Microfabrication di Patterns Oro nanoporosi per Cell-materiali Interaction Studies

Summary

Segnaliamo su tecniche per micropattern nanoporosi film sottili di oro tramite la stampa stencil e fotolitografia, così come i metodi di cellule di coltura, su modelli di microfabbricati. Inoltre, si descrivono metodi di analisi di immagine per caratterizzare morfologia del materiale e le cellule in coltura mediante scansione elettronica e tecniche di microscopia a fluorescenza.

Abstract

Materiali nanostrutturati con dimensioni caratteristiche di decine di nanometri hanno migliorato le prestazioni delle diverse tecnologie, tra cui le celle a combustibile, biosensori, rivestimenti dei dispositivi biomedicali e strumenti di consegna della droga. Oro nanoporous (np-Au), prodotto da un processo di auto-assemblaggio nano-scala, è un materiale relativamente nuovo che presenta un'ampia area superficiale effettiva, elevata conducibilità elettrica, e l'attività catalitica. Queste proprietà hanno reso np-Au un materiale interessante per la comunità scientifica. Maggior parte degli studi su NP-Au impiegano campioni macro scala e concentrarsi sulla scienza fondamentale della materia e delle sue applicazioni catalitiche e sensore. Gli esemplari macro scala limitano il potenziale di NP-Au in sistemi miniaturizzati, inclusi i dispositivi biomedici. Al fine di risolvere questi problemi, abbiamo inizialmente descriviamo due metodi diversi per micropattern np-Au film sottili su substrati rigidi. Il primo metodo utilizza mascherine stencil manualmente-prodotti per la creazione di millimetro scala modelli NP-Au, while il secondo metodo utilizza decollo fotolitografia per modelli modello sub-millimetrica scala. Come i film sottili np-Au sono ottenute tramite il processo sputtering-deposizione, che siano compatibili con le tecniche convenzionali di microfabbricazione, quindi suscettibili di integrazione facile in microsistemi. Questi sistemi includono elettricamente indirizzabili piattaforme biosensore che beneficiano di elevata superficie effettiva superficie, conducibilità elettrica, e l'oro-tiolo-based bioconjugation superficie. Descriviamo coltura cellulare, immunostaining, e le tecniche di elaborazione di immagini per quantificare l'interazione del np-Au con cellule di mammifero, che è un parametro importante per alcune prestazioni biosensori. Ci aspettiamo che le tecniche qui illustrate dovranno favorire l'integrazione delle np-Au in piattaforme a diverse scale di lunghezza e in numerose applicazioni, tra cui biosensori, sistemi di stoccaggio di energia, e catalizzatori.

