Summary
프로토콜은 대규모 유전자형을 수행 Illumina 사 Infinium의 분석법을 사용하는 것이 기재되어있다. 이러한 분석은 안정적으로 사흘 만에 개인의 DNA 샘플의 수백에 걸쳐 수백만의 SNP 유전자형 수 있습니다. 일단 생성,이 유전자형이 다른 질병 또는 표현형의 다양한 연결을 확인하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
인간 게놈의 유전자형 변형 표현형과 유전 연결을 식별하는 효과적인 방법으로 입증되었습니다. 가족이나 집단 내의 변형의 분포는 질병의 유전 적 요인의 식별을 용이하게 할 수있다. 유전자형 BeadChips의 Illumina의의 패널 조사는 수천 또는 단일 염기 다형성의 수백만 (SNP를을) 유전자형하거나 DNA 샘플의 큰 숫자에서 같은 사본 수와 같은 다른 게놈 변이를 분석 할 수 있습니다. 이 SNP를 게놈으로 확산 될 가능성 발견을 극대화하기 위해 특정 지역에 타겟팅 할 수 있습니다. Infinium 분석 신속 고품질, 정확한 결과를 얻을 수 있도록 최적화되었다. 올바른 설정으로, 하나의 기술자가 배열의 종류에 따라, 주 수천에 DNA 샘플을 몇 백에서 처리 할 수 있습니다. 이 분석은 게놈 DNA로 시작하고 배열의 스캔으로 끝나는, 모든 단계를 통해 사용자를 안내합니다. 타당성 reage 사용국세청은, 샘플을 증폭, 조각, 침전 재현 탁, 스테인드 단일 기본, 연장 칩에 하이브리드 및 이스 칸 또는 하이 스캔 고해상도 광학 이미징 시스템 중 하나에서 검색합니다. 한 하룻밤 단계는 DNA를 증폭하는 데 필요합니다. DNA 변성과 등온 전체 게놈 증폭에 의해 증폭되고, 따라서, PCR이 필요하지 않습니다. 샘플은 두 번째 밤새 단계에서 배열에 하이브리드된다. 셋째 날에 의해, 샘플을 스캔하고 분석 할 준비가 된 것입니다. 증폭 된 DNA는 비드 배열함으로써 처리량을 최대화 모든 요일을 처리 할 수 있도록 다량 비축 될 수있다.
Introduction
단일 염기 다형성 (SNP를)를 입력하면 질환과 관련된 위험 변종을 식별하는 중요한 방법입니다. 역사적으로, 유전자형 실험의 범위는 가능한 기술에 의해 제한되었습니다. 겔 전기 영동 기반 유전자형 방법은 샘플 및 SNP 처리량으로 제한된다 [1]. 이러한 분석을 개발하는 것은 종종 최적화를위한 변형 주변 지역의 구성과 구조에 의존하는 노동 집약적 일 수있다 [1]. 생명 기술에 의해 개발의 TaqMan 유전자형 분석은, 신속하고 최소 기술자 개입 많은 샘플을 실행할 수있다 [2]하지만 SNP 멀티플렉싱 제한 일당 아니라 아래 백만 [3,4에 유전자형의 총 수를 제한하는 것을 계속 ]. 미만 백 SNP를 함께 다중화 될 수 Sequenom의 IPLEX 플랫폼은 또한, 한 번에 많은 샘플을 실행할 수 있지만, 처리량이 전체의 비교적 낮은 [5]. 베크만 쿨터의 SNP 스트림 기술이론적으로는 하루에 3 백만 유전자형을 생성 할 수 있지만, 반응 당 마흔 여덟의 SNP 최대이 기술의 한계 프로젝트 범위 [4,6]. GoldenGate는 분석은 샘플 당 SNP를 수백 또는 수천에 매일 거의 이백 DNA 샘플을 처리 할 수 있지만 한 번 [4,7에서 삼천의 SNP를 입력 할 때, 유전자형 당 가격은 고급, 매우 높은 처리량 기술과 경쟁하지 않습니다 ]. 하루 수백만 유전자형을 처리하기 위해 대규모 게놈 - 와이드 관련 연구에 필요한 치수는 어레이 혼성화 분석법은 시장에서 가장 비용 효율적인 옵션이되었다.
