Microfabrication av nanoporösa Guld Mönster för Cell-material interaktionsstudier

Summary

Vi rapporterar om tekniker till micropattern nanoporösa guld tunna filmer via stenciltryckning och fotolitografi, liksom metoder att odla celler på mikrotillverkade mönster. Dessutom beskriver vi bildanalysmetoderna att karakterisera morfologin av materialet och de odlade cellerna med hjälp av svepelektron-och fluorescenstekniker mikroskopi.

Abstract

Nanostrukturerade material med funktionen storlekar i tiotals nanometer har förbättrat prestandan av flera tekniker, bland annat bränsleceller, biosensorer, biomedicinska beläggningar enhet, och drog verktyg leverans. Nanoporös guld (NP-Au), som produceras av en nano-skala självorganiserande processen, är ett relativt nytt material som uppvisar stor effektiv yta, hög elektrisk ledningsförmåga och katalytisk aktivitet. Dessa egenskaper har gjort NP-Au ett attraktivt material för forskarsamhället. De flesta studier på NP-Au anställa makronivå exemplar och fokusera på grundläggande vetenskap av materialet och dess katalytiska och sensor applikationer. De makronivå exemplar begränsar NP-Au: s potential i miniatyriserade system, inklusive biomedicinska anordningar. För att ta itu med dessa frågor, beskriver vi inledningsvis två olika metoder för att micropattern NP-Au tunna filmer på styva substrat. Den första metoden använder manuellt producerade stencil masker för att skapa millimeter skala NP-Au mönster, while den andra metoden använder lift-off fotolitografi till mönster sub-millimeter-skala mönster. Som NP-Au tunna filmer erhålls genom sputter-avsättningsprocessen, de är kompatibla med konventionella mikrotillverkningstekniker, därmed mottagliga för enkel integrering i mikrosystem. Dessa system inkluderar elektriskt adresserbara biosensor plattformar som gynnas av höga effektiva yta, elektrisk ledningsförmåga, och guld-tiol-baserade yta bioconjugation. Vi beskriver cellodling, immunfärgning och bild tekniker bearbetning för att kvantifiera NP-Au: s interaktion med däggdjursceller, vilket är en viktig prestation parameter för vissa biosensorer. Vi förväntar oss att de tekniker som visas här kommer att underlätta integrationen av NP-Au i plattformar vid olika längd-skalor och i många tillämpningar, inklusive biosensorer, energilagringssystem, och katalysatorer.

