细胞物质相互作用研究微细的纳米多孔金模式

Summary

我们报告的微细纳米多孔金薄膜，通过模版印刷，光刻法，以及培养细胞的微细加工图案的方法的技术。此外，我们描述的图像分析方法来表征形态的物质和培养的细胞，使用扫描电子显微镜和荧光显微镜技术。

Abstract

在几十纳米特征尺寸的纳米材料，增强了多种技术，包括燃料电池，生物传感器，生物医学设备涂料，药物输送工具的性能。纳米多孔金（NP-金），纳米尺度的自组装过程中所产生的，是一种相对较新的材料，具有大的有效表面积，高导电性，催化活性。这些特性NP-坳科学界的一个有吸引力的材料。 NP-金的大部分研究采用宏观尺度的标本，并侧重于基础科学的物质和其催化和传感器应用。宏观尺度的标本限制NP-金的潜力，在小型化的系统，包括生物医学设备。为了解决这些问题，我们初步描述了两种不同的方法在刚性基板上的微细NP-金薄膜。第一种方法是采用手工制作的模板创建毫米级NP-金模式的whIL口罩e的第二种方法是使用剥离光刻图案亚毫米级图案。作为NP金薄膜溅射沉积过程中获得的，它们与传统的微细加工技术，从而适合轻便整合成微兼容。这些系统包括电寻址的生物传感器平台，受益于高的有效表面积，导电性，和的金硫醇类表面生物耦合。我们描述了细胞培养，免疫组化技术和图像处理技术到量化NP-互惠与哺乳动物细胞中，这是一个重要的性能参数对某些生物传感器的交互。我们这里演示的技术将协助整合平台，各种长度尺度和众多的应用，包括生物传感器，储能系统和催化剂的NP-金。

Introduction

Protocol

1。制备纳米多孔金

1. Piranha溶液清洁基板
   1. 25毫升的过氧化氢（30％）加入到100毫升的硫酸（96％）的结晶皿和加热混合物至65℃的加热板上对。注意：液体是腐蚀性极强，必须小心处理。将使用了的溶液不应该被存储在一个密封的容器，因为它可能会引起爆炸。
   2. 放置1英寸×3英寸的显微镜载物片到该混合物中，用耐酸钳10分钟，并清除它们。 ，使用瓷免疫船小批量清洗盖玻片。治疗小盖玻片与空气等离子浸入到溶液中之前，在10瓦特，30秒。
   3. 下运行3分钟，去离子水（DI）冲洗清洁样品结晶菜肴。用氮气枪吹干样品超过皮棉免费毛巾。
2. 准备模板掩模（方法1：使用创建毫米级的模式）
   1. 冲床250微米厚的硅橡胶片活检拳和/或切割用手术刀超过半硬塑料表面的区域。清洁处理后的弹性体片材，在70％的异丙醇和干燥的，用氮气枪。
   2. 将打孔纸不起毛的洁净毛巾上，并对齐食人鱼清洗盖玻片与样品表面面临的模版模板。
3. 图案剥离光致抗蚀剂（方法2：使用创建亚毫米级图案）
   1. 纺纱夹头将食人鱼清洁显微镜幻灯片，并用氮气枪吹掉微粒。分液1.5ml的粘合促进剂（六甲基二硅氮烷）到载玻片上，用塑料吸管。差价的启动子，通过依次以500rpm旋转滑动，持续5秒和每分钟1500转，30秒。烤7分钟，在115℃的烤盘上的幻灯片，并让它冷却5分钟。
   2. 输注4毫升到玻璃载片上的光致抗蚀剂（3英寸bY 1英寸）。传播的光致抗蚀剂，通过纺丝相同的协议作为粘合促进剂中的滑动。在烤盘上烤的光刻胶为1.5分钟，在115℃10分钟，让它冷却。
   3. 用UV光（强度：22毫瓦/厘米^2）的光致抗蚀剂涂层的滑动暴露通过透明罩，持续15秒。烘烤光致抗蚀剂在加热板上在115℃下1.5分钟，等待45分钟。曝光的光致抗蚀剂溶解在开发商至少3.5分钟。去离子水彻底冲洗。型态在光学显微镜下检查。
4. 存款前体金属产生NP-金薄膜
   1. 将样品放入溅射机可以独立存金，银，铬。溅射清洁的样品在50 W 90秒25毫托氩处理气氛下开始之前金属沉积。
   2. 10分钟，在300瓦下10毫托氩溅镀铬。溅射黄金90秒400 W UNDER 10毫氩。合作溅射黄金和白银与白银在10分钟200 W和Au功率在100瓦黄金溅射源银关闭前约10秒，关闭溅射源。
5. 获得前体金属微细
   1. 超声〜180毫升和10个循环20秒的超声处理2分钟的暂停周期之间的光致抗蚀剂剥离剂的光致抗蚀剂涂层的样品。用DI水冲洗样品，并用氮气枪干燥。在显微镜下检查金属图案。
   2. 剥离非光刻胶涂层样品用两个镊子揭示熔敷金属的弹性模板。
6. Dealloy前体通过热处理纳米金属和修改
   1. 填充的200毫升的玻璃烧杯中，用170毫升硝酸（70％），并在加热板上，保持溶液的温度在55℃。注意：硝酸是腐蚀性极强，应处理适当的防护设备。 对待小盖玻片空气等离子在10 W 30秒前浸入硝酸。名次1英寸×3英寸的显微镜载玻片放入烧杯中使用耐酸钳dealloy 15分钟。使用瓷免疫船批次去合金​​小盖玻片。
   2. 通过连续地浸渍在充满了新鲜的去离子水的烧杯中三次冲洗去合的样品。店内样品在去离子水中，并更换新鲜的去离子水的水，每天至少一个星期。在无绒毛巾在使用前用氮气枪吹干样品。
   3. 将样品加载到一个干净的硅晶片的快速热处理设备。调节温度至200℃和450℃，升温速率10℃/秒。样品暴露到规定的温度，在氮气环境下的10分钟。让腔冷却（<100℃），取出样品。另外，慢慢地将样品在烤盘上热treatm耳鼻喉科。