하이브리드 어레이의 어피 메트릭스의 라인과 Infinium 기반 배열의 Illumina의 라인은 샘플의 잠재적으로 수백 개의 병렬 [4,8]에서 SNP를 수천 또는 수백만의 수백에 입력 할 수 있습니다. 이들의 SNP는 전 등 관심 지역에서 지역화, 전체 게놈에 분산 될 수있다OMES, 또는 사용자의 취향에 맞게 사용자 정의. 이러한 배열은 정확하게 한 번에 샘플 당 만의 SNP 유전자형 할뿐만 아니라, 잠재적으로 발표 염색체 이상을 카피 수 변화를 측정 할 수있는 단지의 혜택이있다. Infinium 정렬 OMNI BeadChip 배열은 현재 하루에 약 백 개의 샘플에, 50 만 사용자 지정 궤적 등의 샘플 당 약 오백 만 마커까지 유전자형하는 기능이 있습니다.
대부분의 질환은 유전 적 요소를 가지고, 이러한 대규모 실험 질환과 관련된 유전자를 찾는 데 중요 할 수있다. 높은 처리량의 유전자형이 샘플의 효율적인 유전자형의 생성을 허용하는 것은 설득력 낮은 작은 대립 유전자 주파수에서 유전 연결을 감지하기에 충분히 큰 설정합니다. 전체 게놈 유전자형 프로젝트는 통계적으로 유의 한 환자 - 대조군의 대립 유전자 빈도 나 카피 수의 차이와 지역의 위치를 찾을 수 있습니다 [9,10,11]. 국가 인간 창에 따르면놈 연구소, 게놈 넓은 협회 연구는 P-1보다 작은 값 × 10 -5으로 8,283의 SNP의 발견에 따른 2008 년 11 월 25 일 및 2013년 1월 25일 사이에 1,490 별도의 서적을 주도 (http://를 참조 높이에서 게놈 전체 분석에 의해 제공 폭 넓은 접근 방식의 혜택 고환암에 이르기까지 조건을 연구 www.genome.gov/gwastudies/). 이러한 연구. 입력의 범위가 너무 제한적이었다 이러한 경우, 그 전체 지역 통지를 탈출 할 수 있습니다. 대규모 협회 분석에 따라서,, 게놈 전체의 유전자형 기술 선택의 기술입니다.
Infinium 분석의 다양한 버전은 각각 특정 유형의 어레이로 사용하는 것을 목적으로 존재한다. 또는 24 샘플 어레이 칩 - 아래 깊이에서 논의 InfiniumUltra 분석은, 많은 12에 적합합니다. 이들은 종종 DNA 샘플 당 십만 이상의 SNP를 유전자형과 t에 초점을이러한 엑솜 또는 사용자 정의 패널에 같은 argeted 지역. 다른 분석 버전은 전체 게놈 유전자형 배열과 같은 다른 칩 유형, 필요할 수 있습니다. 모든 Infinium 분석법은 공통 기준을 공유하고 주로 만 시약 이름, 시약 볼륨 또는 실 염색 시약 절차에 의해 다를 그러나 번 분석 버전에 완전히 기술들은 보편적으로 적용될 수있다. 이러한 메틸화 배열과 같은 다른 배열은 물론, 거의 - 동일한 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 케어 칩 유형 사용에 필요한 분석의 버전을 사용하는 경우에만주의해야한다. 이러한 유전자 발현 수준을 측정하는 것과 같은 일부 유형은, nonInfinium 프로토콜의 사용을 요구할 수있다.
