцеинсветового излучения измеряется в OD 520 нм. Справочная OD 520 нм средний происходит от HMVEC-Lung в отсутствии ФНО лечения и нейтрофилов. (B) Графическое представление относительной соблюдение процентов кальцеин меченных нейтрофилов с необработанными или обработанными TNF-HMVEC-Lung монослоев после предварительной инкубации с или контроль IgG или E-селектину блокирования PAB. Данные выражены как среднее ± SD. GraphPad Prism непарного т-тест был использован для статистического анализа (п = 3). Расчетное значение р было <0,001. (С) изображения кальцеина меченных нейтрофилов связанный с необработанными и обработанными TNF-HMVEC-Lung монослоев предварительно инкубировали либо контроль IgG или E-селектина Pab. Примером хорошо, содержащем 6 х 10 5 нейтрофилов до промывки PBS показано (предварительной стирки). Прозрачный свет микроскопии изображений приведены в правой колонке, а флуоресцентные изображения одного и того же поля ведения, использования фильтров флуоресцеинаустановлены, указаны в левой колонке. Снимки были сделаны в 10-кратным увеличением на Olympus IX51 инвертированный микроскоп оснащен камерой Retiga 2000R (Q Imaging). Предварительная стирка = общее число нейтрофилов флуоресценции OD 520 нм (шаг 4.4); POST мыть = приверженцем нейтрофилов флуоресценции OD 520 нм (шаг 4.7); ПМН - полиморфноядерных гранулоцитов; AVG - среднее; IgG - овец IgG контроля; E-sel/α-E-selectin - E-селектину блокирования PAB. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наиболее важных шагов для успешной нейтрофилов / эндотелия микрососудов анализа клеточной адгезии являются: 1) использование небольшого числа проход (<9), здоровым клеткам эндотелия; 2) Обслуживание изолированных нейтрофилов при низкой плотности (то есть <5 х 10 6 клеток / мл), и их использование в течение двух часов изоляции, и 3) Привередливый промывки кальцеина AM-меченый нейтрофилов и использование кальцеина AM-меченый нейтрофилов своевременно, чтобы минимизировать EC загрязнение и потери кальцеин из нейтрофилов, соответственно .
Добавим, 8 × 10 5 нейтрофилов на см 2 культуре ткани и площадь поверхности (то есть 600000 нейтрофилов на лунку 48-луночного планшета). Мы обнаружили, что вход 600 000 нейтрофилов в пределах линейного диапазона наших спектрофотометр и надежно воспроизводит данные, когда относительное спаек измеряются. Тем не менее, очень похоже снижение нейтрофилов связывания наблюдается вр38 МАРК анализа ингибирования (фиг.3С), когда 40000, 200000 и 1000000 нейтрофилов на лунку, предполагая, что меньше, чем 600000 нейтрофилов может быть использован.
Протокол, описанный здесь только оценивает степень эндотелиальной активацией так как нейтрофилы сами предварительно не активирована, или лечить в любом случае, что, конечно, вариант, если ваш конкретного анализа требует этого. Показано, что экспрессию Е-селектина на TNFa обработанных HMVEC-Lung важно для прикрепления нейтрофилов в этом анализе, в соответствии с предыдущими наблюдениями 27. Электростатическое связывание E-селектина с glycomolecules присутствует на поверхности нейтрофилов относительно слабы, но в условиях потока, это взаимодействие, как полагают, чтобы вызвать высокое сродство интегрин-опосредованной вложения между нейтрофилов и ЭК 1,7-10. Таким образом, этот анализ может быть более показательными из первых шагов в воспалении, что арэлектронной необходимое для захвата нейтрофилов из сосудистой сети. Тем не менее, мы убедились, что наши результаты, полученные с ФНО в этом отчете были очень похожи, если не идентичны, чтобы, полученными с использованием проточного модуля (данные не приведены), что свидетельствует о результатах этого статического анализа являются физиологически значимых и предполагает, что этот анализ особенно полезна для исследователей, которые не имеют доступа к проточной системе.
Вариации описан анализ, используя кальцеин как обнаружение флуорофора, были впервые описан в 1993 году 28,29. Важно, что эти первоначальные доклады обнаружили, что кальцеин не влияет жизнеспособность клеток и имела наименьшее влияние на функцию клеток в анализе адгезии по сравнению с другими флуоресцеина полученных красителей 29,30. Было также сообщено, что число клеток линейной по интенсивности флуоресценции, соответствует тому, что мы наблюдаем (рис. 3А) 28. Первоначальные доклады также подчеркнул, чтоОсновным преимуществом флуорометрического анализа является то, что они не требуют радиоактивным изотопом (например, 111 В или 51 Cr) очищенного лейкоцитов 31-33. Преимущества и консистенции использования кальцеина AM-меченых клеток на радиоактивно меченные клетки были тщательно обсуждалось ранее 28,29,34. Хотя мы используем кальцеин AM для обозначения нейтрофилов в нашем анализе, ряд других ячейки проникающих красителей, которые являются эстеразы подложках имеются. Например, Life Technologies продает CellTrace кальцеин красно-оранжевый (C34852), кальцеин фиолетовый (C34858) и кальцеин синий (C34853), которые возбуждают / излучающих на разных длинах волн. Различные красители имеют свои преимущества и недостатки. Например, кальцеин красно-оранжевый краситель АМ имеет некоторые собственной флуоресценции перед гидролизом 18.
