Mikrofabrikation af Nanoporøse Gold Patterns for Celle-materiale interaktion Studies

Summary

Vi rapporterer om teknikker til at micropattern nanoporøse guld tynd film via stencil trykning og fotolitografi, samt metoder til kultur celler på microfabricated mønstre. Herudover beskriver vi billed analysemetoder at karakterisere morfologi af materialet og de dyrkede celler ved hjælp af scanning elektron og fluorescensmikroskopi teknikker.

Abstract

Nanostrukturerede materialer med funktionen størrelser i snesevis af nanometer har forbedret ydeevne af flere teknologier, herunder brændselsceller, biosensorer, biomedicinske enhed belægninger, og drug delivery værktøjer. Nanoporous guld (NP-Au), produceret af en nano-skala selvsamling proces er et relativt nyt materiale, der udviser stort effektiv overflade høj elektrisk ledningsevne og katalytisk aktivitet. Disse egenskaber har gjort NP-Au et attraktivt materiale til videnskabelige samfund. De fleste undersøgelser af np-Au ansætte makro-skala prøver og fokusere på grundlæggende videnskab af materialet og dets katalytiske og sensor applikationer. De makro-skala prøver begrænser np-Au potentiale i miniaturiserede systemer, herunder biomedicinsk udstyr. For at løse disse problemer, vi i første omgang beskriver to forskellige metoder til micropattern NP-Au tynde film på stive underlag. Den første metode anvender manuelt producerede stencil masker til at skabe millimeter skala NP-Au mønstre, while den anden metode bruger lift-off fotolitografisk til mønster sub-millimeter-skala mønstre. Som NP-Au tynde film opnås ved sputter-belægning proces, de er forenelige med konventionelle microfabrication teknikker, derved gøres til genstand for facile integration i mikrosystemer. Disse systemer omfatter elektrisk adresserbare biosensor platforme, nyder godt af høje effektive overfladeareal, elektrisk ledningsevne, og guld-thiol-baseret overflade bioconjugation. Vi beskriver cellekultur, immunfarvning, og billedbehandling teknikker til at kvantificere NP-Au samspil med pattedyrceller, hvilket er en vigtig ydeevneparameter for nogle biosensorer. Vi forventer, at de teknikker, illustreret her, vil lette integrationen af ​​np-Au i platforme på forskellige længde-skalaer og i en lang række applikationer, herunder biosensorer, energi lagersystemer, og katalysatorer.