Introduction

Protocol

1. Nanoporoso Oro Fabrication

1. Substrati puliti in soluzione Piranha
   1. Aggiungere 25 ml di perossido di idrogeno (30%) di acido solforico 100 ml (96%) in un piatto di cristallizzazione e scaldare la miscela a 65 ° C su una piastra. ATTENZIONE: I liquidi sono estremamente corrosivi e devono essere maneggiati con cura. La soluzione esausta non deve essere conservata in un contenitore sigillato, come può esplodere.
   2. Luogo di 1 pollice da vetrini da 3 pollici nella miscela con pinze resistenti agli acidi e quindi ripulirli per 10 min. Utilizzare una barca immunoistochimica porcellana per batch pulizia piccole lamelle. Trattare piccole coprioggetto con plasma ad aria a 10 W per 30 secondi prima di immergerlo nella soluzione.
   3. Sciacquare i campioni puliti in piatti di cristallizzazione sotto corrente (DI) di acqua deionizzata per 3 min. Campioni in piega con una pistola di azoto oltre privi di pelucchi asciugamani.
2. Preparare maschera stencil (Metodo 1: utilizzare questa per la creazione di modelli di millimetro scala)
   1. Punch 250 micron di spessore lastre in elastomero di silicone con biopsia pugni e / o incidere fuori regioni con un bisturi su una superficie di plastica semi-dura. Pulire le lastre in elastomero trasformati in 70% di isopropanolo e asciugare con pistola azoto.
   2. Posizionare il foglio perforato su una sfilacciato asciugamano camera bianca e allineare i coprioggetti piranha-puliti sopra lo stencil con la superficie del campione verso lo stencil.
3. Modello lift-off photoresist (Metodo 2: utilizzare questo per creare pattern sub-millimetrica scala)
   1. Posizionare un piranha-pulito vetrino da microscopio a girare Chuck e soffiare via le particelle con la pistola di azoto. Pipettare 1,5 ml di promotore di adesione (esametildisilazano) sul vetrino utilizzando una pipetta di plastica. Stendere il promotore facendo girare la slitta successivamente a 500 rpm per 5 sec e 1.500 rpm per 30 sec. Cuocere il vetrino su una piastra riscaldante a 115 ° C per 7 minuti e lasciate raffreddare per 5 minuti.
   2. Dispensare 4 ml di photoresist sul vetrino (3 pollici by 1 pollice). Stendere il photoresist facendo girare la diapositiva con lo stesso protocollo per il promotore di adesione. Cuocere il photoresist su una piastra riscaldante a 115 ° C per 1,5 minuti e lasciate raffreddare per 10 minuti.
   3. Esporre il photoresist vetrino rivestito con luce UV (intensità: 22 mW / cm ²⁾ attraverso una maschera di trasparenza per 15 sec. Cuocere il fotoresist su una piastra riscaldante a 115 ° C per 1,5 minuti e attendere 45 min. Sciogliere il photoresist esposto nel sviluppatore per almeno 3,5 min. Sciacquare abbondantemente con acqua deionizzata. Ispezionare i modelli sviluppati sotto un microscopio ottico.
4. Deposito metalli precursori per la produzione di film sottili np-Au
   1. Caricare i campioni in una macchina di sputtering che può depositare autonomamente oro, argento e cromo. Deposito a pulire i campioni per 90 sec a 50 W con 25 mTorr argon atmosfera di elaborazione prima di iniziare la deposizione di metallo.
   2. Sputtering cromo per 10 minuti a 300 W fino a 10 anni mTorr argon. Polverizzazione catodica oro per 90 secondi a 400 W ONUder 10 mTorr argon. Co-sputtering oro e d'argento per 10 minuti con l'argento a 200 W e di potenza Au a 100 W. Spegnere oro polverizzazione catodica fonte di circa 10 secondi prima di spegnere l'argento sputtering fonte.
5. Ottenere microdisegnature metallici precursori
   1. Sonicare campioni photoresist rivestite in ~ 180 ml di spogliarellista photoresist per 10 cicli di 20 sec sonicazione e 2 minuti di pausa tra i cicli. Lavare i campioni con acqua deionizzata e asciugare con una pistola di azoto. Ispezionare i modelli in metallo sotto un microscopio.
   2. Sbucciate lo stencil elastomero da campioni rivestiti non photoresist con due pinzette per rivelare il metallo depositato.
6. Dealloy precursore metallico e modificare nanostruttura tramite trattamento termico
   1. Riempire un bicchiere di vetro da 200 ml con 170 ml di acido nitrico (70%) e mantenere la temperatura della soluzione a 55 ° C su una piastra. ATTENZIONE: L'acido nitrico è estremamente corrosivo e deve essere maneggiato con equipaggiamento protettivo. Trattare piccole coprioggetto con plasma ad aria a 10 W per 30 secondi prima di immersione in acido nitrico. Luogo di 1 pollice da vetrini da 3 pollici nel bicchiere con pinze resistenti agli acidi e dealloy loro per 15 min. Utilizzare una barca immunoistochimica porcellana per batch dealloying piccole lamelle.
   2. Sciacquare i campioni dealloyed da successivamente immergendole in due bicchieri pieni di acqua DI fresca tre volte. Conservare i campioni in acqua deionizzata e sostituire l'acqua con acqua DI fresca ogni giorno per almeno una settimana. Campioni in piega con una pistola di azoto oltre asciugamani filacciosi prima dell'uso.
   3. Caricare campioni su un wafer di silicio pulita in un rapido apparecchiature per il trattamento termico. Regolare la temperatura tra 200 ° C e 450 ° C e la velocità di rampa di 10 ° C / sec. Esporre i campioni alla temperatura prescritta per 10 min sotto azoto ambiente. Lasciare la camera di fresco (<100 ° C) e rimuovere i campioni. In alternativa, inserire lentamente i campioni sulla piastra per il trattam termicoent.