샘플은 일괄 적으로 처리해야합니다. 예를 들어, InfiniumUltra 분석법으로, 예비 혼성화 시약 튜브는 96 샘플을 실행하기에 충분한 양을 포함하고, 튜브는 다시 냉동 될 수 없다. 따라서, 샘플은 한 번에 96 샘플의 일괄 처리로 실행해야합니다. 샘플은 전나무에 증폭 될 것이다T 날. benchwork 약 1 시간 후, 샘플 20 ~ 24 시간 동안 대류 오븐에서 가열되어야한다. 다음 날, 거의 4 시간이 침전하고, 샘플을 나중에 사용하기 위해 냉동 또는 칩에 하이브리드 될 수 있습니다 어느 시점에서 샘플을 재현 탁, 단편화를 소비한다. 칩을 넣기 샘플이 16 ~ 24 시간 동안 밤새 하이브리드 될 후, 약 2 시간 소요됩니다. 셋째 날, 염색 및 확장 단계 ~ 4 시간이 걸립니다. 추가 시간은 세척, 코팅, 그리고 칩을 건조 소요됩니다. 마지막으로, 배열은 사용 유형에 따라 15 ~ 60 분 / 칩에서 걸릴 수있는, 스캔됩니다.
표준 실험실의 안전과 청결주의 사항이 적용됩니다. 증폭 PCR 기반은 아니지만, 사전 및 postamplification 절차에 대해 별도의 워크 스테이션은 오염의 가능성을 최소화하기 위해 필요합니다. 사용중인 모든 장비 제공 시약의 식별 번호는 추적 시트에 로그온해야합니다. Reage국세청은 분배하기 전에 여러 번 사용하기 직전에 해동 반전해야한다. 입력되는 DNA는 표준 방법에 의해 단리 및 형광 분석기로 정량 고품질 게놈 DNA (280분의 260 1.6-2.0의 흡광도 비, 3.0 이하의 230분의 260 흡광도 비)이어야한다. DNA의 분해는 종종 낮은 품질의 분석 결과에 기여하는 요인이다. 이 금액은 어떤 칩 종류에 따라 다를 수 있지만 일반적으로 DNA 200 NG가 필요합니다. 테칸 액체 핸들링 로봇은 프로토콜의 여러 단계를 자동화하고 요인으로 인간의 오류를 최소화 할 수있다.
Protocol
일 하나
1. 준비하기
- 깊은 우물, 96 샘플 플레이트에 DNA 200 NG를 분배. 적어도 96 샘플 (전체 판)에는 시약이 낭비되지 않습니다 보장하기 위해 도금해야합니다. 키트에서 제공하는 바코드 스티커와 함께 접시에 레이블을하고 원심 분리.
- , 볼륨을 정상화 서랍에 샘플을 떠나거나 액체를 증발 후드 하룻밤을 연기하기 위해. 먼지를 유지하기 위해 뚜껑이나 종이 타월로 느슨하게 플레이트를 커버.
2. 확대
경고 : 4 시간은 분열, 침전 및 재 부유 단계에 대한 다음 날에 사용할 수 있습니다하지 않는 한 샘플을 증폭을받을 수 없습니다.
- -20 ° C 냉동고 (MA1, MA2, 그리고 MSM의 한 관 96 샘플의 각 세트에 충분하다)에서 "사전"이라는 튜브의 회사가 제공 한 상자 또는 팩을 제거합니다. 해동 벤치에 MA2와 MSM의 튜브를 설정합니다. 제대로 보정을 켜오븐과 37 °로 설정 C.
- 시약 지와 10 μL, 8 채널 피펫을 사용하여 샘플을 재수 각 우물에 DNA 재 부유 버퍼의 4 μl를 분배. 치료는 액체 접촉하지 않도록주의 경우 각 열 사이에 피펫 팁을 폐기 할 필요가 없습니다.
- 8 채널 피펫, 플레이트의 각 웰에 MA1의 20 μl를 분배. 각각의 새로운 시약, 신선한 시약 분지를 사용합니다. 마이크로 통에 1,600 rpm에서 1 분의 재사용 씰, 펄스 원심 분리기와 소용돌이와 플레이트를 커버.
