Summary
A aderência de neutrófilos ao endotélio activado em locais de infecção é um componente integral da resposta inflamatória do hospedeiro. Descritos neste relatório é um ensaio de ligação de neutrófilos, que permite a
Abstract
O endotélio vascular desempenha um papel fundamental na resposta inflamatória. Durante a fase aguda da inflamação, as células endoteliais (ECs) são activados por mediadores hospedeiras ou directamente por componentes microbianos conservados ou moléculas derivadas do hospedeiro de perigo. Activo CEs citocinas, quimiocinas e express de moléculas de adesão que mobilizam, activar e manter leucócitos no local da lesão ou infecção. Os neutrófilos são os primeiros a chegar leucócitos, e aderem ao endotélio através de uma variedade de moléculas de adesão presentes na superfície de ambas as células. As principais funções dos neutrófilos são para eliminar directamente as ameaças microbianas, promover o recrutamento de outros leucócitos através da liberação de fatores adicionais, e iniciar o reparo de feridas. Portanto, o recrutamento e fixação ao endotélio vascular é um passo crítico na iniciação da resposta inflamatória. Neste relatório, nós descrevemos um ensaio de adesão in vitro de neutrófilos utilizandocalceína AM marcada com neutrófilos humanos primários para quantificar a extensão da activação da célula endotelial microvascular sob condições estáticas. Este método tem a vantagem adicional de que as mesmas amostras quantificada por espectrometria de fluorescência também pode ser visualizada directamente através de microscopia de fluorescência para uma avaliação mais qualitativa da ligação de neutrófilos.
Introduction
Desde o endotélio vascular está em contato direto com o sangue circulante, que tem uma localização única para iniciar uma resposta inflamatória rápida durante a infecção ou lesão. As células endoteliais (ECs) de receptores de reconhecimento de padrões express que reconhecem uma variedade de componentes bacterianos conservadas e as moléculas de perigo, e receptores de mediadores inflamatórios hospedeiras, tais como o TNFa. A activação destes receptores induz a ECs para secretar citocinas (por exemplo, IL-6, IL-8, CXCL1 e CCL2), e para sobrerregular moléculas de adesão (por exemplo, E / P-selectina, VCAM-1 e ICAM-1) na sua superfície celular uma , 2. Estas moléculas de todos facilitar a localização de leucócitos aos locais de infecção e lesão a fim de limpar o exército dos agentes infecciosos e iniciar a reparação tecidual 3,4. A resposta de neutrófilos para a infecção envolve uma interação bem coordenada entre o endotélio vascular ea resposta neutrófilos. Após a ativação CE, IL-8 é segregada e que forma um gradiente intravascular sobre o endotélio, que permite que a casa de neutrófilos para o local da infecção ou lesão 5,6. E / P-selectinas mediata captura de neutrófilos e de rolamento através de associações relativamente fracos com glycomolecules na superfície celular de neutrófilos. Estas interacções, juntamente com a ligação de IL-8 aos seus receptores cognatos, facilitar a robusta ligação integrina-mediada e eventual detenção dos neutrófilos sobre a superfície de células endoteliais 7-10. Depois da prisão, os neutrófilos podem migrar para fora da vasculatura para os locais específicos de infecção para eliminar os patógenos directamente, gerar armadilhas extracelulares de neutrófilos para prevenir a disseminação de agentes patogénicos, e promover a cicatrização de feridas libertam factores adicionais que recrutam leucócitos, tais como monócitos, macrófagos e dendríticas células 11-17.