2. Colture Cellulari

1. Preparare i campioni np-Au per la coltura cellulare
   1. Luogo np-Au campioni in piatti di polistirolo e il trattamento con plasma ad aria a 10 W per 30 sec e trasferire i campioni di piastre di coltura tissutale a 24 pozzetti.
   2. Aggiungere 500 microlitri mezzi di coltura completi (Modified Eagle Medium di Dulbecco con il 10% di siero fetale bovino e 1% di penicillina / streptomicina) in ciascun pozzetto. Conservare in un incubatore umidificato a 37 ° C e 5% di CO ₂ fino semina delle cellule (<1 ora).
2. Mantenere, di passaggio, e di semi di cellule
   1. Mantenere le cellule di interesse (in questo caso 3T3-NIH fibroblasti o astrociti murini) a T75 palloni con terreni di coltura e di passaggio quando le cellule sono il 70% confluenti.
   2. Per passaging le cellule, rimuovere i supporti dal pallone, lavare due volte con 10 ml di tampone fosfato (PBS), aggiungere 2 ml di 1x tripsina / EDTA e incubare fino a quando il distacco delle cellule (~ 5 min). Aggiungere 3 ml di mezzi freschi ecentrifugare a 1200 rpm per 3 min. Aspirare il surnatante e sospendere il pellet in 2 mezzi ml.
   3. Rimuovere il supporto spesi dai pozzetti e seme le cellule sulla vetrini ad una densità di 25.000 cellule / cm ² con un volume finale di 1 ml. Agitare la piastra di coltura avanti-indietro e destra-sinistra per garantire un rivestimento uniforme delle cellule sugli esemplari. Incubare le cellule fino al momento dell'analisi durante il controllo quotidiano.

3. Cellulare e Analisi Materiale

1. Colorare le cellule di visualizzare citoscheletro e nuclei
   1. Rimuovere i supporti spesi dai pozzetti e lavare le cellule due volte con PBS. Fissare le cellule in paraformaldeide 4% in PBS per 15 min.
   2. Preparare la soluzione di colorazione 300 nM Alexa Fluor 488 phalloidin in PBS con 1% di albumina di siero bovino.
   3. Lavare le cellule due volte con PBS, e li permeabilize in 500 microlitri 0,1% Triton X-100 in PBS per 5 min.
   4. Lavare le cellule due volte con PBS e trasferirli da pulire pozzetti. Blot 50 - 200 ml soluzione di colorazione sui campioni e conservare al buio per 20 min.
   5. Lavare le cellule con PBS e contro-macchia con 3 Nm di DAPI in PBS per 5 min.
   6. Lavare le cellule con PBS, e tuffo in acqua deionizzata prima di montare su vetrini di copertura in vetro con supporti di montaggio e sigillare con smalto trasparente.
2. Acquisire immagini di campioni np-Au e colture cellulari su superfici np-Au
   1. Superfici Immagine np-Au con microscopio elettronico a scansione (SEM) con 50.000 X ingrandimento a 10 kV elettrone energia utilizzando rivelatore di elettroni secondari.
   2. Cattura immagini cellulari composite in punti diversi i campioni utilizzando un microscopio invertito a fluorescenza con ingrandimento 10X con i cubetti di filtro appropriate.
3. Le immagini del processo per determinare la morfologia dei pori e delle cellule
   1. Aprire le immagini in ImageJ e suddivisa in singoli canali se applicabile. Convertire le immagini a 8-bit, sottrarre il fondo, e lisciare loro dai filtri d'medianang. Regolare la soglia manualmente o con built-in di soglia algoritmi per evidenziare i pori (vuoti) e corpi cellulari / nuclei.
   2. Utilizzare il comando spartiacque per separare i pori unite o cellule. Impostare i parametri di analisi delle particelle ed eseguire il comando per estrarre il numero di particelle, area media, e la copertura per cento di particelle. Usare le immagini di cellule DAPI macchiati per il conteggio delle cellule e le immagini di cellule falloidina macchiati per quantificare copertura cellulare per cento.
   3. Modificare i file di macro inclusi per eseguire analisi in batch di immagini multiple.

