Summary
우리는 스텐실 인쇄 및 석판뿐만 아니라 미세하게 패턴에 대한 배양 세포에 방법을 통해 micropattern과 나노 다공성 금 박막에 대한 기술을보고합니다. 또한, 우리는 물질과 주사 전자 및 형광 현미경 기술을 이용하여 배양 된 세포의 형태를 특성화하는 이미지 분석 방법을 설명합니다.
Abstract
수십 나노 미터의 기능 크기를 가진 나노 구조 재료는 연료 전지, 바이오 센서, 생물 의학 장치 코팅 및 약물 전달 도구를 포함한 여러 기술의 성능을 강화했다. 나노 크기의 자기 조립 공정에 의해 생산 된 나노 기공 금 (NP-오)는 큰 효과 표면적, 높은 전기 전도도와 촉매 활성을 보여 비교적 새로운 소재입니다. 이러한 속성은 NP-오에게 과학 사회 매력적인 소재를 만들었습니다. NP-오에 대한 대부분의 연구는 거시적 규모의 표본을 고용하고 물질과 촉매, 센서 응용 프로그램의 기초 과학에 초점을 맞 춥니 다. 매크로 스케일의 표본은 생물 의학 장치를 포함하여 소형 시스템에서 NP-오의 잠재력을 제한 할 수 있습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 우리는 처음에 딱딱한 기판 micropattern과 NP-오 박막의 두 가지 방법을 설명합니다. 첫 번째 방법은, 간편하게 조절할를 밀리미터 규모의 NP-오 패턴을 만들기 위해 직접 제작 한 스텐실 마스크를 고용E는 두 번째 방법은 본 서브 밀리미터 스케일 패턴 리프트 오프 리소그래피를 사용합니다. NP-오 박막 스퍼터링 증착 공정에 의해 얻을 수있다, 그들은 마이크로에 손쉬운 통합함으로써 의무가 기존의 미세 기술과 호환됩니다. 이러한 시스템은 높은 효과적인 표면적, 전기 전도도, 및 금 - 싸이 기반 표면의 바이오 콘쥬 게이션에서 해당 혜택을 전기적 주소 바이오 센서 플랫폼 (가) 있습니다. 우리는 몇 가지 바이오 센서에 대한 중요한 성능 매개 변수 포유 동물 세포와 NP-오의 상호 작용을 정량화 세포 배양, 면역 염색, 및 이미지 처리 기술을 설명합니다. 우리는 여기에 설명 된 기술은 다양한 길이 비늘 및 바이오 센서, 에너지 저장 시스템, 촉매 등 다양한 애플리케이션의 플랫폼에서 NP-오의 통합을 지원할 것으로 기대합니다.
Introduction
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Protocol
1. 나노 다공성 골드의 제조
- 피라 냐가 솔루션 깨끗한 기판
- 결정화 접시와 열 ° C 열판에 65 혼합물의 100 ML 황산 (96 %)로 25 ML의 과산화수소 (30 %)를 추가합니다. 주의 : 액체 부식성하고주의하여 취급해야합니다. 그것이 폭발의 위험이 있으므로 소비 솔루션은 밀폐 용기에 저장하지 않아야합니다.
- 장소 내산성 집게 10 분으로 청소를 사용하여 혼합물로 3 인치 현미경 슬라이드 1 인치. 작은 coverslips는을 배치 청소를 위해 자기 면역 염색 보트를 사용합니다. 전에 용액에 침지 ~ 30 초 10 W에서 공기 플라즈마 작은 coverslips를 처리합니다.
- 3 분 동안 탈 이온수 (DI) 흐르는 물에 결정화 요리 청소 샘플을 씻어. 보풀이없는 수건에 질소 총 타격 - 건조 시료.
- 스텐실 마스크 (미리 미터 스케일 패턴을 만들기 위해 이것을 사용 방법 1) 준비
- 생검 펀치 및 / 또는 함께 펀치 250 μm의 두께의 실리콘 엘라스토머 시트는 반 경질 플라스틱 표면에 메스 지역을 절개. 질소 총 이소프로판올 건조 70 %의 가공 엘라스토머 시트를 청소합니다.
