Summary
L'adesione dei neutrofili all'endotelio attivato nei siti di infezione è una componente integrale della risposta infiammatoria dell'ospite. Descritto in questo rapporto è un saggio di legame dei neutrofili che permette la
Abstract
L'endotelio vascolare svolge un ruolo fondamentale nella risposta infiammatoria. Durante la fase acuta dell'infiammazione, cellule endoteliali (EC) sono attivati da mediatori ospitanti o direttamente da componenti microbici conservati o molecole pericolo ospite-derivati. Attivati ecs esprimere citochine, chemochine e molecole di adesione che mobilitano, attivano e mantengono leucociti nel sito di infezione o lesioni. Neutrofili sono i primi ad arrivare leucociti, e aderire alla endotelio attraverso una varietà di molecole di adesione presenti sulle superfici di entrambe le celle. Le principali funzioni di neutrofili sono eliminare direttamente minacce microbiche, promuovere l'assunzione di altri leucociti attraverso il rilascio di fattori aggiuntivi, e avviare riparazione della ferita. Pertanto, il loro reclutamento e attaccamento alla endotelio è un passaggio fondamentale nell'iniziazione della risposta infiammatoria. In questo rapporto, descriviamo un test di adesione in vitro usando neutrofilicalceina AM-etichettato neutrofili umani primari per quantificare il grado di attivazione delle cellule endoteliali microvascolari in condizioni statiche. Questo metodo ha il vantaggio aggiuntivo che gli stessi campioni quantizzati mediante spettrofotometria a fluorescenza possono anche essere visualizzati direttamente utilizzando la microscopia a fluorescenza per una valutazione più qualitativa di legame neutrofili.
Introduction
Poiché l'endotelio vascolare è in contatto diretto con il sangue circolante, esso è sitato ad iniziare una risposta infiammatoria rapido durante infezioni o lesioni. Le cellule endoteliali (EC) recettori di pattern recognition espresso che riconoscono una varietà di componenti batteriche conservati e molecole pericolo, e recettori per Host mediatori infiammatori, come TNFa. Attivazione di questi recettori induce EC per secernere citochine (es IL-6, IL-8, CXCL1 e CCL2), e per upregulate molecole di adesione (ad esempio E / P-selectina, VCAM-1 e ICAM-1) alla loro superficie cellulare 1 , 2. Queste molecole tutto facilitano la localizzazione dei leucociti ai siti di infezione e lesioni per chiarire l'host di agenti infettivi e avviare la riparazione tissutale 3,4. La risposta dei neutrofili all'infezione comporta un'interazione ben coordinato tra l'endotelio vascolare e la risposta neutrofili. All'attivazione EC, IL-8 è secreto e forma un gradiente intravascolare sull'endotelio che permette di neutrofili casa al sito di infezione o lesioni 5,6. E / P-selectine mediata neutrofili cattura e rotolare attraverso le associazioni relativamente deboli con glycomolecules sulla superficie cellulare dei neutrofili. Queste interazioni, insieme con IL-8 legame ai suoi recettori cognate, facilitano il robusto, attaccamento integrina-mediata ed eventuale arresto dei neutrofili sulla superficie delle cellule endoteliali 7-10. Dopo l'arresto, i neutrofili possono migrare fuori della vascolarizzazione ai siti specifici di infezione di eliminare direttamente i patogeni, generare neutrofili trappole extracellulari per prevenire la diffusione di agenti patogeni, promuovere la guarigione delle ferite e rilasciare fattori aggiuntivi che reclutano leucociti altri come monociti, macrofagi e dendritiche cellule 11-17.
Descritte nella presente relazione è un metodo in vitro per quantificare l'adesione dei neutrofili alle microVascular I CE dopo l'attivazione da parte del mediatore infiammatorio ospite TNFa. Questo test è stato progettato per valutare l'attivazione delle cellule endoteliali, e non neutrofili. Neutrofili umani primari sono stato isolato utilizzando separazione gradiente di densità, e sono quindi etichettati con calceina acetossimetil (AM). Esterasi all'interno delle cellule in diretta idrolizzano calceina AM alla molecola calceina altamente fluorescente con una eccitazione di 492-495 nm ed emissione di 513-516 nm 18. I neutrofili fluorescenza marcata vengono poi incubate con monostrati CE, e neutrofili non aderenti sono successivamente rimossi. La fluorescenza dei rimanenti, neutrofili legato viene quindi misurata mediante uno spettrofotometro a fluorescenza, e calcolata come percentuale del totale dei neutrofili ingresso fluorescenza per pozzetto. Questo metodo ha il vantaggio aggiuntivo che i neutrofili calceina-etichettati vincolati utilizzati in spettrofotometria possono essere visualizzati direttamente utilizzando la microscopia a fluorescenza per dare una lettura più qualitativa di ac CEtivazione. Dal momento che questo test viene eseguito in condizioni statiche, saranno valutati solo gli eventi molto iniziali che si verificano nella adesione cascata neutrofili. Ciò è confermato in questo rapporto utilizzando anticorpi bloccanti E-selectina per dimostrare che l'adesione dei neutrofili alle TNFa-trattato polmone umano microvascolare CE (HMVEC-Lung) monostrati si riduce drasticamente quando l'interazione con la E-selectina è perturbato.