Descritos neste relatório é um método in vitro para quantificar a adesão de neutrófilos para microVascular CEs após a ativação por parte do anfitrião mediador inflamatório TNF. Este ensaio foi concebido para avaliar a ativação de células endoteliais, e não neutrófilos. Neutrófilos humanos primários são primeiro isolados utilizando separação em gradiente de densidade, e depois são marcados com calceína acetoximetilo (AM). Esterases de células vivas no interior da hidrólise calceína AM de calceína a molécula altamente fluorescente com uma excitação de 492-495 nm e emissão de 513-516 nm, 18. Os neutrófilos marcados com fluorescência são então incubadas com monocamadas de EC, e os neutrófilos não aderentes são subsequentemente removidos. A fluorescência das restantes, neutrófilos ligados é então medido usando um espectrofotómetro de fluorescência, e calculada como uma percentagem de neutrófilos de entrada fluorescência total por poço. Este método tem a vantagem adicional de que os neutrófilos ligados marcados com calceína utilizados em espectrofotometria pode ser directamente visualizada utilizando microscopia de fluorescência para dar uma leitura mais qualitativa de ac CEvação. Uma vez que este ensaio é realizado em condições estáticas, apenas os eventos muito iniciais que ocorrem na cascata de adesão dos neutrófilos serão avaliados. Isto é confirmado no presente relatório usando anticorpos bloqueadores de E-selectina para mostrar que a adesão de neutrófilos a TNFa humano tratado com pulmão microvascular CE (HMVEC-pulmão) monocamadas é drasticamente reduzida quando a interacção com a E-selectina é interrompido.
Além de TNFa, temos utilizado com sucesso este ensaio para determinar a extensão da activação CE veia umbilical humana (HUVEC) pelo receptor Toll-like 1/2 agonistas lipoproteína associada a peptidoglicano (PAL), mureína lipoproteína (MLP) e e Pam3Cys ativação HMVEC-Lung por Pam3Cys 19,20. Além disso, foram utilizados com êxito este ensaio com os inibidores da quinase e depois knockdown RNAi mediada de superfície e proteínas citoplasmáticas em HMVEC-pulmonar, sugerindo que esta metodologia é compatível com uma variedade de bioquímica e screening ensaios 20. Em resumo, este ensaio proporciona um fácil de usar, forma reprodutível, mais funcional para aceder ao grau de activação CE por mediadores inflamatórios in vitro.
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Protocol
1. Chapeamento e manutenção das células endoteliais microvasculares
- Descongelar e crescer suas células endoteliais microvasculares acordo com os fabricantes fornecido instruções. Neste protocolo, as células foram cultivadas em EGM-2 media MV (Lonza), e recomenda-se que todas as experiências são realizadas no prazo de duas semanas de descongelamento para minimizar qualquer variação devido ao número de passagens. As experiências são realizadas com HMVEC-pulmonar entre as passagens 4-9.
- Dia 1: Quando as células atingem 80-90% de confluência, trypsinize e ressuspender em 120 mil células por ml. Placa de 36.000 células (0,3 ml) por poço em 48 poços, placas de cultura de tecidos de poliestireno (es). Incluir poços de HMVEC que não serão incubadas com os neutrófilos a fim de obter uma leitura de fluorescência de fundo. A menos que usando placas de 48 poços projetados especificamente para ensaios de fluorescência, linhas alternadas ou colunas irá minimizar qualquer contaminação luz de poços vizinhos. NOTA: Wells pode ser pré-revestida com poli-Lysine, colagénio ou fibronectina.
- Dia 2: Adicionar novas mídias.
- Dia 3: A microscopia de contraste de fase, confirmar que as células são saudável (isto é, a aparência "Cobblestone" e pouco detritos de células), e eles são 100% confluentes (Figura 1). Se as células não são 100% confluentes, mudar os meios de comunicação a cada dia até que estejam prontos.
- Uma vez que as monocamadas HMVEC está pronto para o tratamento, lave as células uma vez com solução salina equilibrada de Hank (HBSS) e adicionar 0,3 ml de meio EGM-2 MV frescas ou meios contendo agonista inflamatória aos poços apropriados. Neste protocolo HMVEC-pulmão foram tratadas com TNFa [100 ng / ml] (PeproTech, Nova Jersey), durante 3 horas uma vez que este é um activador bem descrito de ECs 21. NOTA: Recomenda-se que o tempo a sua experiência para que suas células HMVEC ativadas (Passo 4.1) e Calcein AM neutrófilos marcados (Passo 3.5) está pronto para usar ao mesmo tempo. Ela nos leva aproximadamente 2,5 horas para isolar e rotular neutrophils.