Introduction

Protocol

Ett. Nanoporösa Gold Fabrication

1. Rena substrat i Piranha-lösning
   1. Lägg 25 peroxid ml väte (30%) till 100 ml svavelsyra (96%) i en kristallisering skålen och värm blandningen till 65 ° C på en värmeplatta. VARNING: vätskorna är extremt frätande och måste hanteras varsamt. Den förbrukade lösningen ska inte förvaras i en sluten behållare, eftersom det kan explodera.
   2. Placera 1-tums med 3-tums objektglas i blandningen med syrafasta pincett och rengör dem i 10 min. Använd en båt porslin immunfärgning för kull-rengöring små täckglas. Behandla små täckglas med luft plasma vid 10 W under 30 sekunder innan den nedsänks i lösningen.
   3. Skölj de rengjorda prover i kristallisering disken under rinnande avjoniserat (DI) vatten i 3 min. Föning prover med en kväve pistol över luddfria handdukar.
2. Förbered stencil mask (Metod 1: Använd detta för att skapa millimeter skala mönster)
   1. Punch 250 ^ m tjocka silikonbaserade elastomera ark med biopsi stansar och / eller incisionsfilm ut regioner med en skalpell över ett halvhårt plastytan. Rengör bearbetade elastomer ark i 70% isopropanol och torka med kväve pistol.
   2. Placera stansade skivan på en luddfri renrum handduk och anpassa piraya-rengjorda täckglas över schablonen med provets yta vänd mot schablonen.
3. Mönster lift-off fotoresist (Metod 2: Använd detta för att skapa sub-millimeter-skala mönster)
   1. Placera en piraya rengjorda objektglas på spinning chuck och blåsa bort eventuella partiklar med kväve pistol. Dosera 1,5 ml vidhäftningspromotor (hexametyldisilasan) på glasskivan med en plast pipett. Sprid promotorn genom att snurra bilden successivt vid 500 rpm i 5 sek och 1.500 rpm i 30 sek. Grädda bilden på en värmeplatta vid 115 ° C under 7 minuter och låt den svalna i 5 minuter.
   2. Dispensera 4 ml av fotoresist på glasskivan (3-tums by 1-tum). Sprid fotoresist genom att snurra objektglaset med samma protokoll som för det vidhäftningsförbättrande medlet. Grädda fotoresist på en värmeplatta vid 115 ° C under 1,5 minuter och låt den svalna i 10 min.
   3. Exponera fotoresist-belagda objektglas med UV-ljus (intensitet: 22 mW / cm ²⁾ genom ett dia mask för 15 sek. Baka fotoresisten på en värmeplatta vid 115 ° C under 1,5 min och vänta 45 min. Lös den exponerade fotoresist i utvecklaren under minst 3,5 minuter. Skölj noga med avjoniserat vatten. Inspektera de utvecklade mönster under ett optiskt mikroskop.
4. Deposit föregångare metaller för att producera NP-Au tunna filmer
   1. Ladda proverna till ett förstoftningsförfarande maskin som självständigt kan sätta in guld, silver och krom. Sputter-rengöra prover för 90 sek på 50 W under 25 mTorr argon bearbetning atmosfär innan metallavsättning.
   2. Sputter krom i 10 min vid 300 W under 10 mTorr argon. Sputter guld för 90 sekunder vid 400 W under 10 mTorr argon. Co-spotta guld och silver i 10 min med silver på 200 W och Au effekt på 100 W. Stäng av guld spotta källa cirka 10 sekunder innan du stänger av silver spotta källan.
5. Skaffa micropatterns prekursor metall
   1. Låt ligga fotoresist-belagda prov i ~ 180 ml fotoresist strippa för 10 cykler av 20 sek ultraljudsbehandling och 2 min paus mellan cyklerna. Skölj proven med avjoniserat vatten och torka med en kväve pistol. Inspektera metall mönster under ett mikroskop.
   2. Peel elastomer stencil från icke-fotoresistöverdragna prover med två pincett för att avslöja den avsatta metallen.
6. Dealloy föregångare metall och ändra nanostructure via värmebehandling
   1. Fyll en 200 ml glasbägare med 170 ml salpetersyra (70%) och hålla lösningens temperatur vid 55 ° C på en värmeplatta. VARNING: Den salpetersyra är starkt frätande och bör hanteras med lämplig skyddsutrustning. Behandla små täckglas med luft plasma på 10 W för 30 sekunder före nedsänkning i salpetersyra. Placera 1-tums med 3-tums objektglas i bägaren med syrafasta pincett och dealloy dem i 15 min. Använd en båt porslin immunfärgning för kull-dealloying små täckglas.
   2. Skölj dealloyed proverna genom successiv nedsänkning dem i två bägare fyllda med färskt Dl-vatten tre gånger. Förvara proverna i DI vatten och ersätta vattnet med färska DI vatten varje dag i minst en vecka. Föning prover med en kväve pistol över luddfria handdukar före användning.
   3. Ladda prover på en ren kiselskiva i en snabb termisk behandling utrustning. Justera temperaturen till mellan 200 ° C och 450 ° C och ramphastigheten till 10 ° C / sek. Exponera proverna till den föreskrivna temperaturen under 10 minuter under kväve ambient. Låt kammaren svalt (<100 ° C) och avlägsna proverna. Alternativt, långsamt placera proverna på kokplattan för termisk treatment.

2. Cellodling

1. Förbered NP-Au prover för cellodling
   1. Placera NP-Au prover i polystyren rätter och behandla med luft plasma på 10 W för 30 sek och överföra proverna till 24-brunnars vävnadsodlingsplattor.
   2. Lägg 500 | il komplett odlingsmedium (Dulbeccos Modified Eagle Medium med 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin / streptomycin) till varje brunn. Lagra i en fuktad inkubator vid 37 ° C och 5% _CO2 tills ympning av celler (<1 timme).
2. Underhålla, passage, och utsäde celler
   1. Behåll celler av intresse (i detta fall 3T3-NIH fibroblaster eller murina astrocyter) i T75-kolvar med odlingsmedier och passage när cellerna är 70% sammanflytande.
   2. För passage av cellerna, ta bort media från flaskan, tvätta två gånger med 10 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS), tillsätt 2 ml 1x trypsin / EDTA och inkubera tills celler bort (~ 5 min). Tillsätt 3 ml färskt medium ochcentrifugera vid 1200 rpm under 3 min. Aspirera supernatanten och suspendera pelleten i 2 ml medium.
   3. Ta bort de förbrukade mediet från brunnarna och ympa celler på täckglas av glas vid en densitet på 25.000 celler / cm ² med en slutlig volym av 1 ml. Skaka odlingsplattan framåt-bakåt och höger-vänster för att säkerställa en enhetlig beläggning av celler över proverna. Inkubera cellerna tills analys medan inspekterar dagligen.