Oltre a TNFa, abbiamo utilizzato con successo questo test per determinare l'entità della vena ombelicale CE attivazione umana (HUVEC) dal recettore Toll-like mezzo agonisti lipoproteine peptidoglicano-associato (PAL), murein lipoproteina (MLP) e Pam3Cys e attivazione HMVEC-Lung da Pam3Cys 19,20. Inoltre, abbiamo utilizzato con successo questo test con inibitori delle chinasi e dopo knockdown RNAi-mediata di superficie e proteine citoplasmatiche in HMVEC-Lung, suggerendo che questa metodologia è compatibile con una varietà di biochimica e screening saggi 20. In sintesi, questo saggio fornisce un facile da usare, modo riproducibile, più funzionale per accedere alla misura dell'attivazione CE da mediatori infiammatori in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Placcatura e manutenzione di microvascolari cellule endoteliali
- Scongelare e far crescere le cellule endoteliali microvascolari secondo i produttori fornite istruzioni. In questo protocollo, le cellule sono state coltivate in EGM-2 MV multimediale (Lonza), e si raccomanda che tutti gli esperimenti vengono eseguiti entro due settimane lo scongelamento per ridurre al minimo qualsiasi variazione dovuta al numero di passaggio. I nostri esperimenti con HMVEC-Lung vengono eseguiti tra passaggi 4-9.
- Giorno 1: Quando le cellule raggiungono 80-90% di confluenza, trypsinize e sospendere nuovamente a 120.000 cellule per ml. Piastra 36.000 cellule (0,3 ml) per pozzetto in 48 pozzetti, piastra di coltura tissutale polistirene (s). Includere pozzi di HMVEC che non saranno incubate con neutrofili in modo da ottenere una lettura della fluorescenza di fondo. A meno che utilizzando piastre 48 pozzetti appositamente progettati per le analisi di fluorescenza, alternando righe o colonne ridurrà al minimo la contaminazione leggera da pozzi vicini. NOTA: Wells può essere pre-rivestito con poli-LYSIne, collagene o fibronectina.
- 2 ° giorno: Aggiungi mezzi freschi.
- Giorno 3: In contrasto di fase, confermano le cellule sono sane (cioè l'aspetto "acciottolato" e poco detriti cellulari), e sono al 100% confluenti (Figura 1). Se le cellule non sono al 100% confluenti, cambiare i media ogni giorno fino a quando non sono pronti.
- Una volta che i monostrati HMVEC sono pronti per il trattamento, lavare le cellule una volta con soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) e aggiungere 0,3 ml di fresca EGM-2 supporti MV o supporti contenenti agonisti infiammatoria nei rispettivi pozzetti. In questo protocollo il HMVEC-Lung state trattate con TNFa [100 ng / ml] (Peprotech, New Jersey) per 3 ore poiché questo è un attivatore ben descritto di EC 21. NOTA: Si raccomanda di tempo l'esperimento in modo che le vostre cellule HMVEC attivati (Passo 4.1) e calceina AM neutrofili etichettati (Passo 3.5) sono pronti per l'uso, allo stesso tempo. Ci vogliono circa 2,5 ore per isolare ed etichettare neutrophils.
2. Isolamento dei neutrofili utilizzando Polymorphprep
- Isolare i neutrofili come descritto in precedenza 22, o con una soluzione pronta gradiente di densità di isolare granulociti polimorfonucleati dal sangue intero. Impiegando Polymorphprep seguendo il protocollo di Nuzzi et.al. risultati 2007 dei rendimenti di circa 2-3 x 10 6 neutrofili per ml di sangue intero 23. NOTA: per evitare un eccessivo lisi degli eritrociti, una sedimentazione destrano per rimuovere i globuli rossi possono essere svolte prima di centrifugazione in gradiente di densità 24.
- Portare la soluzione gradiente di densità Polymorphprep a RT.
- Raccogliere 30 ml di sangue intero da un volontario umano sano in presenza di un anticoagulante come l'eparina, citrato o EDTA. Il sangue deve essere utilizzato entro 2 ore, e mantenuta tra 18-22 ° C.
- Strato 5 ml di sangue intero in 5 ml della soluzione di gradiente di densità in un tubo da 15 ml (Figura 2A). Evitare di alterare i volumi di sangue e la soluzione gradiente di densità in quanto ciò potrebbe cambiare le successive condizioni di centrifugazione.