2. Isolamento de neutrófilos utilizando Polymorphprep
- Isolar neutrófilos, como descrito anteriormente 22, ou com uma solução de gradiente de densidade pronta para isolar granulócitos polimorfonucleares de sangue total. Empregando Polymorphprep seguindo o protocolo de Nuzzi, et ai. 2,007 resulta em rendimentos de cerca de 2-3 x 10 neutrófilos por seis ml de sangue total 23. NOTA: Para evitar a lise dos eritrócitos e excessivo, uma sedimentação de dextrano para remover os glóbulos vermelhos podem ser efectuadas antes da centrifugação em gradiente de densidade 24.
- Levar a solução do gradiente de densidade Polymorphprep à TA.
- Recolha de 30 ml de sangue total de um voluntário humano saudável, na presença de um anti-coagulante, como a heparina, citrato ou EDTA. O sangue deve ser usado dentro de 2 horas, e mantida entre 18-22 ° C.
- Camada 5 ml de sangue total ao longo de 5 ml da solução de gradiente de densidade num tubo cónico de 15 ml (
- Centrifugar a 450 g durante 30 min a 18-22 ° C. Certifique-se de acelerar lentamente para cima e para baixo da centrífuga (ou seja, desligar o freio centrífuga), e equilibrar os tubos bem para evitar vibrações para ajudar a reduzir a ativação dos neutrófilos e evitar a mistura de camadas. Tempos de centrifugação mais longos ou força centrífuga maior irá resultar na camada inferior de leucócitos, que contém os neutrófilos, que migram mais para baixo em direcção às células vermelhas do sangue peletizadas.
- Aspirar o plasma e leucócitos banda superior contendo PBMC para evitar a contaminação da camada contendo neutrófilos (Figura 2B).
- Usar uma pipeta serológica 1-2 ml para eliminar a camada inferior contendo leucócitos neutrófilos. Combinar as camadas de neutrófilos em 30 ml de PBS (sem Ca 2 + e Mg 2 +), de 50 mltubo cónico.
- Levar o volume até 50 ml com PBS (sem Ca 2 + e Mg 2 +), e centrifugar a 450 xg durante 10 min a 18-22 ° C.
Nota: Os passos 2.9 e 2.10 são opcionais, mas altamente recomendado.
- Aspirar o sobrenadante. Ressuspender as neutrófilos em 8 ml de água estéril durante 30 segundos para lisar os glóbulos vermelhos, imediatamente adicionar a suspensão de células de 2 ml de 5x em PBS (sem Ca 2 + e Mg 2 +), e misturar suavemente à mão. NÃO incubar células água por mais de 30 segundos desde a morte de neutrófilos significativa pode ocorrer.
- Centrifugar a 250 xg durante 5 min a 18-22 ° C.
- Lave as células uma vez com 10 ml de PBS (sem Ca 2 + e Mg 2 +) e centrifugar novamente a 250 xg durante 5 min a 18-22 ° C.
- Ressuspender as neutrófilos em 10 ml de meio RPMI-1640 (sem vermelho de fenol), e contar as células vivas utilizando o azul de tripanométodo de exclusão de corante e. Evitar períodos prolongados de densidades celulares superiores a 5 x 10 6 por ml uma vez que este pode resultar na activação dos neutrófilos.
3. Neutrófilos Labeling com Calcein AM
- 6 x 10 5 neutrófilos são utilizados por poço de uma placa de 48 poços.
- Após a contagem, a transferência das células ressuspensas para um tubo de 50 ml e dilui-cónica os neutrófilos a 2-4 x 10 6 culas por ml com vermelho fenol livre de RPMI-1640.
- Adicionar solução de calceína AM de 3 uM (ou seja, 2,98 ul de calceína AM Estoque (1 mg / ml) por ml de meio) e misture bem sacudindo suavemente o tubo. Superior a 5 microns de calceína AM resultará no vazamento dos neutrófilos Nota:. Não-fluorescente calceína AM é clivada no interior das células por esterases endógenas para produzir a molécula altamente fluorescente calceína (isto é, as células mortas não ficam fluorescentes).