- 보풀이없는 클린 수건에 구멍을 뚫은 시트를 배치하고 스텐실에 직면 시료 표면에 스텐실을 통해 피 세정 coverslips를 맞 춥니 다.
- 본 리프트 오프 레지스트 (방법 2 : 서브 밀리미터 스케일의 패턴을 만들기 위해이 옵션을 사용)
- 척 회전에 피 세정 현미경 슬라이드를 삽입하고 질소 총을 가진 모든 입자를 날려. 플라스틱 피펫을 사용하여 유리 슬라이드에 접착 촉진제 (헥사 메틸 디실 아젠)의 1.5 ML을 분배. 30 초 동안 5 초 1,500 rpm을 위해 500 rpm에서 연속적으로 슬라이드를 회전하여 발기인을 확산. 7 분 동안 115 ° C에서 열판에 슬라이드를 구워 5 분 동안 식히십시오.
- 유리 슬라이드 위에 포토 레지스트 4 ML (3 인치 B 분배Y 1 인치). 접착 촉진제와 동일한 프로토콜을 사용하여 슬라이드를 회전시켜 포토 레지스트를 확산. 1.5 분 동안 115 ° C에서 열판에 포토 레지스트를 구워 10 분 동안 식히십시오.
- 15 초 동안 투명 마스크를 통해 : UV 빛을 가진 포토 레지스트 코팅 된 슬라이드 (22 mW의 / cm 2 세기)를 노출합니다. 1.5 분 동안 115 ° C에서 열판에 포토 레지스트를 구워 45 분 동안 기다립니다. 최소 3.5 분 동안 개발자에 노출 된 포토 레지스트를 용해. DI의 물로 씻어. 광학 현미경 개발 패턴을 검사합니다.
- NP-오 얇은 필름을 생산하기 위해 보증금 전구체 금속
- 독립적으로 금,은, 크롬을 증착 할 수있는 스퍼터링 기계로 샘플을로드합니다. 금속 증착을 시작하기 전에 25 mTorr의 아르곤 처리 분위기 하에서 50 W에서 90 초 동안 샘플을 스퍼터 - 청소합니다.
- 10 mTorr의 아르곤 하에서 300 W에서 10 분 동안 크롬 스퍼터. 400 W UN에서 90 초 동안 금 스퍼터데르 10 mTorr의 아르곤. 금은을 끄기 전에 소스를 약 10 초 스퍼터 끄고 100 W. 200 W와 오 전력에서 실버 10 분 동안 금과은을 공동 스퍼터 소스를 스퍼터.
- 전구체의 금속 micropatterns에를 얻을
- 20 초 초음파의 10주기와주기 사이에 2 분 정지를위한 포토 레지스트 스트리퍼 ~ 180 ㎖에 포토 레지스트 코팅 샘플을 초음파 처리. DI 물과 샘플을 씻어 질소 총을 건조. 현미경 금속 패턴을 검사합니다.
- 용착 금속을 나타 내기 위해 두 개의 핀셋을 사용하여 비 포토 레지스트 코팅 샘플에서 탄성 스텐실 껍질.
- 열처리를 통해 Dealloy 전구체 금속 및 수정 나노
- 질산 (70 %) 170 ml의 200 ML 유리 비커를 입력하고 열판에 55 ° C에서 용액의 온도를 유지합니다. 주의 : 질산 매우 부식성이 적절한 보호 장비를 처리해야한다. 이전의 질산으로 침수 30 초 10 W에서 공기 플라즈마 작은 coverslips를 처리합니다. 내산성 집게를 사용하여 비커에 3 인치 현미경 슬라이드로 장소 1 인치 dealloy 그 15 분. 작은 coverslips는을 배치 마크로에 대한 자기 면역 염색 보트를 사용합니다.
- 연속적으로 신선한 탈 이온수로 3 회 채워진 두 개의 비커에서 그들을 담가 dealloyed 샘플을 씻어. DI 물에 샘플을 보관하고 적어도 일주일 동안 매일 신선한 DI 물과 물을 교체합니다. 사용하기 전에 보풀이없는 수건에 질소 총 타격 - 건조 시료.