Introduction

Protocol

1.. Nanoporous Gold Fabrication

1. Rene substrater i Piranha-løsning
   1. Der tilsættes 25 ml hydrogenperoxid (30%) til 100 ml svovlsyre (96%) i en krystallisering skål og blandingen opvarmes til 65 ° C på en varmeplade. ADVARSEL: Væskerne er ekstremt ætsende og skal håndteres med omhu. Den brugte opløsning bør ikke opbevares i en forseglet beholder, da de kan eksplodere.
   2. Sted 1-tommer med 3-tommer mikroskopobjektglas i blandingen ved hjælp af syre-resistente tænger og rense dem i 10 min. Brug en porcelæn immunfarvning båd til batch-rensning små dækglas. Behandle små dækglas med luft plasma ved 10 V for 30 sek før nedsænkning i opløsningen.
   3. Skyl de rengjorte prøver i krystallisering servicet under rindende deioniseret (DI) vand i 3 min. Blow-tørre prøver med et nitrogen pistol end fnugfri håndklæder.
2. Forbered stencil maske (Metode 1: Brug dette til at skabe millimeter-skala mønstre)
   1. Punch 250 um tykke silikone elastomer ark med biopsi slag og / eller incise ud regioner med en skalpel over en semi-hård plast overflade. Rengør de forarbejdede elastomer ark i 70% isopropanol og tør med nitrogen pistol.
   2. Placer udstansede ark på en fnugfri renrum håndklæde og justere Piranha-rengjorte dækglas over stencil med prøven vendende stencilen.
3. Mønster lift-off photoresist (Metode 2: Brug dette til at skabe sub-millimeter-skala mønstre)
   1. Placer en Piranha-renset objektglas på spinning chuck og blæse eventuelle partikler med nitrogen pistol. Dispensér 1,5 ml klæbeforbedrer (hexamethyldisilazan) på objektglasset med en plastik pipette. Spred promotor ved at dreje slide successivt ved 500 rpm i 5 sek og 1.500 rpm i 30 sek. Bag slide på en varmeplade ved 115 ° C i 7 min, og lad den køle af 5 min.
   2. Dispensér 4 ml fotoresist på objektglas (3-tommer by 1-inch). Spred fotoresist ved spinding objektglasset med den samme protokol som for adhæsionspromotoren. Bag photoresist på en varmeplade ved 115 ° C i 1,5 min og lad den køle i 10 min.
   3. Blotlæg fotoresist-overtrukne objektglas med UV-lys (intensitet: 22 mW / cm ²⁾ gennem en gennemsigtighed maske for 15 sek. Bage fotoresist på en varmeplade ved 115 ° C i 1,5 min og vent i 45 minutter. Opløses eksponerede fotoresist i fremkalderen i mindst 3,5 minutter. Skyl grundigt med DI vand. Undersøg de udviklede mønstre under et optisk mikroskop.
4. Deposit precursor metaller at producere NP-Au tynde film
   1. Læg de prøver til et spruttende maskine, der uafhængigt kan deponere guld, sølv og krom. Sputter-rense prøver til 90 sek ved 50 W under 25 mTorr argon behandling atmosfære, før du starter metalafsætning.
   2. Sputter krom i 10 min ved 300 W under 10 mTorr argon. Sputter guld til 90 sekunder ved 400 W under 10 mTorr argon. Co-sputter guld og sølv i 10 min med sølv ved 200 W og Au magt på 100 W. Sluk guld sputter kilde ca 10 sek før du slukker sølv sputter kilde.
5. Opnå prækursorer metal micropatterns
   1. Sonikeres photoresist-belagte prøver i ~ 180 ml photoresist stripper til 10 cykler af 20 sek lydbehandling og 2 min pause mellem cyklusser. Skyl prøverne med DI vand og tør med et nitrogenindhold pistol. Efterse metal mønstre under et mikroskop.
   2. Skræl elastomer stencil fra ikke-fotoresistbelagte prøver ved to pincet til at afsløre deponerede metal.
6. Dealloy forløber metal og modify nanostruktur via varmebehandling
   1. Fyld en 200 ml bægerglas med 170 ml salpetersyre (70%) og opretholde opløsningens temperatur ved 55 ° C på en varmeplade. ADVARSEL: salpetersyre er ekstremt ætsende og bør håndteres med passende beskyttelsesudstyr. Behandle små dækglas med luft plasma ved 10 V for 30 sek før fordybelse i salpetersyre. Placer 1-tommer med 3-tommer objektglas i bægerglasset med syre-resistente pincet og dealloy dem i 15 min. Brug en porcelæn immunfarvning båd til batch-dealloying små dækglas.
   2. Skyl dealloyed prøver ved successivt at nedsænke dem i to bægre fyldt med frisk DI-vand tre gange. Opbevar prøver i DI-vand og erstatte det vand med frisk deioniseret vand hver dag i mindst en uge. Blow-tørre prøver med et nitrogenindhold pistol løbet fnugfri håndklæder før brug.
   3. Indlæse prøver på en ren silicium wafer i en hurtig termisk udstyr. Temperaturen justeres til mellem 200 ° C og 450 ° C, og faldhastighed til 10 ° C / sek. Udsætte prøverne til den foreskrevne temperatur i 10 minutter under nitrogen ambient. Lad kammeret køligt (<100 ° C), og tage prøverne. Alternativt langsomt placere prøverne på varmepladen for termisk treatment.