- Centrifugare a 450 xg per 30 minuti a 18-22 ° C. Assicurati di accelerare lentamente su e giù per la centrifuga (cioè spegnere il freno centrifuga), e bilanciare i tubi bene per evitare che le vibrazioni per contribuire a ridurre l'attivazione dei neutrofili e prevenire la miscelazione di strati. Tempi più lunghi di centrifugazione o di forza centrifuga maggiore si tradurrà nello strato leucocitaria inferiore, che contiene i neutrofili, a migrare più in basso verso i globuli rossi pellet.
- Aspirare il plasma e leucociti banda superiore contenente PBMC di impedire la contaminazione dello strato contenente neutrofili (Figura 2B).
- Utilizzare un 1-2 ml pipetta sierologica per rimuovere lo strato inferiore contenente leucociti neutrofili. Unire i livelli di neutrofili in 30 ml di PBS (senza Ca 2 + e Mg 2 +) in 50 mltubo conico.
- Portare il volume a 50 ml con PBS (senza Ca 2 + e Mg 2 +) e centrifugare a 450 xg per 10 minuti a 18-22 ° C.
Nota: I punti 2.9 e 2.10 sono opzionali, ma altamente raccomandato.
- Aspirare il surnatante. Risospendere i neutrofili in 8 ml di acqua sterile per 30 sec per la lisi dei globuli rossi, aggiungere immediatamente la sospensione di cellule per 2 ml di PBS 5x (senza Ca 2 + e Mg 2 +) e mescolare delicatamente con le mani. Non incubare le cellule in acqua per più di 30 secondi dal momento significativo morte neutrofili può verificarsi.
- Centrifugare a 250 xg per 5 minuti a 18-22 ° C.
- Lavare le cellule una volta con 10 ml di PBS (senza Ca 2 + e Mg 2 +) e centrifugare nuovamente a 250 xg per 5 minuti a 18-22 ° C.
- Risospendere i neutrofili in 10 ml di RPMI-1640 (senza rosso fenolo) e contare le cellule vive usando il blu tripanotingere metodo di esclusione. Evitare periodi prolungati di densità cellulari maggiori di 5 x 10 6 per ml poiché questo può causare l'attivazione dei neutrofili.
3. Neutrofili Etichettatura con Calcein AM
- 6 x 10 5 neutrofili sono utilizzati per pozzetto di una piastra a 48 pozzetti.
- Dopo il conteggio, trasferire le cellule risospese ad una provetta da 50 ml e diluire i neutrofili a 2-4 x 10 6 cellule per ml con fenolo aneritro RPMI-1640.
- Aggiungi calceina AM soluzione madre di 3 micron (cioè 2,98 ml di calceina AM madre (1 mg / ml) per ml di media) e mescolare bene muovendo delicatamente il tubo. Superiore a 5 micron calceina AM si tradurrà in perdite dai neutrofili. Nota: non fluorescente calceina AM viene scissa nelle cellule dalle esterasi endogene per produrre la molecola altamente fluorescente calceina (vale a dire le cellule morte non fluorescenza).
- Coprire il tubo con un foglio di alluminio e incubare for 30 min a 37 ° C al buio. Nota: i tempi di incubazione più lunghi possono tradursi in maggiore calceina essere liberata dai neutrofili nel corso del saggio di adesione.
- Centrifugare a 450 xg per 5 minuti a 18-22 ° C, e lavare i neutrofili 2x con 10 ml di RPMI-1640 (senza rosso fenolo; pre-riscaldato a 37 ° C). Dopo risospendere le cellule per il secondo lavaggio, prima passare i neutrofili con un filtro sterile 40 pM per eliminare grumi e quindi si centrifuga di nuovo a 450 xg per 5 minuti a 18-22 ° C.
- Risospendere i neutrofili in RPMI 1640 (senza rosso fenolo; pre-riscaldato a 37 ° C) a 2 x 10 6 neutrofili per ml.
4. Neutrofili Binding Assay
- Lavare i monostrati HMVEC 3x con 0,5 ml di sterilizzata per filtrazione (0,22 micron) RPMI 1640 (senza rosso fenolo) contenente il 3% di BSA per pozzetto.
- Aspirare i media e aggiungere 6 x 10 5 neutrofili calceina-etichettati (0,3 ml di sospensione cellulare), Oppure 0,3 ml di RPMI 1640 (senza rosso fenolo) senza neutrofili, nei rispettivi pozzetti della 48 pozzetti. Nota: Questo è l'equivalente di 8 x 10 5 neutrofili per cm 2.
- Incubare per 20 min a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore.
- Totale dei neutrofili Fluorescenza (PRE lavaggio): Misurare l'intensità di fluorescenza di ciascun bene con una lunghezza d'onda di eccitazione di 485 nm e una lunghezza d'onda di 520 nm (fluoresceina filtro impostato) in una FLUOstar, o equivalente, spettrofotometro di emissione. Eseguire questo passaggio appena prima del punto finale incubazione Nota: In questo protocollo, calceina eccitazione e rilevamento della luce emessa state eseguite dalla sommità dei pozzi scoperti, tuttavia, entrambi possono essere eseguite anche dal fondo dei pozzetti..