Мы используем этот метод для изучения воспалительной активации эндотелия в ответ на бактериальные и эндогенные факторы (такие как ФНО) и гоВоспользуемся HMVECs собранные из трупов, которая может быть расширена в достаточном количестве, чтобы сделать пробы с надлежащего контроля и воспроизводит достаточно для выполнения статистического анализа. Предположительно, этот анализ может быть также использована в качестве инструмента для изучения эндотелиальной основе патологических процессов, которые включают лейкоцитов связывания с микрососудистой эндотелия. Примеры расстройств, которые могут быть изучены с помощью HMVECs от пациентов включают хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ), сепсис, воспалительные заболевания кишечника, васкулиты, такие как анти-нейтрофилов цитоплазматических аутоантител (ANCA), связанного васкулиты, и мозг сосудистых мальформаций 35-40 . Например, HMVECs могут быть собраны у людей с васкулиты или сепсиса посмертного или потенциально у пациентов с эндотелиальной основе болезненных процессов, которые подверглись биопсии или хирургической резекции органа и их связывание нейтрофилов оценивали при различных условиях. Тем не менее, этот анализ требует достаточногоколичество HMVECs сформировать монослоев, и, таким образом HMVECs расширены и использованы после нескольких проходов. Этот процесс расширения может привести к фенотипические изменения в ЭК, которые должны быть приняты во внимание при проектировании исследований с использованием первичного ЭК от пациентов с ЕС на основе заболеваний. Тем не менее, универсальность этого анализа позволяет ему быть адаптированы ко многим другим приверженцем и лейкоцитов типов клеток. В самом деле, этот анализ, или ее варианты, которые были успешно использованы с другими типами эндотелиальных клеток и первичных клеток и клеточных линий, таких как моноциты, THP-1, Jurkat, HL-60, 28,31,41 и U937. Этот анализ оказался быстрым, легким для выполнения, воспроизводимым и очень чувствительна, и поэтому является очень полезным инструментом для выявления активации эндотелиальных клетки медиаторов воспаления.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Департаментом UCSF анестезии и интраоперационной помощи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HMVEC-Lung | Lonza | CC-2527 | |
| EGM-2 MV | Lonza | CC-3202 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175-095 | Can be substituted with any vendor |
| 48-well Tissue Culture Plates | BD Falcon | 353078 | |
| PBS (without phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL001 | Can be substituted with any vendor |
| D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | Can be substituted with any vendor |
| RPMI-1640 (without phenol red) | Life Technologies | 11835-030 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield | 1114683 | |
| calcein AM | Life Technologies | C3099 | (0.995 mM) stock soln |
| Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 40 μM filters | VWR | 21008-949 | Can be substituted with any vendor |
| FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer | BMG LABTECH | - |
References
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Collins, T., et al. Transcriptional regulation of endothelial cell adhesion molecules: NF-kappa B and cytokine-inducible enhancers. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 9, 899-909 (1995).
- Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
- Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
- Middleton, J., et al. Transcytosis and surface presentation of IL-8 by venular endothelial cells. Cell. 91, 385-395 (1997).
- Rot, A. Endothelial cell binding of NAP-1/IL-8: role in neutrophil emigration. Immunol. Today. 13, 291-294 (1992).
- Detmers, P. A., et al. Neutrophil-activating protein 1/interleukin 8 stimulates the binding activity of the leukocyte adhesion receptor CD11b/CD18 on human neutrophils. J. Exp. Med. 171, 1155-1162 (1990).
- Laudanna, C., Kim, J. Y., Constantin, G., Butcher, E. Rapid leukocyte integrin activation by chemokines. Immunol. Rev. 186, 37-46 (2002).
- Simon, S. I., Hu, Y., Vestweber, D., Smith, C. W. Neutrophil tethering on E-selectin activates beta 2 integrin binding to ICAM-1 through a mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway. J. Immunol. 164, 4348-4358 (2000).
- Zarbock, A., Ley, K. Mechanisms and consequences of neutrophil interaction with the endothelium. The American Journal of Pathology. 172, 1-7 (2008).