2.. Cellekultur

1. Forbered NP-Au prøver til cellekultur
   1. Place np-Au prøver i polystyren retter og behandle med luft plasma ved 10 V for 30 sek og overføre prøver til 24-brønds vævskulturplader.
   2. Tilføj 500 pi komplette dyrkningsmedier (Dulbeccos Modified Eagle Medium med 10% kalvefosterserum og 1% penicillin / streptomycin) til hver brønd. Opbevares i en fugtig inkubator ved 37 ° C og 5% _CO2, indtil podning af cellerne (<1 time).
2. Vedligehold, passage og frø celler
   1. Bevar celler af interesse (i dette tilfælde 3T3-NIH fibroblaster eller murine astrocytter) i T75 kolber med dyrkningsmedier og passage, når cellerne er 70% sammenflydende.
   2. For passage af cellerne, mediet fjernes fra kolben, vaskes to gange med 10 ml phosphatpufret saltvand (PBS), der tilsættes 2 ml 1x trypsin / EDTA og inkuberes indtil cellerne detach (~ 5 min). Tilsæt 3 ml friske medier ogcentrifugeres ved 1200 rpm i 3 minutter. Aspirere supernatanten og suspenderer pellet i 2 ml medier.
   3. Fjern de brugte medier fra brøndene og frø cellerne onto dækglas med en tæthed på 25.000 celler / cm ² med et endeligt volumen på 1 ml. Ryst kultur plade frem-tilbage og højre-venstre for at sikre en ensartet belægning af celler over prøverne. Inkubér cellerne indtil analyse mens inspicerende dagligt.

3.. Celle-og Material Analysis

1. Stain celler at visualisere cytoskeleton og kerner
   1. Fjern brugte medier fra brønde og vaskes cellerne to gange med PBS. Lave celler i 4% paraformaldehyd i PBS i 15 min.
   2. Forbered farveopløsning på 300 nM Alexa Fluor 488 phalloidin i PBS med 1% bovint serumalbumin.
   3. Vask cellerne to gange med PBS, og permeabilisere dem i 500 pi 0,1% Triton X-100 i PBS i 5 min.
   4. Vask cellerne to gange med PBS og overføre dem at rense brønde. Blot 50-200 ul farvning opløsning på prøverne og lagre dem i mørke i 20 min.
   5. Vask cellerne med PBS og mod pletten med 3 nM DAPI i PBS i 5 min.
   6. Vask cellerne med PBS, og dyp i deioniseret vand inden montering på glas dækslides med monteringsvejledning medier og tætning med klar neglelak.
2. Anskaf billeder af NP-Au prøver og cellekulturer på NP-Au overflader
   1. Billede NP-Au overflader med scanning elektron mikroskop (SEM) med 50.000 x forstørrelse ved 10 kV elektronenergi hjælp sekundær elektron detektor.
   2. Capture sammensatte celle billeder ved forskellige pletter på prøverne ved anvendelse af et inverteret fluorescensmikroskop ved 10X forstørrelse med passende filter terninger.
3. Behandle billeder at bestemme pore og cellemorfologi
   1. Åbne billeder i ImageJ og opdelt i de enkelte kanaler, hvis relevant. Konverter billeder til 8-bit, trække baggrunden, og glatte dem ved median filtering. Juster tærskel enten manuelt eller med indbygget tærskling algoritmer til at fremhæve de porer (hulrum) og celle organer / kerner.
   2. Brug vandskel kommando til at adskille flettede porer eller celler. Sæt partikel analyseparametre og udføre kommandoen til at udtrække antallet af partikler, gennemsnitlig område og procent dækning ved partikler. Brug DAPI-farvet celle billeder til celletælling og phalloidin-farvede celle billeder til kvantificering procent celle dækning.
   3. Rediger de medfølgende makro filer til at udføre batch analyse af flere billeder.