- Lavare i pozzetti contenenti monostrati HMVEC e neutrofili 5x con 0,5 ml per pozzetto di PBS (w / Ca 2 + e Mg 2 +). Rimuovere il supporto e lavaggiinvertendo la piastra, e picchiettando delicatamente su carta assorbente per eliminare il liquido rimasto.
- Aggiungi posteriore 0,3 ml di RPMI 1640 (senza rosso fenolo) per pozzetto.
- Aderente neutrofili Fluorescenza POST (lavaggio): Misurare l'intensità di fluorescenza di ogni nonché al punto 4.4.
- Determinare l'aderenza per cento e l'adesione relativa per bene:
Nota: In questa fase, le immagini dei neutrofili calceina-etichettati possono essere ottenuti utilizzando un microscopio capace fluorescenza dotato di filtri fluoresceina standard. Le immagini in figura 4 sono stati ottenuti su una Olympus IX51 microscopio invertito dotato di una fotocamera 2000R Retiga (Q Imaging) con Q-Capture Software Pro7 (Q Imaging).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Per ottenere risultati affidabili e riproducibili usando un saggio di legame neutrofili, è essenziale che la salute e la confluenza delle cellule endoteliali microvascolari sono ottimali nel giorno del saggio, come illustrato con HMVEC-Lung in Figura 1. Inoltre, è indispensabile che passaggio basso numero microvascolare EC vengono utilizzati (cioè meno di 9 brani), e di conseguenza, si consiglia di eseguire tutti gli esperimenti entro due settimane di scongelamento. La salute dei neutrofili è inoltre di fondamentale importanza, soprattutto perché calceina AM non sarà metabolizzato alla molecola fluorescente calceina se le cellule sono compresi in qualche modo. Usiamo il metodo di esclusione trypan blu, e non procedere con il test se una percentuale significativa delle cellule sono morti (cioè macchiato).
Ci sono diversi modi per isolare neutrofili, compresi gradiente di densità e metodi di separazione delle colonne antigene-based, e qualsiasiquesti dovrebbero essere sufficienti per questa procedura. Abbiamo scelto di utilizzare la soluzione di gradiente di densità ready-made Polymorphprep da Axis-Shield. Come visibile in figura 2, le PBMC sono presenti nello strato superiore, mentre i neutrofili sono all'interno dello strato inferiore dopo centrifugazione. Lo strato PBMC viene aspirato in modo da evitare la contaminazione dei granulociti al loro rimozione. È importante notare che passo 2.9, in cui viene aggiunta acqua per lisare le cellule rosse del sangue rimanenti, è opzionale. Tuttavia, mentre è ideale per rimuovere tutti gli eritrociti contaminanti, è fondamentale che i neutrofili non siedono in acqua pura per più di 30 sec dopo il quale può verificarsi considerevole morte.
Infine, i neutrofili sono incubati con calceina AM per 30 minuti, lavate e risospese in pre-riscaldato (37 ° C) RPMI-1640 supporti (senza rosso fenolo). È importante utilizzare supporti senza rosso fenolo, che può interferire con la lettura della fluorescenza. Il numero di NEUTRophils aggiunti ai pozzetti è piuttosto arbitrario, purché le letture di fluorescenza di pre-e post-lavaggio sono all'interno della gamma lineare dello spettrofotometro, e le differenze tra i trattamenti che possono promuovere o prevenire l'adesione dei neutrofili può essere riproducibile accertata (vedi sotto). Troviamo che la fluorescenza OD 520nm rientra nell'intervallo lineare quando 10.000 a 1.000.000 neutrofili etichettati vengono analizzati (Figura 3A). È interessante notare che troviamo anche che l'adesione percentuale aumenta più neutrofili vengono aggiunti a monostrati HMVEC-polmonari trattati con TNF [100 ng / ml] per 3 ore (Figura 3B). Abbiamo scelto di incubare la HMVEC-Lung e neutrofili calceina-etichettati insieme per 20 minuti, in quanto troviamo che la percentuale di adesione non aumenta significativamente dopo questo momento (dati non riportati). Di nota, in questo saggio abbiamo utilizzato standard chiaro polistirene piastre da 48 pozzetti e abbiamo trovato che il livello di letture di fluorescenza cross-over tra tche i pozzi non costituivano più del 0,5% dell'input di fluorescenza totale (dati non riportati). Tuttavia, si consiglia di utilizzare le piastre 48 pozzetti appositamente realizzati per letture spettrofotometriche fluorescenza per esperimenti più sensibili, se disponibile, o per lo meno, progettare il vostro esperimento di minimizzare le letture di cross-over (vedi punto 1.2).