- 급속 열처리 장비 깨끗한 실리콘 웨이퍼에 샘플을로드합니다. 200 ° C와 450 ° C와 램프 속도 사이에 온도를 조정 ~ 10 ° C / 초. 질소 대기 하에서 10 분 동안 소정의 온도로 시료를 노출합니다. 챔버 식지 (<100 ° C) 및 샘플을 제거합니다. 또한, 천천히 열 트리트 위해 열판에서 샘플을 배치천만에.
2. 세포 배양
- 세포 배양을위한 NP-오 샘플을 준비
- 장소는 NP-오 폴리스티렌 요리 샘플 및 30 초 10 W에서 공기 플라즈마 처리 24 잘 조직 배양 플레이트에 샘플을 전송합니다.
- 각 well에 500 ㎕의 완전한 문화 미디어 (10 % 태아 소 혈청, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신과 Dulbecco의 수정 된 이글 매체)를 추가합니다. 37 가습 배양기에서 저장 ° C와 세포를 (<1 시간) 파종까지 5 % CO 2.
- 유지 관리 통로, 그리고 종자 세포
- 문화 미디어 세포가 70 %의 합류이다 통로 T75 플라스크에 관심 세포를 (이 경우 3T3-NIH의 섬유 아세포 또는 생쥐 성상)을 유지한다.
- 셀과 Passaging를 들어, 술병에서 미디어를 제거하고, 10 ㎖ 인산로 두 번 세척 식염수 (PBS)는, 세포 분리 (~ 10 분)까지 1X 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 부화 2 ㎖를 추가 버퍼. 3 ML 신선한 매체를 추가하고3 분 동안 1,200 rpm으로 원심 분리기. 뜨는을 대기음 2 ML 매체에서 펠렛을 일시 중지합니다.
- 우물과 씨앗 25,000 세포 / 1 ML의 최종 볼륨 cm 2의 밀도에 유리 coverslips를 끌어 세포에서 보냈다 용지를 제거합니다. 샘플을 통해 세포의 균일 한 코팅을 보장하기 위해 앞으로 뒤로 좌우 문화 판을 흔들어. 매일 검사하는 동안 분석 될 때까지 세포를 품어.
3. 셀 및 재료 분석
- 골격과 핵을 시각화하는 세포를 얼룩
- 우물에서 보낸 미디어를 제거하고 PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. 15 분 동안 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 고정합니다.
- 1 % 소 혈청 알부민 PBS에서 300 nm의 알렉사 플 루어 488 Phalloidin의의 얼룩 솔루션을 준비합니다.
- PBS로 두 번 세포를 씻으, 5 분 동안 500 ㎕의 0.1 % 트리톤 PBS에서 X-100에서 그들을 permeabilize.
- PBS로 두 번 세포를 씻으 우물을 청소하도록 전송합니다. 오점 50-20 분 샘플과 어둠에 보관 상 200 μL 염색 솔루션입니다.
- PBS 5 분 동안 PBS에서 DAPI 3 m로 카운터 얼룩 세포를 씻으십시오.
- PBS로 세포를 씻어 투명 매니큐어와 설치 미디어 및 인감 커버 유리 슬라이드에 장착하기 전에 증류수에 담근다.
- NP-의 Au 표면에 NP-오 샘플 및 세포 배양의 이미지를 얻기
- 이미지 NP-오의 이차 전자 검출기를 사용하여 10 kV의 전자 에너지에서 50,000 X 배율과 전자 현미경 (SEM)을 스캐닝 표면.
- 적절한 필터 큐브 10X 배율에서 거꾸로 형광 현미경을 사용하여 샘플에 다른 장소에서 복합 세포의 이미지를 캡처합니다.
- 프로세스 이미지는 모공 세포 형태를 결정
- ImageJ에와 해당하는 경우 각각의 채널로 분할 이미지 열기. 8 비트 이미지를 변환, 배경 빼기 및 중간 filteri하여 그들을 부드럽게NG. 수동으로 또는 기공 (빈 공간)와 세포 기관 / 핵을 강조하기 위해 알고리즘을 thresholding을 내장하여 임계 값을 조정합니다.