- Tapar o tubo com folha de alumínio e incubar fou 30 min a 37 ° C no escuro Nota:. tempos de incubação mais longo pode resultar em mais calceína ser libertado a partir dos neutrófilos ao longo do ensaio de adesão.
- Centrifugar a 450 xg durante 5 min a 18-22 ° C, e lavar os neutrófilos 2x com 10 ml de RPMI-1640 (sem vermelho de fenol; pré-aquecido a 37 ° C). Após a ressuspensão das células para a segunda lavagem, passar primeiro os neutrófilos com um filtro estéril de 40 uM para remover aglomerados, e depois centrifugar mais uma vez a 450 xg durante 5 min a 18-22 ° C.
- Ressuspender as neutrófilos em meio RPMI 1640 (sem vermelho de fenol; pré-aquecido a 37 ° C) a 2 x 10 6 por ml neutrófilos.
4. Ensaio de ligação de neutrófilos
- Lavar as monocamadas HMVEC 3x com 0,5 ml de filtro esterilizado (0,22 um) meio RPMI 1640 (sem vermelho de fenol), contendo 3% de BSA por poço.
- Aspirar a mídia e adicione 6 x 10 5 neutrófilos calceína-rotulados (0,3 ml de células suspension), ou 0,3 ml de meio RPMI 1640 (sem vermelho de fenol) sem neutrófilos, aos poços apropriados da placa de 48 poços Nota:. Isto é o equivalente de 8 x 10 5 por cm 2 de neutrófilos.
- Incubar durante 20 min no banho a 37 ° C, 5% CO 2 incubadora.
- Fluorescência de neutrófilos totais (pré-lavagem) a medição da intensidade de fluorescência de cada poço com um comprimento de onda de excitação de 485 nm e um comprimento de onda de emissão de 520 nm (conjunto de filtros de fluoresceína) num Fluostar, ou equivalente, com um espectrofotómetro. Executar esta etapa pouco antes do ponto final de incubação Nota: Neste protocolo, calceína excitação e a detecção da luz emitida foram realizadas a partir do topo dos poços a descoberto, no entanto, ambos também pode ser realizada a partir do fundo dos poços..
- Lavar os poços contendo monocamadas HMVEC e neutrófilos 5x com 0,5 ml por poço de PBS (w / Ca 2 + e Mg 2 +). Remova a mídia e lavagensinvertendo a placa e batendo suavemente sobre toalhas de papel para retirar o líquido restante.
- Adicionar 0,3 ml de volta de RPMI 1640 (sem vermelho de fenol) por poço.
- Aderente a fluorescência de Neutrófilos (lavagem POST): medir a intensidade de fluorescência de cada poço como na etapa 4.4.
- Determinar a aderência e a adesão relativa cento por poço:
Nota: Nesta fase, as imagens dos neutrófilos marcados com calceína podem ser obtidas usando um microscópio de fluorescência equipado com capazes filtros de fluoresceína padrão. As imagens na Figura 4 foram obtidas em um microscópio invertido Olympus IX51 equipado com uma câmera 2000R Retiga (Q Imaging) utilizando Q-Captura software Pro7 (Q Imaging).
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Representative Results
A fim de obter resultados fiáveis e reprodutíveis usando um ensaio de ligação de neutrófilos, é essencial que a saúde e a confluência das células endoteliais microvasculares são óptimas no dia do ensaio, como se ilustra com HMVEC-pulmão na Figura 1. Além disso, é imperativo que o número baixo passagem microvascular ECs são utilizados (ou seja, menos de 9 passagens) e, consequentemente, recomendamos realizar todos os experimentos dentro de duas semanas de descongelamento. A saúde dos neutrófilos também é de extrema importância, especialmente desde calceína AM não será metabolizado para a molécula de calceína fluorescente, se as células são formadas de alguma maneira. Usamos o método de exclusão de azul de tripano, e não proceder com o ensaio se uma proporção significativa das células estão mortas (isto é manchado).