2。细胞培养

1. 准备NP-坳样品细胞培养
   1. 广场NP金样品在聚苯乙烯菜和空气等离子处理30秒10 W的样品转移到24孔细胞培养板。
   2. 向每孔中加入500μl的完整的培养基（Dulbecco改进的Eagle培养基，用10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素）。储存增湿培养箱中，在37℃和5％CO ₂中，直到播种的细胞（<1小时）。
2. 维护，通道和种子细胞
   1. 保持在T75培养瓶，培养基及通过细胞70％汇合时，感兴趣的细胞（在这种情况下，NIH 3T3成纤维细胞或鼠星形胶质细胞）。
   2. 对于传代的细胞，从烧瓶中取出介质，清洗两次，每次用10毫升磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，加入2毫升1个胰蛋白酶/ EDTA和孵育直到细胞分离（约5分钟）。加入3毫升新鲜的媒体和在1,200 rpm离心3分钟。吸上清液，，暂停沉淀在2毫升媒体。
   3. 从孔和种子细胞的盖玻片上，在密度为25,000细胞/ cm ²的最终体积为1毫升，取出用过的介质。向前摇动培养板中后卫和右左，以确保细胞均匀涂布在样品上。日常检查的同时，培养的细胞，直到分析。

3。细胞与材料分析

1. 细胞染色可视化细胞骨架和细胞核
   1. 从水井中取出废媒体，用PBS洗涤细胞两次。修复的细胞在4％多聚甲醛的PBS中15分钟。
   2. 准备300纳米的Alexa Fluor 488的鬼笔环肽在PBS溶液中染色，用1％牛血清白蛋白。
   3. 用PBS洗涤细胞两次，通透于500μl的0.1％的Triton X-100的PBS中5分钟。
   4. 用PBS洗涤细胞两次，他们转移到清洁井。 5印迹0 - 200微升到20分钟的样品并储存在黑暗的染色溶液。
   5. 洗涤细胞，用PBS和反污垢与3纳米的在PBS中的DAPI染色5分钟。
   6. 用PBS洗涤细胞，并浸在去离子水中，然后安装在玻璃罩幻灯片安装媒体和密封，与透明指甲油。
2. NP-金样品和细胞培养对NP金表面获取图像
   1. 图片NP-凹表面的50000倍放大的扫描电子显微镜（SEM），在10千伏电子能量使用二次电子探测器。
   2. 在不同的点上样品使用倒置荧光显微镜在10倍的放大倍率，用适当的滤光块捕获复合细胞图像。
3. 处理图像，以确定孔隙和细胞形态
   1. 打开ImageJ的图像分割成单独的通道，如果适用。将图像转换为8位，减的背景下，并顺利地把它们由位数filteri的纳克。调整阈值手动或通过内置的阈值的算法，以反白显示的孔隙（空隙）和胞体/细胞核。
   2. 使用分水岭命令合并毛孔或细胞分离。颗粒分析参数设置和执行命令提取颗粒，平均面积和覆盖率颗粒数。使用DAPI染色细胞图像量化％小区覆盖的细胞计数和鬼笔环肽染色的细胞图像。
   3. 修改包括宏文件执行批处理多个图像分析。