Representative Results

La figura 1 illustra le principali fasi procedurali, tra cui la creazione dei modelli NP-Au, coltura delle cellule, quantificando la nanostruttura, e la caratterizzazione morfologie cellulari. Lo stencil elastomero mostrato in Figura 2a (in alto) è utilizzato per la creazione dei modelli NP-Au mostrati nelle immagini sottostanti. Figura 2b è una fotografia della barca in porcellana per i campioni di elaborazione batch. Figura 2c mostra il cambiamento di colore dei modelli di metallo depositato prima e dopo dealloying. La finitura argentata (prima dealloying) è dovuto al contenuto di argento ricco di lega. Upon dealloying, il film acquista una tinta visibilmente arancio-marrone. Figura 2d illustra le caratteristiche più fini prodotte da patterning fotolitografica del metallo. Differenti morfologie dei pori può essere ottenuta mediante trattamento termico di NP-Au film ^9, come mostrato in Figura 3. L'immagine della sezione trasversale (Figure 3) rivela se i film sono dealloyed uniformemente attraverso lo spessore del film. Le immagini SEM possono essere segmentati (soglia) in immagini binarie (Figura 3 fila in basso) per determinare la dimensione e la percentuale di copertura da vuoti (codice 1). Una immagine rappresentativa fluorescenza delle cellule adese astrociti murine in coltura su una superficie np-Au è mostrato in Figura 4. I singoli canali dell'immagine può essere divisa e segmentata per produrre immagini binarie per l'analisi delle interazioni cellula-materiale. Immagini citoscheletro segmentate possono essere utilizzati per quantificare di cella e di copertura superficiale (Codice 2), mentre le immagini nucleo cellulare segmentate sono utili per la conta cellulare (codice 3). Figura 5 è un riepilogo visivo di guasti comuni nella fabbricazione di strutture np-Au , compresi scarsa adesione pellicola, assenza di porosità, e trattamento termico eccessivo.

Figura 1. Rappresentazione schematica delle principali fasi di lavorazione. Substrati acidi puliti sono sia mascherato con una maschera stencil manualmente-cut o fotolitograficamente-fantasia strato fotosensibile. Gli obiettivi d'oro e argento sono contemporaneamente atomizzate per creare una lega d'oro argento ricchi, dove le maschere trasferiscono gli schemi sui substrati di vetro. Modelli in lega sono dealloyed in acido nitrico per creare l'oro nanoporoso (np-Au) modelli. Cellule di interesse sono coltivate sui campioni e vengono esposte con fluorescenza e microscopi a scansione elettronica per estrarre sia le caratteristiche biologiche e morfologiche. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 2. Immagini ottiche A (a) stampino di silicone (in alto) utilizzato per patterning precursore lega oro-argento, che produce la serie NP-Au (in basso);. (B) barca in porcellana per i campioni di elaborazione batch, (c), colore tipico di atomizzate AuAg lega (in alto) e il film dealloyed (in basso), e (d) più alta risoluzione modelli NP-Au prodotte da mascheratura fotolitografica durante la deposizione oro-argento.

Figura 3. Immagini SEM NP-Au (riga superiore) e le corrispondenti immagini segmentate (fila in basso) che vengono utilizzati per l'estrazione di dimensione media di un vuotoND per cento di copertura vuoto. immagine SEM (in alto a destra) di un spaccati np-Au esempio visualizza struttura porosa omogenea attraverso lo spessore del film. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 4. Un nucleo di immagine (blu) cellula colorata, che è segmentato estrarre copertura cellulare per cento dal canale verde e di cellule dal blu composito f-actina (verde) e.

Figura 5. Immagini di guasti tipici. (A) delaminazionedurante dealloying causa di uno strato adesivo insufficiente di cromo; (b) assenza di porosità dopo dealloying dovuto al contenuto di argento insufficiente nella lega, e (c) sinterizzazione completa di NP-Au pellicola a causa della temperatura di trattamento termico troppo elevata.