- 병합 모공이나 세포를 분리하는 유역 명령을 사용합니다. 입자 분석 매개 변수를 설정하고 입자 입자의 평균 영역 및 백분율 범위의 번호를 추출하는 명령을 실행합니다. %의 커버리지를 정량화 세포 계수 및 Phalloidin의 스테인드 세포의 이미지를 DAPI 염색 세포의 이미지를 사용합니다.
- 여러 이미지를 일괄 분석을 수행하기 위해 포함 된 매크로 파일을 수정합니다.
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Representative Results
그림 1은 배양 세포를 NP-오 패턴을 만드는 나노 구조를 정량화하고, 세포의 형태학의 특성을 포함하여 주요 절차 단계를 설명합니다. 그림 2a에서와 같이 탄성 스텐실 (TOP) 아래 이미지에서와 같이 NP-오 패턴을 만드는 데 사용됩니다. 그림 2B는 일괄 처리 시편 도자기 보트의 사진입니다. 그림 2C는 용착 금속 패턴의 색 변화를 표시 이전과 마크로 후. 은빛 마무리 (마크로 이전)는 실버가 풍부한 합금 내용 때문이다. 마크로에, 영화는 눈에 띄게 오렌지 - 갈색 색조를 얻습니다. 그림 2D는 금속의 포토 리소그래피 패터닝에 의해 생성 된 미세한 기능을 보여줍니다. 다른 기공 형태소 그림 3에서와 같이 NP-오 영화 9의 열 처리에 의해 얻을 수 있습니다. 단면 이미지 (그림URE 3) 필름은 필름의 두께를 균일하게 dealloyed 여부를 알 수 있습니다. SEM 이미지는 빈 공간 (코드 1)의 크기와 %의 범위를 결정하기위한 바이너리 이미지 (그림 3 아래쪽 행)에 (역치) 분할 할 수 있습니다. NP-의 Au 표면에 배양 부착 쥐 성상 세포의 대표 형광 이미지는 그림 4에 표시됩니다. 이미지의 각 채널은 세포 물질의 상호 작용을 분석하기위한 바이너리 이미지를 생성하기 위해 분할 및 분할 할 수 있습니다. 분할 세포의 핵 이미지 셀 카운팅 (코드 3)에 대한 유용하지만 세그먼트 골격의 이미지는 셀 영역 및 표면 적용 (코드 2)를 정량화하기 위해 사용될 수있다. 그림 5는 NP-오 구조물의 제조에있는 일반적인 실패의 시각적 요약 가난한 필름 접착, 다공성 부재, 과도한 열 치료를 포함.
그림 1. 주요 처리 과정의 개략도가. 산성 세척 기판은 하나 수동으로 컷 스텐실 마스크 나 photolithographically 무늬의 포토 레지스트 층으로 가면된다. 금은 목표를 동시에 마스크 유리 기판에 패턴을 전송은 풍부한 금 합금을 만들 스퍼터링 있습니다. 합금 패턴은 나노 기공 금 (NP-오) 패턴을 만들 수있는 질산 dealloyed 수 있습니다. 관심 세포 샘플을 배양하고 그들이 형광 두 생물 형태 학적 특징을 추출하기 위해 전자 현미경을 스캔 몇 군데 있습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. 광학 이미지 () NP-오 배열 (아래) 생산 패턴 전구체 금은 합금에 사용되는 실리콘 스텐실 (상단). (B) 일괄 처리 시편 도자기 보트, (다) 일반 색상 AuAg 스퍼터링 합금 (상단)와 dealloyed 필름 (하단) 및 (d)에 금은 증착시 포토 리소그래피 마스크에 의해 생성 된 고해상도 NP-오 패턴.
그림 3. NP-오 SEM 이미지 (맨 윗줄)와 추출 평균 공극 크기에 사용되는 해당 세그먼트와 이미지 (아래쪽 행)ND 퍼센트 무효 범위는 쪼개진 NP-오 샘플의. SEM 이미지 (오른쪽)은 필름의 두께를 균일 한 기공 구조를 표시합니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 4. F-액틴 복합 (녹색)과 파란색에서 녹색 채널과 세포 수의 백분율 셀 커버리지를 추출 세그먼트입니다 핵 (파란색) 스테인드 세포의 이미지.