Per dimostrare che il numero dei neutrofili aggiunte ai pozzetti è piuttosto arbitrario purché il numero aggiunto è all'interno del range lineare dello spettrofotometro, abbiamo eseguito un saggio di adesione dei neutrofili con TNFa-trattato HMVEC-Lung in assenza o presenza della p38 inibitore-MAPK BIRB7906, utilizzando il metodo di diverse quantità di neutrofili (cioè 40.000 / bene, 200,000 / 1,000,000 bene o / e) 25. p38-MAPK è stato precedentemente dimostrato di essere necessaria per l'espressione di E-selectina in TNFa-trattato umana EC, e la sua inibizione deve quindi ridurre neutrofili vincolante per TNF-attivato HMVEC-Lung26. In realtà, questo è ciò che si osserva (Figura 3C). Anche se troviamo che l'adesione percentuale aumenta quando vengono aggiunti più neutrofili, e l'aderenza percentuale può variare tra esperimenti, a causa di vari fattori, come le variazioni inter-donatori, la qualità dei neutrofili e la densità di HMVEC alla confluenza, la relativa aderenza tra condizioni rimane relativamente costante in ciascun esperimento indipendente indipendentemente dal numero di neutrofili aggiunti (Figura 3C e dati non mostrati). Questi dati inoltre esemplificano perché è meglio per visualizzare i dati di adesione come relativi ad un controllo positivo per coerenza inter-sperimentale.
Per illustrare appieno come funziona questo test, abbiamo effettuato un saggio di adesione dei neutrofili con TNFa-trattato HMVEC-Lung pre-incubate sia con anticorpo di controllo o un anticorpo bloccante E-selectina. E-selectina è espressa sulla superficie della CE dopo il trattamento con TNFa e cattura NEUTRophils dalla vascolatura attraverso interazioni elettrostatiche con glycomolecules presenti sulla superficie dei neutrofili 1,27. Come mostrato in Figura 4A numericamente, graficamente nella Figura 4B e visivamente in figura 4C, il TNFa-trattato HMVEC-Lung pre-incubata con l'anticorpo E-selectina vincolato ~ 75% in meno rispetto alla neutrofili TNFa-trattato HMVEC-Lung pre-incubato con IgG di controllo. Questo suggerisce E-selectina svolge un ruolo importante nella tethering neutrofili per HMVEC-Lung nel nostro saggi di adesione statica.
Figura 1. Esempio di buona salute, monostrati confluenti HMVEC-polmonari. Si noti l'aspetto "acciottolato" e totale confluenza dei monostrati. Le immagini sono state scattate con ingrandimento 4X e 10X su un Fisher Scientific Micromaster microscopio digitale invertito. 
Figura 2. Sangue intero e Polymorphprep strati prima della centrifugazione (A) e separati dopo centrifugazione (B). Noti che dopo centrifugazione, le PBMC formano una banda superiore distinta, mentre i granulociti neutrofili polimorfonucleati () formano una banda inferiore distinto.
Figura 3. Il rapporto tra il numero dei neutrofili e fluorescenza OD 520nm è lineare, la percentuale di adesione dei neutrofili alle TNFa trattati aumenta HMVEC-polmone più neutrofili sono aggiunti; p38-MAPK promuove l'adesione dei neutrofili al TNF-attivati monostrati HMVEC-Lung (A) Grafico. raffigurante la linearapporto r tra fluorescenza OD 520nm e numeri dei neutrofili più di due ordini di grandezza. Un valore R2 di 0,996 indica una relazione lineare tra il numero dei neutrofili e fluorescenza OD 520nm quando 10.000 a 1.000.000 neutrofili sono analizzati. (B) Rappresentazione grafica della aderenza cento quando un numero variabile di neutrofili calceina-marcati sono stati aggiunti trattata o TNFa-trattato ( 100 ng / ml;. 3 ore) monostrati HMVEC-polmonare in piastre da 48 pozzetti (C) HMVEC-Lung monostrati sono stati pre-incubate con l'inibitore p38-MAPK BIRB796 (10 mm) (Axon MedChem) o DMSO (controllo) per 1 hr prima TNFa (100 ng / ml) trattamento per 3 ore mentre in presenza continua di BIRB796 (10 mM). L'adesione relativo è stato calcolato come al punto 4.8. I dati sono espressi come media ± SD. GraphPad Prism spaiati t-test è stato utilizzato per l'analisi statistica (n = 3) (TNFa-trattato vs TNFa-trattato più BIRB796). Valore di p ** <0.01; *** &# 60;. 