Discussion

Dimostriamo due tecniche diverse per micropattern np-Au film per espandere l'uso di questi film in microsistemi e studi biologici. Deposito a spruzzo oro e argento è un metodo versatile per creare modelli np-Au, come sputtering è compatibile con i processi convenzionali di microfabbricazione e la composizione della lega e lo spessore può essere facilmente controllato variando i poteri individuali pistola sputtering (per obiettivi d'oro e d'argento) e il tempo di deposizione rispettivamente. Tipico film di np-Au spessori vanno da 200 nm a 2 micron. Il metodo stencil (metodo 1, figura 2a) con biopsia pugni e bisturi permette di creare modelli di millimetro scala eludere la necessità di fotolitografia. Modelli più complicati possono essere prodotti da una taglierina laser programmabile. Il compliant silicone elastomero stencil autoritratti aderisce su superfici di vetro, impedendo così la deposizione di metallo sotto la maschera e aumentare la risoluzione del modello. Tuttavia, f piùeatures (<1 mm) sono tipicamente difficili da produrre con questo metodo, come lo spessore dello stencil impedisce il deposito di metallo uniforme attraverso le aperture della maschera. Le applicazioni che richiedono alta risoluzione funzione può essere raggiunto con patterning fotolitografica (metodo 2, Figura 2d). Le maschere di trasparenza per il trasferimento di modelli tramite fotolitografia possono essere ottenuti da diverse aziende (ad esempio Città di uscita, Bandon, OR) e sono alternative economiche ai maschere cromo-vetro quando le dimensioni minime funzione desiderata sono più di ~ 20 micron. La deposizione di metallo sulla stencil compliant talvolta porta al distacco dello stencil dal substrato a causa dello stress generazione non uniforme. Abbiamo tipicamente limitare il problema assicurando lo stampino al substrato sottostante utilizzando un nastro poliimmide ai bordi.

Quando i campioni più piccoli, come i vetrini circolari (12 mm di diametro), tipicamente utilizzati nei nostri studi, le barche di porcellana mostrati in (es. pulizia, dealloy) più piccoli campioni. L'elaborazione batch di campioni aumenta l'uniformità della nanostruttura prodotta attraverso diversi campioni. Piccoli campioni tendono a galleggiare quando immergendo in piranha o dealloying soluzioni, come diventano idrofobi se conservato in aria. Prima di campioni di ogni passo che richiede di essere immersi in liquidi, al plasma trattarli (10 W per 30 sec) rende la superficie del vetro idrofila e aiuta a mitigare il problema galleggiante. Il problema più comune nella produzione di pellicole NP-Au è delaminazione durante la fase dealloying. Questo è in genere attribuita all'accumulo trazione dovuto il volume del ritiro durante dealloying ^21. Per prevenire delaminazione, è importante avere una forte adesione tra il film np-Au e il substrato. Ciò è ottenuto mediante un spessore sufficiente cromo (~ 150 nm) e intermedi gvecchio strato (~ 200 nm). Film depositati dovrebbero apparire chiaro a grigio scuro quando visto dal lato posteriore di un substrato trasparente. Il film sfogliato visualizzata in figura 5a è un buon esempio, come il retro della pellicola non dovrebbe essere simile - la finitura dorata indica che lo strato di cromo non è sufficientemente spessa per assicurare una forte adesione. Un altro motivo per delaminazione superficie del campione è impuro, quindi è essenziale superfici piranha-pulito prima di deposizione metallica. Inoltre, è importante accertarsi che il fotoresist è completamente sviluppato prima di depositare il film, come qualsiasi fotoresist residuo impedisce l'adesione di metallo depositato sulla superficie del vetro.

Trattamento termico di np-Au film è un metodo conveniente e controllabile per modificare la morfologia dei pori (Figura 3). Mentre un rapido strumento di ricottura termica è auspicabile per il trattamento termico, forni e fornelli, inoltre, produrre risultati accettabili. Tegli Dose termico e la temperatura deve essere controllata attentamente, come alte temperature (> 500 ° C) può portare alla completa sinterizzazione del np-Au e scomparsa della porosità (Figura 5c). Contenuto di argento insufficiente nella lega depositato (meno del 60% di argento, al.%) Evita anche la formazione porosità (Figura 5b).