- Muller, W. A. Mechanisms of leukocyte transendothelial migration. Annu. Rev. Pathol. 6, 323-344 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. International Immunopharmacology. 10, 1325-1334 (2010).
- McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330, 362-366 (2010).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
- Soehnlein, O., Lindbom, L., Weber, C. Mechanisms underlying neutrophil-mediated monocyte recruitment. Blood. 114, 4613-4623 (2009).
- Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Prakash, A., Xu, F., Hellman, J. Activation of endothelial TLR2 by bacterial lipoprotein upregulates proteins specific for the neutrophil response. Innate Immun. 18, 602-616 (2012).
- Haugland, R. P., Johnson, I. D., Basey, A. The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labelling Technologies. , 10, (2005).
- Shin, H. S., et al. Bacterial lipoprotein TLR2 agonists broadly modulate endothelial function and coagulation pathways in vitro and in vivo. J. Immunol. 186, 1119-1130 (2011).
- Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Lucero, J., Xu, F., Hellman, J. ERK5 protein promotes, whereas MEK1 protein differentially regulates, the Toll-like receptor 2 protein-dependent activation of human endothelial cells and monocytes. J. Biol. Chem. 287, 26478-26494 (2012).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat. Rev. Immunol. 7, 803-815 (2007).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol. Biol. 370, 23-36 (2007).
- Garcia-Garcia, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. A simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry. J. Vis. Exp. (74), e50410 (2013).
- Kuma, Y., et al. BIRB796 inhibits all p38 MAPK isoforms in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 280, 19472-19479 (2005).
- Westra, J., Kuldo, J. M., van Rijswijk, M. H., Molema, G., Limburg, P. C. Chemokine production and E-selectin expression in activated endothelial cells are inhibited by p38 MAPK (mitogen activated protein kinase) inhibitor RWJ 67657. International Immunopharmacology. 5, 1259-1269 (2005).
- Leeuwenberg, J. F., Jeunhomme, G. M., Buurman, W. A. Adhesion of polymorphonuclear cells to human endothelial cells. Adhesion-molecule-dependent, and Fc receptor-mediated adhesion-molecule-independent mechanisms. Clinical and Experimental Immunology. 81, 496-500 (1990).
- Akeson, A. L., Woods, C. W. A fluorometric assay for the quantitation of cell adherence to endothelial cells. Journal of Immunological Methods. 163, 181-185 (1993).
- Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion. Journal of Immunological Methods. 159, 93-100 (1993).
- De Clerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leucocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. Journal of Immunological Methods. 172, 115-124 (1994).
- Bevilacqua, M. P., Pober, J. S., Wheeler, M. E., Cotran, R. S., Gimbrone, M. A. Interleukin 1 acts on cultured human vascular endothelium to increase the adhesion of polymorphonuclear leukocytes, monocytes, and related leukocyte cell lines. The Journal of Clinical Investigation. 76, (1985).
- Schleimer, R. P., Rutledge, B. K. Cultured human vascular endothelial cells acquire adhesiveness for neutrophils after stimulation with interleukin 1, endotoxin, and tumor-promoting phorbol diesters. J. Immunol. 136, 649-654 (1986).
- Gamble, J. R., Harlan, J. M., Klebanoff, S. J., Vadas, M. A. Stimulation of the adherence of neutrophils to umbilical vein endothelium by human recombinant tumor necrosis factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8667-8671 (1985).
- Braut-Boucher, F., et al. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178, 41-51 (1995).
- Ait-Oufella, H., Maury, E., Lehoux, S., Guidet, B., Offenstadt, G. The endothelium: physiological functions and role in microcirculatory failure during severe sepsis. Intensive Care Medicine. 36, 1286-1298 (2010).
- Andonegui, G., et al. Endothelium-derived Toll-like receptor-4 is the key molecule in LPS-induced neutrophil sequestration into lungs. The Journal of Clinical Investigation. 111, 1011-1020 (2003).
- Sharma, J., et al. Lung endothelial cell platelet-activating factor production and inflammatory cell adherence are increased in response to cigarette smoke component exposure. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302, L47-L55 (2012).
- Deban, L., Correale, C., Vetrano, S., Malesci, A., Danese, S. Multiple pathogenic roles of microvasculature in inflammatory bowel disease: a Jack of all trades. The American Journal of Pathology. 172, 1457-1466 (2008).
- Gross, W. L., Trabandt, A., Csernok, E. Pathogenesis of Wegener's granulomatosis. Annales de Medecine Interne. 149, 280-286 (1998).
- Chen, Y., et al. Evidence of inflammatory cell involvement in brain arteriovenous malformations. Neurosurgery. 62, 1340-1349 (2008).
- Martens, C. L., et al. Peptides which bind to E-selectin and block neutrophil adhesion. J. Biol. Chem. 270, 21129-21136 (1995).