0.001 Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 4. E-selectina promuove l'aderenza dei neutrofili per TNFa-trattati HMVEC-Lung. HMVEC-Lung state trattate con TNFa [100 ng / ml] per 3 ore. Dopo aver lavato il HMVEC-Lung con RPMI 1640 contenente il 3% di BSA (passo 4.1), sia pecora IgG [50 mcg / ml] (5-001-A, R & D Systems) o anticorpo policlonale E-selectina (PAB) [50 mg / ml] (AF724, R & D Systems) sono stati aggiunti ai pozzetti appropriati per 20 min. I monostrati HMVEC-polmonari sono state poi lavate una volta di più con RPMI-1640 prima di 6 x 10 5 neutrofili sono stati aggiunti per pozzetto per altri 20 min. (A) I calcoli per determinare la percentuale e relativa aderenza sono mostrati. Calceinemissione di luce viene misurata a OD 520 nm. Sfondo OD 520nm medio è derivato da HMVEC-polmonare, in assenza di trattamento TNFa e neutrofili. (B) Rappresentazione grafica della percentuale relativa adesione di neutrofili calceina-etichettati per monostrati HMVEC-polmonari non trattati o TNF-trattato dopo pre-incubazione con il controllo di IgG o E-selectina blocco pAb. I dati sono espressi come media ± SD. GraphPad Prism spaiati t-test è stato utilizzato per l'analisi statistica (n = 3). Calcolato il valore p è stato <0,001. (C) Immagini di neutrofili calceina-etichettati legati a trattati e TNF-trattato monostrati HMVEC-polmonari pre-incubati con il controllo di IgG o E-selectina pAb. Un esempio ben contenente 6 x 10 5 neutrofili prima del lavaggio con PBS è mostrato (prelavaggio). Le immagini al microscopio luce traslucida sono mostrati nella colonna di destra, mentre immagini di fluorescenza dello stesso campo di riferimento, usando un filtro fluoresceinaimpostato, sono riportati nella colonna di sinistra. Le immagini sono state scattate con ingrandimento 10X su una Olympus IX51 microscopio invertito dotato di una fotocamera Retiga 2000R (Q Imaging). PRE lavaggio = totale dei neutrofili fluorescenza OD 520nm (Passo 4.4); POST lavaggio = aderente neutrofili fluorescenza OD 520nm (Passo 4.7); PMN - granulociti polimorfonucleati; avg - media; IgG - pecore di controllo IgG; E-sel/α-E-selectin - E-selectina bloccando pAb. Clicca qui per ingrandire la figura .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Le fasi più critiche per una neutrofili di successo / endoteliale microvascolare saggio di adesione cellulare sono: 1) Uso di basso numero di passaggio (<9), cellule endoteliali sane; 2) Il mantenimento dei neutrofili isolati a bassa densità (cioè <5 x 10 6 cellule / ml) e il loro utilizzo in due ore di isolamento, e 3) il lavaggio Fastidious dei neutrofili calceina AM-etichettati e l'uso dei neutrofili calceina AM-etichettati in modo tempestivo per ridurre al minimo la contaminazione CE e la perdita di calceina dai neutrofili, rispettivamente .
Si aggiunge 8 x 10 5 neutrofili per cm 2 di coltura tissutale ben Superficie (cioè 600.000 neutrofili per pozzetto di una piastra a 48 pozzetti). Troviamo che un ingresso di 600.000 neutrofili è all'interno della gamma lineare del nostro spettrofotometro, e riproduce in modo affidabile i dati quando relativi aderenze sono misurati. Tuttavia, una diminuzione molto simile in neutrofili legame è osservata nelp38-MAPK saggio di inibizione (Figura 3C) quando 40.000, 200.000 o 1.000.000 neutrofili sono aggiunti per pozzetto, suggerendo che meno di 600.000 neutrofili possono essere utilizzati.
Il protocollo descritto nel presente documento valuta solo il grado di attivazione endoteliale in quanto i neutrofili stessi non sono pre-attivato, o trattato in alcun modo, che naturalmente è una opzione se il vostro particolare dosaggio richiede. Mostriamo che l'espressione di E-selectina sulle TNFa-trattata HMVEC-polmone è importante per il fissaggio dei neutrofili in questo saggio, coerente con le precedenti osservazioni 27. Il legame elettrostatico di E-selectina a glycomolecules presenti sulla superficie dei neutrofili sono relativamente deboli, ma in condizioni di flusso, queste interazioni sono pensati per indurre ad alta affinità allegati integrina-mediati tra neutrofili e la ECS 1,7-10. Pertanto, questo test può essere più indicativa delle fasi iniziali di infiammazione che are necessario catturare neutrofili dal sistema vascolare. Tuttavia, abbiamo verificato che i risultati ottenuti con TNFa in questa relazione sono state molto simili, se non identici, a quelli ottenuti utilizzando un modulo di flusso (dati non mostrati), che indica i risultati di questa analisi statica sono fisiologicamente rilevanti e suggerisce che questo test è particolarmente utile per i ricercatori che non hanno accesso ad un sistema di flusso.