Existem várias formas de isolar os neutrófilos, incluindo em gradiente de densidade e os métodos de separação baseados em colunas de antigénio, e qualquer um dosestes devem ser suficientes para esse procedimento. Optamos por usar a solução de gradiente de densidade ready-made Polymorphprep de Axis-Shield. Como pode ser visto na Figura 2, as PBMC estão presentes na camada de topo, enquanto os neutrófilos estão dentro da camada inferior, após a centrifugação. A camada de PBMC é aspirado, a fim de evitar a contaminação dos granulócitos aquando da sua remoção. É importante notar que o passo 2.9, em que é adicionado água para lisar os glóbulos vermelhos restantes, é opcional. No entanto, ao mesmo tempo que é ideal para remover todos os eritrócitos contaminantes, é crítico que os neutrófilos não se sentam em água pura para mais do que 30 segundos após a qual pode ocorrer a morte considerável.
Finalmente, os neutrófilos são incubadas com calceina AM durante 30 minutos, lavadas e ressuspensas em pré-aquecido (37 ° C) RPMI-1640 (sem vermelho de fenol). É importante a utilização de meios de comunicação sem vermelho de fenol, o que pode interferir com a leitura de fluorescência. O número de neutrophils adicionados aos poços é bastante arbitrária, desde que as leituras de fluorescência de pré-e pós-lavagem estão dentro do intervalo linear do espectrofotómetro, e as diferenças entre os tratamentos que podem promover ou prevenir a aderência de neutrófilos pode ser verificada de forma reprodutível (ver abaixo). Nós descobrimos que a fluorescência OD 520nm está dentro do intervalo linear quando 10.000 a 1.000.000 neutrófilos marcados são analisados (Figura 3A). Curiosamente, nós também descobrimos que a percentagem de adesão aumenta à medida que mais neutrófilos são adicionados a monocamadas HMVEC-pulmão tratadas com TNF-a [100 ng / ml] durante 3 horas (Figura 3B). Escolhemos a incubar a HMVEC-pulmão e neutrófilos marcados com calceína em conjunto durante 20 min, uma vez que descobrimos que a percentagem de adesão não aumenta significativamente a partir deste ponto de tempo (dados não mostrados). De nota, neste ensaio foi utilizado padrão, poliestireno claro placas de 48 poços e descobriram que o nível de fluorescência de cross-over entre leituras tele poços não ser superior a 0,5% da entrada total de fluorescência (dados não mostrados). No entanto, recomendamos o uso de placas de 48 poços propositadamente feitas para leituras de espectrofotometria de fluorescência para experiências mais sensíveis, se disponível, ou pelo menos, projetando sua experiência para minimizar leituras cross-over (ver passo 1.2).
Para demonstrar que o número de neutrófilos adicionados aos poços é bastante arbitrária, desde que o número adicionado está dentro do intervalo linear do espectrofotómetro, foi realizado um ensaio de adesão dos neutrófilos com TNFa tratada HMVEC-pulmão na ausência ou na presença do p38 inibidores de MAPK BIRB7906, utilizando quantidades variáveis de entrada dos neutrófilos (por exemplo, 40.000 / poço, 200,000 / 1,000,000 bem ou / poço) 25. p38 MAPK tem sido demonstrado anteriormente que o necessário para a expressão de E-selectina em TNFa humano tratado com CEs, e a sua inibição deve, portanto, reduzir a ligação de neutrófilos HMVEC-Lung TNFa activada26. Na verdade, isso é o que nós observamos (Figura 3C). Apesar de achar que o percentual de adesão aumenta à medida que mais neutrófilos são adicionados, ea porcentagem de adesão podem ser diferentes entre experimentos, devido a vários fatores, como variações inter-doadores, a qualidade dos neutrófilos ea densidade de HMVEC em confluência, a adesão relativa entre as condições mantém-se relativamente constante, em cada experiência independente, independente do número de neutrófilos adicionados (Figura 3C e dados não mostrados). Estes dados também exemplificar porque é melhor para exibir os dados de adesão como relativamente a um controlo positivo para a consistência inter-experimentais.