Representative Results

Figur 1 skitserer de vigtigste proceduremæssige skridt, herunder oprettelse af NP-Au mønstre, dyrkning af celler, kvantificere nanostrukturen, og karakterisere celle morfologier. Elastomeren stencil er vist i figur 2a (øverst) bruges til at oprette NP-Au mønstre, der vises i billederne nedenunder. Figur 2b er et fotografi af porcelæn båd til batchbehandling prøver. Figur 2c viser farveændring af de deponerede metal mønstre før og efter dealloying. Den sølvfarvede finish (før dealloying) skyldes sølv-rige legering indhold. Ved dealloying erhverver filmen et synligt orange-brun nuance. Figur 2d illustrerer de finere funktioner fremstillet ved fotolitografisk mønsterdannelse af metallet. Forskellige pore morfologier kan opnås ved termisk behandling af NP-Au film ^9, som vist i figur 3.. Den tværgående billede (FigURE 3) viser, om filmene dealloyed ensartet gennem filmtykkelsen. SEM billeder kan segmenteres (tærsklingsbehandlet) ind binære billeder (Figur 3 nederste række) til bestemmelse af størrelse og procent dækning af hulrum (kode 1). Et repræsentativt fluorescens billede af adhærente murine astrocytceller dyrket på et NP-Au overfladen er vist i figur 4. De enkelte kanaler i billedet kan være split og segmenteret for at producere binære billeder til analyse celle-materiale interaktion. Segmenterede cytoskelet billeder kan anvendes til at kvantificere celle område og overfladedækning (kode 2), mens de segmenterede cellulære nucleus billeder er anvendelige til celletælling (kode 3). Figur 5 er en visuel oversigt over almindelige fejl i fremstilling af NP-Au strukturer , herunder dårlig filmadhæsion, fravær af porøsitet, og overdreven termisk behandling.

Figur 1. Skematisk illustration af de store procestrin. Syre-rensede substrater enten maskeres med en manuelt cut stencil maske eller fotolitografisk-mønstrede fotoresistlag. Guld og sølv mål samtidigt spruttede at skabe en sølv-rige guld legering, hvor maskerne overføre mønstre på glasset substrater. Alloy mønstre er dealloyed i salpetersyre for at skabe nanoporøse guld (NP-Au) mønstre. Celler af interesse dyrkes på prøverne, og de ​​er afbildet med fluorescens og scanning elektronmikroskoper til at udtrække både biologiske og morfologiske træk. Klik her for at se større figur .

Figur 2. Optiske billeder A (a) silikone stencil (øverst) anvendt til mønstret forstadium guld-sølv legering, som producerer np-Au array (nederst). (B) porcelæn båd til batchbehandling enheder (c) typisk farve forstøvet AuAg legering (øverst) og dealloyed film (bund) og (d) højere opløsning np-Au mønstre fremstillet ved fotolitografisk maskering under guld-sølv deposition.

Figur 3. Np-Au SEM-billeder (øverste række) og tilsvarende segmenterede billeder (nederste række), der anvendes til udvinding gennemsnitlig void størrelse ennd procent void dækning. SEM billede (øverst til højre) af et kløvet NP-Au prøve viser homogen porestruktur gennem filmen tykkelse. Klik her for at se større figur .

Figur 4.. Et sammensat f-actin (grøn) og kernen (blå) farvet celle billede, som er segmenteret at udtrække procent celle dækning fra den grønne kanal og celletal fra blå.

Figur 5. Billeder af typiske fejl. (A) delamineringunder dealloying grund af et utilstrækkeligt klæbende lag af krom (b) fravær af porøsitet efter dealloying grund af utilstrækkelig sølvindhold i legeringen, og (c) fuldstændig sintring af NP-Au film som følge termisk behandling for høj temperatur.