그림 5. 일반적인 실패의 이미지. () 박리(B) 합금의 부족은 내용에 따라 마크로 후 다공성 부재; 열처리 온도가 너무 높은 것으로 인한 NP-오의 (C) 완전 소결 필름 크롬의 부족 접착제 층에 의한 마크로 중.
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Discussion
우리는 마이크로 시스템즈 생물학 연구에서이 영화의 사용을 확장하는 micropattern과 NP-오 필름에 두 가지 방법을 보여줍니다. 스퍼터 코팅 금은 스퍼터링은 기존의 미세 공정과 합금 조성 및 두께는 쉽게 각 스퍼터링 건 힘의 변화에 의해 제어 (금과은 대상에 대한) 될 수 있습니다와 호환이기 때문에, NP-오 패턴을 생성하는 다양한 방법 각각 증착 시간입니다. 전형적인 NP-오 필름은 200 nm의에서 2 μm의 범위를 두께. 생검 펀치와 메스를 사용하여 스텐실 방법 (방법 1, 그림 2A)는 포토 리소그래피에 대한 필요성을 우회 밀리미터 규모의 패턴을 만들 수 있습니다. 더 복잡한 패턴은 프로그래밍 레이저 절단기에 의해 생성 될 수 있습니다. 준수 실리콘 엘라스토머 스텐실 유리 표면에 자기 묻은하여 마스크와 증가하는 패턴 해상도 아래 금속 증착을 방지 할 수있다. 그러나 작은 F스텐실의 두께는 마스크의 구멍을 통해 균일 한 금속 증착을 방지로 eatures (<1mm)은 일반적으로이 방법으로 생산하기가 어렵습니다. 높은 기능 해상도를 필요로하는 응용 프로그램은 포토 리소그래피 패터닝 (방법 2, 그림 2D)를 얻을 수있다. 포토 리소그래피를 통해 패턴을 전송하는 투명 마스크는 여러 회사 (예를 들어, 출력시, 밴든, 오리건)에서 얻은 최소한의 필요한 기능의 크기가 ~ 20 μm의 이상이다 크롬 유리 마스크에 경제적 인 대안 될 수 있습니다. 준수 스텐실 위에 금속 증착은 때때로 비 균일 응력 발생에 의한 기판 스텐실의 초연에 이어집니다. 우리는 일반적으로 가장자리에 폴리이 미드 테이프를 사용하여 기본 기판에 스텐실을 확보하여이 문제를 완화.
같은 원형 coverslips는 같은 더 작은 샘플 (12mm 직경)는 일반적으로 우리의 연구에 사용될 때, 도자기 보트에 표시
NP-오 필름의 열 치료 기공 형태 (그림 3)을 수정하기위한 편리한 제어 방법입니다. 급속 열처리 열처리 장비가 열 치료를 위해 바람직하지만, 용광로 및 핫 플레이트도 가능 결과를 생성합니다. 티그는 열 용량 및 온도는 NP-오와 기공 (그림 5C)의 실종 소결을 완료로 이어질 수 있습니다 높은 온도 (> 500 ° C)로,주의 깊게 모니터링해야한다. 입금 합금 (60 % 미만은. %로)의 부족은 내용은 기공 형성 (그림 5b)을 방지 할 수 있습니다.
앞서 언급 NP-오 코팅 표면에 가능한 세포 배양을 확립하기 위해, 완전히 다공성 네트워크에서 질산 잔류 물을 제거하는 여러 가지 물 변경 DI 물에 샘플을 흡수하는 것이 중요합니다. 그것은 세포를 파종하기 전에 특정 세포 외 기질 (ECM) 단백질과 표면을 처리하는 데 필요한되지 않은 동안, 우리는 플라즈마 처리와 이전에 세포를 파종하는 세포 배양 배지에서 샘플을 적시는 크게 세포 접착과 생존을 향상 것을 관찰했다. 이 개선은 CE의 혈청에서 가능성이 가장 높은 접착 단백질의 비특이적 흡착에 의한NP-의 Au 표면에 LL 문화 미디어. 혈청이없는 배지를 필요로 세포 배양 조건의 경우, ECM 분자 (예를 들어, 피브로넥틴)로 사전 처리 NP-의 Au 표면 필요할 수 있습니다.