A fim de ilustrar completamente como este ensaio funciona, realizou-se um ensaio de adesão dos neutrófilos com TNFa tratada HMVEC-pulmão pré-incubadas ou com anticorpo de controlo ou de um anticorpo bloqueador de E-selectina. A E-selectina é expressa na superfície CE após o tratamento com TNFa e captura neutrophils da vasculatura através de interacções electrostáticas com glycomolecules presentes na superfície dos neutrófilos 1,27. Como mostrado na Figura 4A numericamente, graficamente na Figura 4B e visualmente na Figura 4C, o TNFa tratada HMVEC-pulmão pré-incubados com o anticorpo de E-selectina ligado ~ 75% menos do que os neutrófilos tratados com TNFa HMVEC-pulmão pré-incubadas com IgG de controlo. Isto sugere que a E-selectina desempenha um papel importante em amarrar neutrófilos HMVEC-pulmão no nosso ensaio de adesão estático.
Figura 1. Exemplo de saudáveis, monocamadas confluentes HMVEC-pulmão. Observe a aparência "calçada" total e confluência das monocamadas. As imagens foram tomadas com ampliação de 4x e 10x em uma Fisher Scientific Micromaster microscópio digital invertida. 
Figura 2. O sangue total e Polymorphprep camadas antes da centrifugação (A) e separadas após centrifugação (B). Note-se que, após a centrifugação, as PBMC formar uma banda superior distinto, enquanto os granulócitos polimorfonucleares (neutrófilos) que formam uma banda inferior distinta.
Figura 3. A relação entre o número de neutrófilos e fluorescência OD 520nm é linear, a adesão por cento de neutrófilos para TNF-tratada aumenta HMVEC-pulmão como mais neutrófilos são adicionados; p38 MAPK promove a aderência de neutrófilos para monocamadas HMVEC-pulmão TNF-ativados (A) Gráfico. representando a linear relação entre a fluorescência OD 520nm e os números de neutrófilos ao longo de duas ordens de magnitude. Um valor de R2 de 0,996 indica uma relação linear entre o número de neutrófilos e de fluorescência OD 520nm quando 10.000 a 1.000.000 neutrófilos são analisados. (B) representação gráfica da percentagem de adesão quando números variados de neutrófilos marcados com calceína foram adicionados a não tratada ou tratada com TNFa ( 100 ng / ml, 3 horas.) monocamadas HMVEC-pulmonares, em placas de 48 poços (C) HMVEC-Lung monocamadas foram pré-incubadas com o inibidor de p38 MAPK BIRB796 (10 mM) (Axon medchem) ou DMSO (controlo) para 1 hora antes do TNF (100 ng / ml) durante 3 horas de tratamento, enquanto na presença contínua de BIRB796 (10 mM). A aderência relativa foi calculada como descrito no passo 4.8. Os dados são expressos como a média ± DP. GraphPad Prism teste t desemparelhado foi utilizado para a análise estatística (n = 3) (TNF-tratada contra TNF-tratado mais BIRB796). Valor de p ** <0,01; *** &# 60;. 0.001 Clique aqui para ver a figura maior .