Per stabilire colture di cellule vitali sulle suddette superfici rivestite np-Au, è importante immergere i campioni in acqua DI con diversi cambi d'acqua per rimuovere completamente il residuo di acido nitrico dalla rete porosa. Mentre non è stato necessario trattare le superfici con specifiche proteine ​​della matrice extracellulare (ECM) prima della semina delle cellule, abbiamo osservato che il trattamento al plasma e immergendo i campioni in coltura cellulare prima della semina delle cellule migliorare drasticamente l'adesione cellulare e la vitalità. Questo miglioramento è probabilmente dovuto ad adsorbimento non specifico di proteine ​​di adesione dal siero in CEterreni di coltura ll sulla superficie np-Au. Per le condizioni di coltura cellulare che richiedono terreno privo di siero, può essere necessario pretrattare la superficie np-Au con molecole ECM (es. fibronectina).

Per la determinazione dei pori / size vuoto e la copertura, così come il conteggio delle cellule e la copertura cellulare, le immagini devono essere convertiti in immagini in bianco e nero binari (vedi figure 3 e 4) - il processo è noto anche come la segmentazione. Ciò richiede la scelta di un valore di grigio di soglia che è incline a user-bias. Pertanto, i valori assoluti determinati dalla elaborazione delle immagini devono essere segnalati con cautela. Maggior parte degli studi richiedono la comparazione di diverse morfologie di cellule e nanostrutture, pertanto, purché i parametri di analisi (ad esempio, la finestra di dimensione delle particelle di soglia) sono mantenute coerenti tra campioni, significatività statistica può essere raggiunto con un numero relativamente piccolo di campioni. Prima di segmentazione di immagini, è anche utileper appianare le immagini e sottrarre il fondo con i comandi incorporati in ImageJ (o una versione più specializzata, Fiji). Noi regolare i parametri nella macro incluso (file di codice supplementari 1-3) al processo batch più immagini.

Ci aspettiamo che le tecniche dimostrate qui sarà aiutare la comunità scientifica a integrare np-Au in microsistemi, tra più array di elettrodi per elettrofisiologia, biosensori, e schemi di accumulo di energia in miniatura. Inoltre, riteniamo che i metodi di elaborazione dell'immagine semiquantitativi saranno utili per una vasta gamma di studi sulle interazioni di materiali e cellule aderenti.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gold target	Lesker	EJTAUXX403A2	Precursor to alloy for producing np-Au
Chrome target	Lesker	EJTCRXX353A2	Adhesive layer
Silver target	Lesker	EJTAGXX403A2	Precursor to alloy for producing np-Au
Porcelain boat	Thomas Scientific	8542E40	Used for processing small samples
Nitric acid	Sigma-Aldrich	43873	Used at 70% for dealloying
Sulfuric acid	J.T Baker	7664-93-9	Used at 96% for piranha cleaning
Hydrogen peroxide	J.T Baker	7722-84-1	Used at 30% for piranha cleaning
Biopsy punches	Ted Pella	150xx	Available in several sizes
Silicone elastomer sheets	Rogers Corporation	HT 6240	Available in several thicknesses
Hexamethyldisilazane	Sigma-Aldrich	440191-100ML	Used as adhesion promoter for positive resist
Microposit MF CD26	Shipley	38490	Positive photoresist developer
PRS 3000	J.T Baker	JT6403-5	Positive photoresist stripper
Circular glass coverslips (12 mm)	Ted Pella	26023	Used as substrate for metal patterns and cell culture
Glass slides (1 x 3 inch)	Ted Pella	26007	Used as substrate for metal patterns
Kapton polyimide tape	VWR	82030-950	Used for securing elastomer
Transparency masks	Output City		Used in photolithography http://www.outputcity.com/
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G	Used for activating glass surfaces
Sputtering machine	Kurt J. Lesker	LAB18	Used for depositing metals