Tre. Cell-och Materialanalys

1. Stain celler att visualisera cytoskelettet och kärnor
   1. Ta förbrukade media från brunnarna och tvätta cellerna två gånger med PBS. Fix celler i 4% paraformaldehyd i PBS i 15 min.
   2. Bered färgning lösning av 300 nM Alexa Fluor 488 phalloidin i PBS med 1% bovint serumalbumin.
   3. Tvätta cellerna två gånger med PBS, och permeabilisera dem i 500 | il 0,1% Triton X-100 i PBS i 5 min.
   4. Tvätta cellerna två gånger med PBS och överföra dem till rena brunnar. Blot 50-200 pl färgningslösningen på proven och förvara i mörker under 20 minuter.
   5. Tvätta cellerna med PBS och motfärgning med 3 nM av DAPI i PBS i 5 min.
   6. Tvätta cellerna med PBS och doppa i avjoniserat vatten innan montering på objektglas skyddsglas med montering media och täta med genomskinligt nagellack.
2. Förvärva bilder av NP-Au prover och cellkulturer på NP-Au ytor
   1. Bild NP-Au ytor med svepelektronmikroskop (SEM) med 50.000 gångers förstoring vid 10 kV elektronenergi använder sekundär elektron detektor.
   2. Fånga sammansatta cellbilder på olika ställen på proverna med ett inverterat fluorescens mikroskop vid 10x förstoring med lämpliga filter kuber.
3. Bearbeta bilder för att bestämma por och cell morfologi
   1. Öppna bilder i ImageJ och delas upp i individuella kanaler om tillämpligt. Konvertera bilderna till 8-bitars, subtrahera bakgrunden, och jämna ut dem genom median filtering. Justera tröskelvärdet antingen manuellt eller genom inbyggda tröskling algoritmer för att belysa de porer (hålrum) och organ cell / kärnor.
   2. Använd vattendelare kommando att separera sammanslagna porer eller celler. Ställ parametrar partikel analys och kör kommandot för att extrahera antalet partiklar, genomsnittlig area och procent täckning av partiklar. Använd DAPI-färgade cellbilder för cellräkning och phalloidin-färgade bilder cell för att kvantifiera täckning procent cell.
   3. Ändra inkluderade makro-filer för att utföra parti analys av flera bilder.

Representative Results

Figur 1 visar vilka stora processuella åtgärder, inklusive att skapa NP-Au mönster, odling av celler, kvantifiera nanostruktur, och karakterisera cell morfologier. Elasten stencil visas i figur 2a (överst) används för att skapa de NP-Au mönster som visas på bilderna nedanför. Är ett fotografi av porslin båten för prover batch-bearbetning Figur 2b. Figur 2c visar färgförändring av de deponerade metallmönster före och efter dealloying. Den silverglänsande yta (före dealloying) beror på silver-rika legering innehåll. Vid dealloying, förvärvar filmen en synligt orange-brun nyans. Figur 2d illustrerar de finare funktionerna producerade av fotolitografisk mönstring av metallen. Olika pore morfologier kan erhållas genom värmebehandling av np-Au filmerna ^9, såsom visas i fig. 3. Den tvärsnitt bilden (Figure 3) avslöjar om filmerna dealloyed jämnt genom filmen tjocklek. De SEM-bilder kan segmenteras (thresholded) till binära bilder (Figur 3 nedre raden) för att bestämma storlek och procent täckning av hålrum (kod 1). Ett representativt fluorescensbild från tillhörande murina astrocyternas celler odlade på ett NP-Au ytan visas i figur 4. De enskilda kanalerna i bilden kan vara split och segmenterad att producera binära bilder för analys av cell-material interaktioner. Segmenterade cytoskeleton bilder kan användas för att kvantifiera cell området och yttäckning (kod 2), medan de segmenterade cellulära nucleus bilder är användbara för cellräkning (kod 3). Figur 5 är en visuell sammanfattning av gemensamma fel i tillverkning av np-Au strukturer , inklusive dålig film vidhäftning, frånvaro av porositet, och överdriven termisk behandling.