Figura 4. Selectina E promove a aderência de neutrófilos ao TNF-tratada HMVEC-pulmão. HMVEC-pulmão foram tratadas com TNFa [100 ng / ml] durante 3 horas. Após lavagem da HMVEC-pulmonar com meio RPMI 1640 contendo 3% de BSA (passo 4.1), ou IgG de ovelha [50 ug / mL] (5-001-A, R & D Systems) ou um anticorpo policlonal de E-selectina (PAB) [50 mg / ml] (AF724, R & D Systems), foram adicionados aos poços apropriados, durante 20 min. As monocamadas HMVEC-pulmão foram então lavadas uma vez mais com meio RPMI-1640 antes de 6 x 10 5 neutrófilos foram adicionados por poço por um período adicional de 20 min. (A) Os cálculos para determinar a percentagem e aderência relativa são mostrados. Calceina emissão de luz é medida a OD 520 nm. Fundo média OD 520nm é derivado de HMVEC-pulmão na ausência de tratamento de TNFa e neutrófilos. (B) representação gráfica da percentagem de aderência relativa de neutrófilos marcados com calceína para monocamadas HMVEC-pulmão não tratadas ou tratadas com TNFa após pré-incubação com qualquer controle IgG ou E-selectina bloqueio do PAB. Os dados são expressos como a média ± DP. GraphPad Prism teste t desemparelhado foi utilizado para a análise estatística (n = 3). Calculado Valor de p foi <0,001. Imagens (C) dos neutrófilos marcados com calceína ligados a monocamadas HMVEC-pulmão não tratadas e tratadas com TNF pré-incubadas ou com IgG de controlo ou de E-selectina pAb. Um exemplo bem contendo 6 x 10 5 neutrófilos antes da lavagem com PBS, é mostrado (lavagem PRE). Imagens translúcidas microscopia de luz são mostrados na coluna da direita, enquanto imagens de fluorescência do mesmo campo de referência, utilizando um filtro de fluoresceínadefinido, são mostrados na coluna do lado esquerdo. As imagens foram tiradas no aumento de 10x em um microscópio invertido Olympus IX51 equipado com uma câmera 2000R Retiga (Q Imaging). PRE lavagem = total de neutrófilos fluorescência OD 520nm (Passo 4.4); POST lavagem = aderente neutrófilos fluorescência OD 520nm (Passo 4.7); PMN - granulócitos polimorfonucleares; médio - média; IgG - sheep controle IgG; E-sel/α-E-selectin - E-selectina bloqueio do PAB. Clique aqui para ver a figura maior .
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Discussion
Os passos mais críticos para uma bem-sucedida de neutrófilos / ensaio de adesão da célula endotelial microvascular são: 1) O uso do baixo número passagem (<9), células endoteliais saudáveis; 2) Manter os neutrófilos isolados com uma densidade baixa (ou seja, <5 x 10 6 células / ml) e usá-los dentro de duas horas de isolamento, e 3) lavagem Fastidious dos neutrófilos calceína AM-rotulados e uso dos neutrófilos calceína AM-rotulados em tempo hábil para minimizar a contaminação CE e perda de calceína dos neutrófilos, respectivamente .
Acrescentamos 8 5 x 10 neutrófilos por cm2 de área de cultura de tecidos bem superfície (ou seja, 600.000 neutrófilos por cavidade de uma placa de 48 poços). Nós descobrimos que uma entrada de 600.000 neutrófilos está dentro do intervalo linear da nossa espectrofotómetro, e reproduz dados de forma confiável quando aderências relativos são medidos. No entanto, uma diminuição muito semelhante em neutrófilos de ligação é observada noensaio de inibição de p38 MAPK (Figura 3C) quando 40.000, 200.000 ou 1.000.000 de neutrófilos são adicionados por poço, sugerindo que menos de 600.000 neutrófilos podem ser usadas.
O protocolo aqui descrito apenas avalia a extensão da ativação endotelial desde os neutrófilos em si não são pré-ativadas, ou tratados de qualquer maneira, o que é, naturalmente, uma opção se o seu ensaio especial exige. Nós mostramos que a expressão de E-selectina em TNF-tratada HMVEC-pulmão é importante para a ligação dos neutrófilos neste ensaio, consistente com as observações 27 anteriores. A ligação electrostática de E-selectina para glycomolecules presentes na superfície dos neutrófilos são relativamente fracos, mas sob condições de fluxo, estas interacções são pensados para induzir as ligações mediadas por integrina de alta afinidade entre os neutrófilos e CEs 1,7-10. Assim, este ensaio pode ser mais indicativa dos passos iniciais na inflamação que are necessário captar neutrófilos da vasculatura. No entanto, verificámos que os nossos resultados obtidos com TNFa neste relatório foram muito semelhantes, se não idênticas, os obtidos utilizando um módulo de fluxo (dados não apresentados), indicando que os resultados deste ensaio estático são fisiologicamente relevante e sugere que este teste é particularmente útil para pesquisadores que não têm acesso a um sistema de fluxo.