Representative Results

图1概括了主要的程序步骤，包括创建NP-金模式，培养细胞，量化的纳米结构，细胞形态特征。 图2a中所示的弹性体的模具中（顶部）用于创建下面的图像中所示的np-互惠型态， 图2b是一个照片进行批量处理样品的瓷舟。 图2c显示所沉积的金属图案的颜色变化前后去合金。银色的完成（之前去合金）由于富银合金含量。膜去合金后，获得一个明显的橙褐色的色调。 图2d示出通过光刻形成图案的金属产生的精细的特点。不同的孔的形态，可以得到由NP-金膜^9， 如图3所示的热处理。的横截面图像（ 图由图3）揭示了该影片是否通过的膜厚度是均匀地去合。的SEM图像可以划分成二进制图像（ 图3底行）（阈值）的大小和空隙％的覆盖率（ 代码1）。一位代表粘附小鼠一个np-Au表面上培养的星形胶质细胞的荧光图像如图4所示。图像的每个通道可以分裂，分割，产生二进制图像分析细胞与材料的相互作用。分段骨架的图片可用于量化单元面积和表面覆盖率（ 代码2），，而分段细胞核细胞计数（ 代码3）的图像是有用的。 图5是一个可视化的概要NP-凹结构的制造中的常见故障包括漆膜附着力差，孔隙度的情况下，过度的热处理。

图1。酸清洗的基片的主要处理步骤的示意性说明。有手动切割模板掩模或光刻图案化光致抗蚀剂层被屏蔽。黄金和白银的目标，同时溅射创建一个富银金合金，其中面具的图案转移到玻璃基板上。合金的模式去合硝酸创造纳米多孔金（NP-金）模式。感兴趣的细胞培养样品成像，荧光和扫描电子显微镜，生物和形态特征提取。 点击这里查看大图 。

图2。光学图像A（A）（B）硅模板（顶部）用于图案化先声夺金-银合金，其产生的NP-金阵列（底部）;瓷舟批处理标本;（三）典型的颜色溅射的AuAg合金（顶部）和去膜（底部），以及（d）更高分辨率的NP-金产生的金-银沉积过程中的光刻掩模的图案。

图3。 N-对金的SEM图像（上排）和相应的分割图像（最后一行），用于提取平均空隙大小ND％的无效覆盖。SEM图像（右上）的一个切割NP-坳样品显示薄膜厚度均匀的孔结构通过点击这里查看大图 。

图4。复合F-肌动蛋白（绿色）和细胞核（蓝色）的彩色细胞图像，这是分段提取％的小区覆盖从蓝色绿色通道和细胞计数。

图5。 （一）分层图像的典型故障。去合金过程中，由于不足的粘接剂层的镀铬;（二）没有孔隙，后脱合金，由于在合金中银的含量不足;及（c）完全烧结的中子-金膜，由于热处理温度过高。

Discussion

我们表现​​出两种不同的技术来扩大使用这些薄膜微系统和生物研究微细NP-Au膜。溅射镀膜的金及银是一种多用途的方法来创建NP-互惠模式，溅射是与传统的微细加工工艺和合金的组成和厚度可以很容易地通过改变个别溅射枪功率控制（适用于黄金和银子目标）和兼容沉积时间。典型的NP-Au膜的厚度从200纳米到2微米的范围内。允许创建毫米尺度格局，规避光刻法需要使用活检冲头和手术刀的模版的方法（方法1， 图2a）。可以生产更复杂的图案，由一个可编程的激光切割机。兼容的有机硅弹性体的模板自我附着在玻璃表面，从而防止金属沉积下方的面具和提高图形分辨率。然而，较小的features（<1毫米），通常是难以用这种方法生产的，该模具的厚度为通过掩模中的开口，防止金属沉积均匀。需要更高的特征分辨率的应用程序，可以实现与光刻构图方法2（ 图2d）。的透明度的掩模通过光刻法转印图案可从一些公司（ 例如输出，班顿市，OR），并且是经济的替代品的最低所需的特征尺寸超过20μm的铬玻璃掩模。兼容的模具中的金属沉积到有时会导致产生非均匀的应力，由于从基板脱离模版。我们通常会缓解此问题，使用聚酰亚胺胶带的边缘，底层基板固定模板。