기공 / 무효의 크기 및 범위뿐만 아니라, 세포 수 및 세포의 범위를 결정하기위한 이미지 (그림 3, 4 참조) 진 블랙 & 화이트 이미지로 변환 할 필요가 - 프로세스는 분할로 알려져 있습니다. 이 사용자 바이어스하는 경향이 임계 값 회색 값을 따기 필요합니다. 따라서, 이미지 처리에 의해 결정된 절대 값은주의해서보고해야한다. 대부분의 연구는 세포와 나노 구조의 다른 형태학의 비교를 필요로하므로,만큼 분석 매개 변수 (예를 들어, 임계 값, 입자 크기 창) 샘플 일관성 유지 될 때, 통계적 유의성은 샘플의 상대적으로 작은 숫자로 얻을 수있다. 영상 분할 이전에, 또한 도움이 그것입니다이미지를 부드럽게하고 ImageJ에있는 내장 명령 (또는보다 전문적인 버전, 피지)를 사용하여 배경을 빼야합니다. 우리는 일괄 처리를 여러 이미지에 포함 된 매크로 (보충 코드 파일 1-3)의 매개 변수를 조정합니다.
우리는 여기에서 설명하는 기술은 여러 전극의 전기 생리학에 대한 배열, 바이오 센서 및 소형 에너지 저장 체계를 포함하여 마이크로로 NP-오 통합에 과학계 도움을 것으로 기대합니다. 또한, 우리는 반 정량적 이미지 처리 방법 재료 및 접착 세포의 상호 작용에 대한 연구의 광범위한 도움이 될 것이라고 믿는다.
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Disclosures
저자는 충돌하는 재무 적 이해 관계를 가질 수 없습니다.
Acknowledgments
O. 쿠 르툴 루스와 D. Dimlioglu는 캘리포니아 대학 실험실 비용 연구 프로그램 상 12 LR-237197에 의해 지원됩니다. P. Daggumati는 과학 및 엔지니어링 (RISE) 상에있는 캘리포니아 대학교 데이비스 연구 투자의 대학에 의해 지원됩니다. CA 채프먼은 국립 필요 원정대의 교육 대학원 지원 분야의 부서에 의해 지원됩니다. 이 작품은 UC 랩 수수료 연구 프로그램, UC 데이비스 상승 및 엔지니어링 창업 자금 UC 데이비스 대학에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold target | Lesker | EJTAUXX403A2 | Precursor to alloy for producing np-Au |
| Chrome target | Lesker | EJTCRXX353A2 | Adhesive layer |
| Silver target | Lesker | EJTAGXX403A2 | Precursor to alloy for producing np-Au |
| Porcelain boat | Thomas Scientific | 8542E40 | Used for processing small samples |
| Nitric acid | Sigma-Aldrich | 43873 | Used at 70% for dealloying |
| Sulfuric acid | J.T Baker | 7664-93-9 | Used at 96% for piranha cleaning |
| Hydrogen peroxide | J.T Baker | 7722-84-1 | Used at 30% for piranha cleaning |
| Biopsy punches | Ted Pella | 150xx | Available in several sizes |
| Silicone elastomer sheets | Rogers Corporation | HT 6240 | Available in several thicknesses |
| Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich | 440191-100ML | Used as adhesion promoter for positive resist |
| Microposit MF CD26 | Shipley | 38490 | Positive photoresist developer |
| PRS 3000 | J.T Baker | JT6403-5 | Positive photoresist stripper |
| Circular glass coverslips (12 mm) | Ted Pella | 26023 | Used as substrate for metal patterns and cell culture |
| Glass slides (1 x 3 inch) | Ted Pella | 26007 | Used as substrate for metal patterns |
| Kapton polyimide tape | VWR | 82030-950 | Used for securing elastomer |
| Transparency masks | Output City | Used in photolithography http://www.outputcity.com/ | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | Used for activating glass surfaces |
| Sputtering machine | Kurt J. Lesker | LAB18 | Used for depositing metals |
References
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