Discussion

Vi viser to forskellige teknikker til micropattern NP-Au film til at udvide anvendelsen af ​​disse film i mikrosystemer og biologiske undersøgelser. Katodeforstøvningscoatingsproces guld og sølv er en alsidig metode til at skabe NP-Au mønstre, som katodeforstøvning er forenelig med konventionelle microfabrication processer og legeringen sammensætning og tykkelse kan let kontrolleres ved at variere de enkelte sputtering pistol beføjelser (for guld og sølv mål) og deposition tid hhv. Typiske np-Au filmtykkelser området fra 200 nm til 2 um. Stencil (metode 1, figur 2a) ved hjælp af biopsi stempler og skalpel kan der oprettes millimeter skælmønstre omgår behovet for fotolitografi. Mere komplicerede mønstre kan fremstilles ved en programmerbar laserskærer. Det overensstemmende silikoneelastomer stencil selvstændige klæber onto glasoverflader, hvilket forhindrer metalaflejring under masken og stigende mønster opløsning. Men mindre fÆRMERE BESKRIVELSE (<1 mm) er typisk vanskelige at fremstille med denne metode, da tykkelsen af ​​stencilen forhindrer ensartet metalaflejring gennem åbningerne i masken. Applikationer, der kræver højere funktionen opløsning kan opnås med fotolitografisk mønster (Metode 2, figur 2d). De gennemsigtighed masker til at overføre mønstre via fotolitografi kan fås fra flere virksomheder (f.eks Output City, Bandon, OR) og er økonomiske alternativer til Chrome glas masker, når minimum ønskede funktionen størrelser er mere end ~ 20 um. Metaludfældningen på kompatibel stencil fører undertiden til løsgørelse af stencil fra underlaget på grund af ikke-ensartet stress generation. Vi typisk afhjælpe dette problem ved at sikre stencil til det underliggende substrat ved hjælp af en polyimid bånd ved kanterne.

Når mindre prøver, såsom cirkulære dækglas (12 mm diameter) anvendes typisk i vores studier, porcelæn bådene er vist i (f.eks ren, dealloy) Flere små prøver. Batch behandling af prøver forøger ensartetheden af ​​det fremstillede nanostruktur tværs af forskellige prøver. Små prøver tendens til at flyde, når nedsænkning i Piranha eller dealloying løsninger, efterhånden som de bliver hydrofobe, når de opbevares i luft. Før ethvert skridt, der kræver prøver, der skal nedsænkes i væske, plasma behandle dem (10 W i 30 sek) gør glasoverfladen hydrofile og hjælper med at afbøde den flydende emne. Det mest almindelige problem i produktion NP-Au film er delaminering under dealloying trin. Dette er typisk tilskrives trækspænding ophobning på grund af volumen krympning under dealloying ^21.. For at forhindre delaminering, er det vigtigt at have en stærk adhæsion mellem NP-Au og substratet. Dette opnås ved et tilstrækkeligt tykt krom (~ 150 nm) og mellemprodukt ggamle lag (~ 200 nm). Deponerede film skal vises lys til mørk grå, når den ses fra bagsiden af ​​et transparent substrat. Den skrællet film vises i figur 5a er et godt eksempel på, hvordan bagsiden af film skal ikke ligne - guld finish, angiver, at krom laget ikke er tilstrækkelig tyk til at sikre en stærk vedhæftning. En anden grund til delaminering er urent prøveoverfladen, det er derfor vigtigt at Piranha-rene overflader før metalafsætning. Desuden er det vigtigt at sikre, at fotoresist'en fuldt udviklet før afsætning af filmen, som enhver resterende fotoresist forhindrer stærk adhæsion af aflejret metal på glasoverfladen.

Termisk behandling af NP-Au-film er en praktisk og kontrollerbar fremgangsmåde til at modificere pore morfologi (figur 3). Mens en hurtig termisk udglødning instrument er ønskeligt termisk behandling, ovne og kogeplader også producere acceptable resultater. THan termisk dosis og temperaturen bør overvåges omhyggeligt, da høje temperaturer (> 500 ° C) kan føre til at fuldføre sintring af np-Au og forsvinden af porøsitet (figur 5c). Utilstrækkelig sølvindhold i den deponerede legering (mindre end 60% sølv, på.%) Forhindrer også porøsitet dannelse (figur 5b).