当较小的样品，如圆形盖玻片（12毫米直径）通常用在我们的研究中，瓷舟中所示如清洁，dealloy）多个小样本。的样品批量处理增加在不同的样品中所产生的纳米结构体的均匀性。小样本倾向于浮动浸入时，的食人鱼或去解决方案，因为他们变成疏水性，当在空气中存放。之前的任何步骤，要求样品浸在液体中，等离子处理（10瓦，持续30秒），使在玻璃表面的亲水性，并有助于减轻浮动问题。在生产NP-金薄膜的最常见的问题是在去合金步骤分层。这通常是由于去合金过程中的体积收缩^21的拉伸应力积累。为了防止脱层，重要的是要具有的np-Au膜和基片之间的附着力强。这是通过一个足够厚的铬（〜150纳米）和中间克旧层（约200纳米）。应该会出现暗灰色光的透明基板从背面侧观察时淀积薄膜。显示在图5a是去皮膜背面的电影不应该看起来像一个很好的例子-黄金完成表明，镀铬层不够厚，以确保附着力强。分层的另一个原因是不洁净的样品表面，因此，它是必不可少食人鱼清洁的表面金属沉积之前。此外，重要的是要确保，光致抗蚀剂被完全开发在淀积薄膜之前，任何剩余的光致抗蚀剂的玻璃表面上，防止熔敷金属的附着力强。

NP-金薄膜的热处理是一种方便的和可控制的孔的形态（ 图3）修改方法。虽然快速热退火仪器是可取的热处理炉和电炉也产生可接受的结果。 Ť他热剂量和温度应仔细监测，高温（> 500℃）可能导致NP-Au和孔隙消失（ 图5c）完成烧结。在沉积的合金（不超过60％的银，原子％）的银含量不足也可以防止孔隙形成（ 图5b）。

为了建立上述NP-金涂层表面上的活菌培养，重要的是要在去离子水中浸泡样品与一些水的变化完全消除硝酸残基从多孔网络。虽然它不是必要的治疗与特定的细胞外基质（ECM）蛋白的表面播种前的细胞，我们观察到等离子体处理之前，播种的细胞在细胞培养液中浸泡样品显着提高细胞的粘附和活力。这种改善是最有可能由于粘附蛋白的非特异性吸附，从血清策LL文化传媒到NP-Au表面。对于需要的无血清培养基的细胞培养条件，也可能是必要的预先处理的np-Au表面与ECM分子（ 例如纤连蛋白）。

确定孔/无效的规模和覆盖面，以及细胞计数和细胞覆盖，图像需要被转换成二进制黑白图像（ 见图3和图4） -也被称为分割的过程。这就需要选择一个阈值的灰度值，该值很容易出现用户偏置。因此，绝对值由图像处理决定，应当报慎用。大多数研究需要不同的形态的细胞和纳米结构的比较，因此，只要分析参数（ 例如，阈值，粒子大小的窗口）保持一致的样品，统计显着性，可以实现具有相对较小的样本数量。图像分割之前，它也是有帮助的平滑的图像，并使用内置的命令在ImageJ（或更专业的版本，斐济）减去背景。我们调整的参数包含宏（ 补充代码文件1-3）批量处理多个图像。

我们预计，这里展示的技术将有助于科学界将NP-凹进去微系统，包括多个电极阵列电，生物传感器，微型储能计划。此外，我们相信，半定量的图像处理方法将是有价值的材料和贴壁细胞的相互作用的研究，适用范围广。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gold target	Lesker	EJTAUXX403A2	Precursor to alloy for producing np-Au
Chrome target	Lesker	EJTCRXX353A2	Adhesive layer
Silver target	Lesker	EJTAGXX403A2	Precursor to alloy for producing np-Au
Porcelain boat	Thomas Scientific	8542E40	Used for processing small samples
Nitric acid	Sigma-Aldrich	43873	Used at 70% for dealloying
Sulfuric acid	J.T Baker	7664-93-9	Used at 96% for piranha cleaning
Hydrogen peroxide	J.T Baker	7722-84-1	Used at 30% for piranha cleaning
Biopsy punches	Ted Pella	150xx	Available in several sizes
Silicone elastomer sheets	Rogers Corporation	HT 6240	Available in several thicknesses
Hexamethyldisilazane	Sigma-Aldrich	440191-100ML	Used as adhesion promoter for positive resist
Microposit MF CD26	Shipley	38490	Positive photoresist developer
PRS 3000	J.T Baker	JT6403-5	Positive photoresist stripper
Circular glass coverslips (12 mm)	Ted Pella	26023	Used as substrate for metal patterns and cell culture
Glass slides (1 x 3 inch)	Ted Pella	26007	Used as substrate for metal patterns
Kapton polyimide tape	VWR	82030-950	Used for securing elastomer
Transparency masks	Output City		Used in photolithography http://www.outputcity.com/
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G	Used for activating glass surfaces
Sputtering machine	Kurt J. Lesker	LAB18	Used for depositing metals