Figur 1. Schematisk illustration av de stora processteg. Syra rengjorda substrat antingen maskeras med en manuellt skuren stencil mask eller fotolitografiskt-mönstrade fotoresistskiktet. Guld och silver mål samtidigt fräste att skapa en silver-rika guld-legering, där maskerna överföra mönster på glaset substraten. Alu mönster är dealloyed i salpetersyra för att skapa nanoporös guld (NP-Au) mönster. Celler av intresse odlas på proven och de är avbildade med fluorescens och svepelektronmikroskop för att extrahera både biologiska och morfologiska egenskaper. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2. Optiska bilder A (a) silikon stencil (överst) som används för mönstring prekursor guld-silver-legering, som producerar NP-Au array (botten),. (B) porslin båt för prover gruppbearbeta, (c) typiska färgen sputtrad AuAg legering (överst) och dealloyed film (botten), och (d) högre upplösning NP-Au mönster som fotolitografisk maskning under guld-silver nedfall.

Figur 3. Np-Au SEM-bilder (övre raden) och motsvarande segmenterade bilder (nedre raden) som används för att utvinna genomsnittliga void storlek ennd procent void täckning. SEM-bild (överst till höger) i en kluven NP-Au prov visar homogen porstruktur genom filmen tjocklek. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 4. En sammansatt F-aktin (grön) och kärnan (blå) färgad cell image, vilket är segmenterad att utvinna täckning procent cell från den gröna kanalen och celltal från blå.

Figur 5. Bilder av typiska fel. (A) delamineringunder dealloying grund av otillräcklig klisterskikt av krom, (b) frånvaron av porositet efter dealloying grund av otillräcklig silverhalt i legeringen, och (c) fullständig sintring av np-Au-film på grund av termisk behandling temperaturen är för hög.

Discussion

Vi visar två olika tekniker för att micropattern NP-Au filmer för att utvidga användningen av dessa filmer i mikrosystem och biologiska studier. Sputter-beläggning guld och silver är en mångsidig metod för att skapa np-Au mönster, eftersom förstoftning är kompatibel med konventionella mikrofabrikationslaboratorier processer och legeringskompositionen och tjocklek kan enkelt kontrolleras genom att variera de enskilda förstoftning gun befogenheter (för guld och silver mål) och deponeringstiden respektive. Typiska NP-Au filmtjocklekarna intervallet från 200 nm till 2 pm. Den stencil (metod 1, figur 2a) med biopsi stansar och skalpell gör för att skapa millimeter skala mönster kringgår behovet av fotolitografi. Mer komplicerade mönster kan framställas genom en programmerbar laserskärare. Den kompatibel silikonelastomer stencil själv-fäster på glas ytor och hindrar därmed metallbeläggning under masken och ökande mönster upplösning. Men mindre features (<1 mm) är vanligtvis svåra att tillverka med denna metod, eftersom tjockleken av schablonen förhindrar enhetlig metallbeläggning genom öppningarna i masken. Applikationer som kräver högre upplösning funktionen kan uppnås med fotolitografisk mönstring (Metod 2, figur 2d). De insyn masker för att överföra mönster via fotolitografi kan erhållas från flera företag (t.ex. Utgång Stad, Bandon, OR) och är ekonomiska alternativ till krom-glas masker när minsta önskade funktionen storlekar är mer än ~ 20 um. Metallen avsättning på det eftergivliga stencilen leder ibland till avlossning av schablonen från substratet på grund av icke-jämn spänningsfördelning generation. Vi mildra typiskt denna fråga genom att fästa stencilen till det underliggande substratet med hjälp av en polyimidband vid kanterna.

När mindre prover, såsom cirkulära täckglas (12 mm diameter) som normalt används i våra studier, porslin båtar som visas i (t.ex. ren, dealloy) flera små prover. Satsen bearbetning av prover ökar likformigheten av den producerade nanostruktur mellan olika prover. Små prover tenderar att flyta när nedsänkning i piranha eller dealloying lösningar, eftersom de blir hydrofoba vid förvaring i luft. Innan något steg som kräver prover att vara nedsänkt i vätska, plasma behandla dem (10 W i 30 sekunder) gör glasytan hydrofil och hjälper till att mildra den flytande frågan. Det vanligaste problemet i att producera NP-Au filmerna är delaminering under dealloying steget. Detta är vanligtvis tillskrivs dragspänning ackumulering grund volymkrympning under dealloying ^21. För att förhindra delaminering, är det viktigt att ha en stark vidhäftning mellan NP-Au filmen och substratet. Detta uppnås genom ett tillräckligt tjockt krom (~ 150 nm) och mellanliggande ggamla skikt (~ 200 nm). Avsatta filmerna bör visas ljust till mörkt grå när den ses från baksidan av ett transparent substrat. Den skalade filmen visas i figur 5a är ett bra exempel på hur baksidan av filmen inte ska se ut - det guld-fullföljande indikerar att kromskiktet inte är tillräckligt tjock för att säkerställa god vidhäftning. En annan orsak till delaminering är oren provytan, därför är det viktigt att piraya-rena ytor före beläggning med metall. Dessutom är det viktigt att se till att fotoresisten är fullt utvecklad innan avsättning av filmen, eftersom eventuell kvarvarande fotoresist förhindrar stark vidhäftning av avsatt metall på glasytan.