Le variazioni del saggio descritto, utilizzando calceina come il fluoroforo rilevazione, sono stati descritti nel 1993 28,29. È importante sottolineare che questi rapporti iniziali scoperto che calceina non ha influenzato la vitalità cellulare e ha avuto il minimo effetto sulla funzione delle cellule in saggi di adesione rispetto ad altri coloranti fluoresceina-derivati 29,30. E 'stato anche riferito che il numero delle cellule è lineare rispetto alla intensità di fluorescenza, in linea con quello che osserviamo (Figura 3A) 28. Rapporti iniziali hanno anche evidenziato che unagrande vantaggio di saggi fluorimetrica è che essi non richiedono radiomarcatura (es. 111 In o 51 Cr) dei leucociti purificati 31-33. I vantaggi e le consistenze di utilizzo calceina cellule AM-etichettati su cellule radioattivi sono stati accuratamente discusso in precedenza 28,29,34. Anche se usiamo calceina AM per etichettare i neutrofili nelle nostre analisi, diversi altri coloranti permeanti cellulari che sono substrati esterasi sono disponibili. Ad esempio, Life Technologies vende CellTrace calceina rosso-arancio (C34852), calceina viola (C34858) e calceina blu (C34853) che eccitano / emettono a diverse lunghezze d'onda. I coloranti diversi hanno i loro vantaggi e svantaggi. Per esempio, il rosso-arancio calceina AM colorante abbia qualche fluorescenza intrinseca prima dell'idrolisi 18.
Usiamo questo metodo per studiare l'attivazione infiammatoria dell'endotelio in risposta a fattori batterici ed endogeni (come TNFa), e THUsiamo HMVECs raccolti da cadaveri, che può essere espansa in quantità sufficiente per fare il test con controlli adeguati e sufficienti replica per eseguire analisi statistiche. Plausibilmente, questo dosaggio potrebbe anche essere usato come strumento per studiare processi di malattia endoteliale basati che coinvolgono legame leucociti all'endotelio microvascolare. Esempi di disturbi che possono essere studiate usando HMVECs dai pazienti includono la malattia polmonare ostruttiva cronica (BPCO), sepsi, malattia infiammatoria intestinale, vasculiti, come ad esempio il autoanticorpi anti-citoplasma dei neutrofili (ANCA)-associate vasculiti, e malformazioni vascolari cerebrali 35-40 . Per esempio, HMVECs potrebbero essere raccolti da esseri umani con vasculiti o sepsi post mortem, o potenzialmente da pazienti con malattia processi basati endoteliali che sono stati sottoposti a una biopsia o resezione chirurgica di un organo, e il loro legame con i neutrofili valutati in condizioni diverse. Tuttavia, questo test richiede sufficientequantità di HMVECs per formare monostrati confluenti, e quindi HMVECs vengono espanse e utilizzate dopo molteplici passaggi. Questo processo di espansione possono determinare variazioni fenotipiche dei CE, che dovrebbero essere presi in considerazione nel progettare studi utilizzando cellule endoteliali primarie di pazienti con malattie EC-based. Tuttavia, la versatilità di questo test permette di essere adattato a molti altri tipi di cellule aderenti e leucociti. In realtà, questo saggio, o varianti di essa, sono stati utilizzati con successo con altri tipi di cellule endoteliali e cellule primarie e linee cellulari, quali monociti, THP-1, Jurkat, HL-60 e U937 28,31,41. Questo dosaggio ha dimostrato di essere rapido, facile da eseguire, riproducibile e altamente sensibile, ed è quindi uno strumento molto utile per rilevare l'attivazione delle cellule endoteliali da mediatori infiammatori.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento UCSF di Cura Anestesia e perioperatoria.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HMVEC-Lung | Lonza | CC-2527 | |
| EGM-2 MV | Lonza | CC-3202 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175-095 | Can be substituted with any vendor |
| 48-well Tissue Culture Plates | BD Falcon | 353078 | |
| PBS (without phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL001 | Can be substituted with any vendor |
| D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | Can be substituted with any vendor |
| RPMI-1640 (without phenol red) | Life Technologies | 11835-030 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield | 1114683 | |
| calcein AM | Life Technologies | C3099 | (0.995 mM) stock soln |
| Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 40 μM filters | VWR | 21008-949 | Can be substituted with any vendor |
| FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer | BMG LABTECH | - |
References
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Collins, T., et al. Transcriptional regulation of endothelial cell adhesion molecules: NF-kappa B and cytokine-inducible enhancers. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 9, 899-909 (1995).
- Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
- Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
- Middleton, J., et al. Transcytosis and surface presentation of IL-8 by venular endothelial cells. Cell. 91, 385-395 (1997).
- Rot, A. Endothelial cell binding of NAP-1/IL-8: role in neutrophil emigration. Immunol. Today. 13, 291-294 (1992).
- Detmers, P. A., et al. Neutrophil-activating protein 1/interleukin 8 stimulates the binding activity of the leukocyte adhesion receptor CD11b/CD18 on human neutrophils. J. Exp. Med. 171, 1155-1162 (1990).
- Laudanna, C., Kim, J. Y., Constantin, G., Butcher, E. Rapid leukocyte integrin activation by chemokines. Immunol. Rev. 186, 37-46 (2002).
- Simon, S. I., Hu, Y., Vestweber, D., Smith, C. W. Neutrophil tethering on E-selectin activates beta 2 integrin binding to ICAM-1 through a mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway. J. Immunol. 164, 4348-4358 (2000).