Variações do ensaio descrito, utilizando calceína como o fluoróforo de detecção, foram descritos pela primeira vez em 1993 28,29. Mais importante, estes relatos iniciais descobriram que calceína não afectou a viabilidade das células e que teve o menor efeito sobre a função celular em ensaios de adesão quando em comparação com outros corantes derivados de fluoresceína 29,30. Também foi relatado que o número de células é linear em relação à intensidade de fluorescência, de acordo com o que observamos (Figura 3A) 28. Relatórios iniciais também destacou que aimportante vantagem de ensaios fluorométricos é que eles não necessitam de radiomarcação (por exemplo, 111 In ou 51 Cr) dos leucócitos purificadas 31-33. As vantagens e consistência do uso de células AM-rotulados calceína sobre as células radioativos têm sido exaustivamente discutido anteriormente 28,29,34. Apesar de usarmos calceína AM para rotular os neutrófilos nos nossos ensaios, vários outros corantes permeantes de células que são substratos de esterases estão disponíveis. Por exemplo, Life Technologies vende CellTrace calceína vermelho-laranja (C34852), calceína violeta (C34858) e calceína azul (C34853) que excitam / emitem em diferentes comprimentos de onda. Os diferentes corantes cada um tem suas vantagens e desvantagens. Por exemplo, o corante vermelho-alaranjado AM a calceína tem alguma fluorescência intrínseca, antes da hidrólise 18.
Usamos este método para estudar a ativação inflamatória do endotélio em resposta a fatores bacterianos e endógenos (como TNFa), e th-utilizar HMVECs recolhidos de cadáveres, que pode ser expandida numa quantidade suficiente para fazer o ensaio com controlos apropriados e suficientes repetições para efectuar análises estatísticas. É concebível, este ensaio também pode ser utilizado como uma ferramenta para o estudo de processos de doenças baseadas endotelial, que envolve a ligação dos leucócitos ao endotélio microvascular. Exemplos de doenças que podem ser estudados utilizando HMVECs de pacientes incluem a doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC), sepsia, doença inflamatória do intestino, vasculite, tais como a auto-anticorpos anti-citoplasmática de neutrófilos (ANCA)-vasculites associadas, e malformações vasculares cerebrais 35-40 . Por exemplo, HMVECs poderiam ser recolhidos a partir de seres humanos com septicemia ou vasculites post-mortem, ou, eventualmente, de doentes com base em processos de doenças endoteliais que foram submetidos a uma biópsia ou ressecção cirúrgica de um órgão, e a sua ligação aos neutrófilos avaliadas sob condições diferentes. No entanto, este ensaio requer suficientesquantidades de HMVECs para formar monocamadas confluentes e, portanto, HMVECs são expandidas e utilizadas após várias passagens. Este processo de expansão pode levar a alterações fenotípicas na ECs, que precisam ser levados em conta na elaboração de estudos utilizando ECs primário de pacientes com doenças de base CE. No entanto, a versatilidade deste ensaio permite a sua adaptação a muitos outros tipos de células aderentes e leucócitos. Na realidade, neste ensaio, ou variantes do mesmo, ter sido usado com sucesso com outros tipos de células endoteliais, e de células primárias e as linhas de células, tais como monócitos, THP-1, Jurkat, HL-60 e U937 28,31,41. Este ensaio demonstrou ser rápido, fácil de realizar e reprodutível, e altamente sensível, e é, portanto, uma ferramenta muito útil para detectar a activação da célula endotelial por mediadores inflamatórios.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Anestesia e Cuidados perioperatórios UCSF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HMVEC-Lung | Lonza | CC-2527 | |
| EGM-2 MV | Lonza | CC-3202 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175-095 | Can be substituted with any vendor |
| 48-well Tissue Culture Plates | BD Falcon | 353078 | |
| PBS (without phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL001 | Can be substituted with any vendor |
| D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | Can be substituted with any vendor |
| RPMI-1640 (without phenol red) | Life Technologies | 11835-030 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield | 1114683 | |
| calcein AM | Life Technologies | C3099 | (0.995 mM) stock soln |
| Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 40 μM filters | VWR | 21008-949 | Can be substituted with any vendor |
| FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer | BMG LABTECH | - |
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