Termisk behandling av np-Au filmerna är ett bekvämt och kontrollerbar metod för modifiering por morfologi (Figur 3). Även en snabb termisk glödgning instrument är önskvärt för termisk behandling, ugnar och spisplattor producerar även acceptabla resultat. Than termisk dos och temperaturen bör övervakas noga, eftersom höga temperaturer (> 500 ° C) kan leda till fullständig sintring av NP-Au och försvinnandet av porositet (figur 5c). Otillräcklig silverhalten i den avsatta legeringen (mindre än 60% silver, på.%) Förhindrar också porositet bildningen (figur 5b).

För att fastställa viabla cellkulturer på de ovannämnda NP-Au belagda ytor, är det viktigt att dra proverna i Dl-vatten med flera vattenbyten för att helt ta bort salpetersyran återstoden från det porösa nätverket. Även om det inte har varit nödvändigt att behandla ytorna med specifika extracellulära matrix (ECM)-proteiner innan sådd av cellerna, observerade vi att plasmabehandling och blötläggning av proverna i cellodlingsmedium före sådd av cellerna drastiskt förbättra cellvidhäftning och livskraft. Denna förbättring är sannolikt på grund av icke-specifik adsorption av adhesionsproteiner från serumet i cell kultur media till np-Au yta. För cellodlingsbetingelser som kräver serumfritt medium, kan det vara nödvändigt att förbehandla np-Au yta med ECM-molekyler (t.ex. fibronektin).

För bestämning por / void storlek och täckning, liksom celltal och cell täckning, bilder måste konverteras till binära svartvita bilder (se figur 3 och 4) - processen är också känd som segmentering. Detta kräver att plocka ett tröskelvärde gråvärde som är benägna att användaren-bias. Därför bör absoluta värden fastställda av bildbehandling rapporteras med försiktighet. De flesta studier kräver en jämförelse av olika morfologier av celler och nanostruktur, därför, så länge de analysparametrar (t.ex. tröskeln, partikelstorlek fönster) hålls konsekvent mellan prover, kan statistisk signifikans uppnås med ett relativt litet antal prover. Före bildsegmentering, är det också braatt jämna ut bilderna och subtrahera bakgrunden med hjälp av de inbyggda kommandona i ImageJ (eller en mer specialiserad version, Fiji). Vi justerar parametrarna i den medföljande makrot (Supplemental kodfiler 1-3) till batchprocess flera bilder.

Vi förväntar oss att de som visat här kommer att bistå det vetenskapliga samfundet att integrera NP-Au i mikrosystem, inklusive flera elektrodanordningar för elektrofysiologi, biosensorer och miniatyr energiprogram lagring. Dessutom tror vi att de semi-kvantitativa bildbehandlingsmetoder kommer att vara värdefullt för ett brett spektrum av studier om samspelet mellan material och vidhäftande celler.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gold target	Lesker	EJTAUXX403A2	Precursor to alloy for producing np-Au
Chrome target	Lesker	EJTCRXX353A2	Adhesive layer
Silver target	Lesker	EJTAGXX403A2	Precursor to alloy for producing np-Au
Porcelain boat	Thomas Scientific	8542E40	Used for processing small samples
Nitric acid	Sigma-Aldrich	43873	Used at 70% for dealloying
Sulfuric acid	J.T Baker	7664-93-9	Used at 96% for piranha cleaning
Hydrogen peroxide	J.T Baker	7722-84-1	Used at 30% for piranha cleaning
Biopsy punches	Ted Pella	150xx	Available in several sizes
Silicone elastomer sheets	Rogers Corporation	HT 6240	Available in several thicknesses
Hexamethyldisilazane	Sigma-Aldrich	440191-100ML	Used as adhesion promoter for positive resist
Microposit MF CD26	Shipley	38490	Positive photoresist developer
PRS 3000	J.T Baker	JT6403-5	Positive photoresist stripper
Circular glass coverslips (12 mm)	Ted Pella	26023	Used as substrate for metal patterns and cell culture
Glass slides (1 x 3 inch)	Ted Pella	26007	Used as substrate for metal patterns
Kapton polyimide tape	VWR	82030-950	Used for securing elastomer
Transparency masks	Output City		Used in photolithography http://www.outputcity.com/
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G	Used for activating glass surfaces
Sputtering machine	Kurt J. Lesker	LAB18	Used for depositing metals