For at etablere levedygtige cellekulturer for ovennævnte np-Au belagte overflader, er det vigtigt at suge prøverne i DI vand med flere vand forandringer fjernes helt salpetersyre rest fra porøse netværk. Mens det ikke har været nødvendigt at behandle overfladerne med specifikke ekstracellulære matrix (ECM) proteiner før podning af cellerne, vi observeret, at plasmabehandling og neddypning prøverne i cellekulturmedium før podning af cellerne drastisk forbedre celleadhæsion og levedygtighed. Denne forbedring skyldes sandsynligvis uspecifik adsorption af adhæsionsproteiner fra serummet i cell dyrkningsmedier onto np-Au overflade. For celledyrkningsbetingelser, der kræver serum-frit medium, kan det være nødvendigt at forbehandle np-Au overflade med ECM-molekyler (f.eks fibronectin).

For at bestemme pore / void størrelse og dækning, samt celletælling og celle dækning, billederne skal konverteres til binære sort-hvide billeder (se figur 3 og 4) - den proces er også kendt som segmentering. Dette kræver plukke en tærskelværdi grå værdi, der er tilbøjelige til bruger-bias. Derfor bør absolutte værdier fastlagt ved billedbehandling indberettes med forsigtighed. De fleste undersøgelser kræver en sammenligning af forskellige morfologier af celler og nanostruktur, og derfor, så længe analyse parametre (f.eks tærskel, partikelstørrelse vindue) holdes konsistente på tværs prøver, kan statistisk signifikans opnås med et relativt lille antal prøver. Forud for billedet segmentering, er det også nyttigtat udjævne billederne og trække baggrunden ved hjælp af de indbyggede kommandoer i ImageJ (eller en mere specialiseret udgave, Fiji). Vi justere parametrene i den medfølgende makro (supplerende kode Files 1-3) til batchbehandle flere billeder.

Vi forventer, at de teknikker demonstreret her, vil hjælpe det videnskabelige samfund i at integrere np-Au i mikrosystemer, herunder flere elektrode arrays til elektrofysiologi, biosensorer, og miniature energilagring ordninger. Derudover mener vi, at de semikvantitative billedbehandlingsmetoder vil være værdifulde for en bred vifte af undersøgelser vedrørende interaktion af materialer og adhærente celler.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gold target	Lesker	EJTAUXX403A2	Precursor to alloy for producing np-Au
Chrome target	Lesker	EJTCRXX353A2	Adhesive layer
Silver target	Lesker	EJTAGXX403A2	Precursor to alloy for producing np-Au
Porcelain boat	Thomas Scientific	8542E40	Used for processing small samples
Nitric acid	Sigma-Aldrich	43873	Used at 70% for dealloying
Sulfuric acid	J.T Baker	7664-93-9	Used at 96% for piranha cleaning
Hydrogen peroxide	J.T Baker	7722-84-1	Used at 30% for piranha cleaning
Biopsy punches	Ted Pella	150xx	Available in several sizes
Silicone elastomer sheets	Rogers Corporation	HT 6240	Available in several thicknesses
Hexamethyldisilazane	Sigma-Aldrich	440191-100ML	Used as adhesion promoter for positive resist
Microposit MF CD26	Shipley	38490	Positive photoresist developer
PRS 3000	J.T Baker	JT6403-5	Positive photoresist stripper
Circular glass coverslips (12 mm)	Ted Pella	26023	Used as substrate for metal patterns and cell culture
Glass slides (1 x 3 inch)	Ted Pella	26007	Used as substrate for metal patterns
Kapton polyimide tape	VWR	82030-950	Used for securing elastomer
Transparency masks	Output City		Used in photolithography http://www.outputcity.com/
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G	Used for activating glass surfaces
Sputtering machine	Kurt J. Lesker	LAB18	Used for depositing metals