- Zarbock, A., Ley, K. Mechanisms and consequences of neutrophil interaction with the endothelium. The American Journal of Pathology. 172, 1-7 (2008).
- Muller, W. A. Mechanisms of leukocyte transendothelial migration. Annu. Rev. Pathol. 6, 323-344 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. International Immunopharmacology. 10, 1325-1334 (2010).
- McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330, 362-366 (2010).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
- Soehnlein, O., Lindbom, L., Weber, C. Mechanisms underlying neutrophil-mediated monocyte recruitment. Blood. 114, 4613-4623 (2009).
- Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Prakash, A., Xu, F., Hellman, J. Activation of endothelial TLR2 by bacterial lipoprotein upregulates proteins specific for the neutrophil response. Innate Immun. 18, 602-616 (2012).
- Haugland, R. P., Johnson, I. D., Basey, A. The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labelling Technologies. , 10, (2005).
- Shin, H. S., et al. Bacterial lipoprotein TLR2 agonists broadly modulate endothelial function and coagulation pathways in vitro and in vivo. J. Immunol. 186, 1119-1130 (2011).
- Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Lucero, J., Xu, F., Hellman, J. ERK5 protein promotes, whereas MEK1 protein differentially regulates, the Toll-like receptor 2 protein-dependent activation of human endothelial cells and monocytes. J. Biol. Chem. 287, 26478-26494 (2012).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat. Rev. Immunol. 7, 803-815 (2007).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol. Biol. 370, 23-36 (2007).
- Garcia-Garcia, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. A simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry. J. Vis. Exp. (74), e50410 (2013).
- Kuma, Y., et al. BIRB796 inhibits all p38 MAPK isoforms in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 280, 19472-19479 (2005).
- Westra, J., Kuldo, J. M., van Rijswijk, M. H., Molema, G., Limburg, P. C. Chemokine production and E-selectin expression in activated endothelial cells are inhibited by p38 MAPK (mitogen activated protein kinase) inhibitor RWJ 67657. International Immunopharmacology. 5, 1259-1269 (2005).
- Leeuwenberg, J. F., Jeunhomme, G. M., Buurman, W. A. Adhesion of polymorphonuclear cells to human endothelial cells. Adhesion-molecule-dependent, and Fc receptor-mediated adhesion-molecule-independent mechanisms. Clinical and Experimental Immunology. 81, 496-500 (1990).
- Akeson, A. L., Woods, C. W. A fluorometric assay for the quantitation of cell adherence to endothelial cells. Journal of Immunological Methods. 163, 181-185 (1993).
- Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion. Journal of Immunological Methods. 159, 93-100 (1993).
- De Clerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leucocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. Journal of Immunological Methods. 172, 115-124 (1994).
- Bevilacqua, M. P., Pober, J. S., Wheeler, M. E., Cotran, R. S., Gimbrone, M. A. Interleukin 1 acts on cultured human vascular endothelium to increase the adhesion of polymorphonuclear leukocytes, monocytes, and related leukocyte cell lines. The Journal of Clinical Investigation. 76, (1985).
- Schleimer, R. P., Rutledge, B. K. Cultured human vascular endothelial cells acquire adhesiveness for neutrophils after stimulation with interleukin 1, endotoxin, and tumor-promoting phorbol diesters. J. Immunol. 136, 649-654 (1986).
- Gamble, J. R., Harlan, J. M., Klebanoff, S. J., Vadas, M. A. Stimulation of the adherence of neutrophils to umbilical vein endothelium by human recombinant tumor necrosis factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8667-8671 (1985).
- Braut-Boucher, F., et al. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178, 41-51 (1995).
- Ait-Oufella, H., Maury, E., Lehoux, S., Guidet, B., Offenstadt, G. The endothelium: physiological functions and role in microcirculatory failure during severe sepsis. Intensive Care Medicine. 36, 1286-1298 (2010).
- Andonegui, G., et al. Endothelium-derived Toll-like receptor-4 is the key molecule in LPS-induced neutrophil sequestration into lungs. The Journal of Clinical Investigation. 111, 1011-1020 (2003).
- Sharma, J., et al. Lung endothelial cell platelet-activating factor production and inflammatory cell adherence are increased in response to cigarette smoke component exposure. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302, L47-L55 (2012).
- Deban, L., Correale, C., Vetrano, S., Malesci, A., Danese, S. Multiple pathogenic roles of microvasculature in inflammatory bowel disease: a Jack of all trades. The American Journal of Pathology. 172, 1457-1466 (2008).
- Gross, W. L., Trabandt, A., Csernok, E. Pathogenesis of Wegener's granulomatosis. Annales de Medecine Interne. 149, 280-286 (1998).
- Chen, Y., et al. Evidence of inflammatory cell involvement in brain arteriovenous malformations. Neurosurgery. 62, 1340-1349 (2008).
- Martens, C. L., et al. Peptides which bind to E-selectin and block neutrophil adhesion. J. Biol. Chem. 270, 21129-21136 (1995).