- 2.4) 적어도 30 분 동안 실온에서 배양한다.
- 플레이트의 각 웰에 0.1 N NaOH를 4 μl를 분배. 1,600 rpm에서 1 분의 재사용 씰, 펄스 원심 분리기와 소용돌이와 플레이트를 커버.
- 10 분 동안 실온에서 배양한다.
- 플레이트의 각 웰에 MA2의 34 μl를 분배.
- 플레이트의 각 웰에 MSM의 38 μl를 분배. 접시를 커버재사용 할 수있는 씰, 펄스 원심 분리기, 1,600 rpm에서 1 분간 소용돌이.
- 20 ~ 24 시간 동안 오븐에 넣습니다.
둘째 날
3. 분열
- "포스트-1"에서 FMS 튜브를 분리 -20 ° C 박스 (하나의 튜브는 96 샘플의 각 세트에 충분하다). 벤치 또는 실온 수욕 해동. 탁상 microsample 배양 시스템으로 MIDI 플레이트 인서트를 삽입 한 후, 열 블록을 설정하고, 37 ℃로 설정
- 튜브 해동되면, 오븐 및 펄스 원심 분리기에서 샘플 플레이트를 제거합니다. DNA 플레이트의 각 웰에 FMS의 25 μl를 분배. 1 분 동안 1,600 rpm에서 뚜껑, 펄스 원심 분리기, 그리고 소용돌이를 교체합니다.
- 1 시간 동안 열 블록 플레이트를 품어.
4. 강수량
- 4 ° C의 상자 "포스트-3"에서 PM1 튜브를 제거하거나 포장하고 실내 온도에 따뜻한 (한 관은 96 샘플의 각 세트에 충분하다). 열 블록에서 플레이트를 제거합니다K와 펄스 원심 분리기.
- 플레이트의 각 웰에 PM1의 50 μl를 분배. 1 분 동안 1,600 rpm에서 뚜껑, 펄스 원심 분리기와 소용돌이를 교체합니다.
- 5 분 동안 열 블록 플레이트를 품어.
- 열 블록에서 접시를 꺼내 끄고 접시 뚜껑을 폐기합니다. 플레이트의 각 웰에 100 % 이소프로판올 155 μl를 분배. 새 뚜껑을 단단히 덮고 수동으로 섞어 접시를 여러 번 반전.
- 30 분의 최소 4 ° C에서 접시를 놓습니다. 냉장 원심 분리기를 켜고 냉각 4 ° C로 설정합니다.
- 3,000 X g에서 20 분 동안 4 ° C에서 접시와 원심 분리기의 균형을.
- 를 반전하지 않고 접시의 바닥을 검사하고 샘플을 파란색 펠릿에 침전되어 있는지 확인합니다. 더 펠렛을 다시 원심 분리기를 볼 수없는 경우. 종이 수건을 받으세요.
- 뚜껑을 취소하고 신속하게 반전 판과 종이 타월로 덮여 벤치 탑에 강제로 눌러 액체를 제거합니다. 판 내가되면액체가 남아있는 동안 nverted, 그것은 되돌릴 않도록주의하십시오. 모든 액체가 제거 될 때까지 반복하여 벤치 탑에 판을 누릅니다.
- 건조, 반전 테스트 튜브 랙에 플레이트를 설정합니다. 실온에서 1 시간 동안 배양한다.
5. 재 부상
- "포스트-2"에서 RA1을 제거 -20 C 상자와 실내 온도의 물을 욕조에 녹여 °. 오븐의 전원을 켜고 48 ° C.로 설정
- 일단 해동, 샘플 플레이트의 각 웰에 RA1의 23 μl를 분배. 분지에 RA1의 전체 병을 부어하지 마십시오하기 30 ㎖를 저장합니다. 샘플 나중에 그 날 배열에 교배 할 경우, 4 ° C의 쿨러로 RA1을 배치합니다. 샘플 나중에 실행 할 경우, 병 라벨과 RA1을 재 냉동.
- 접시에 새 뚜껑을 열 밀봉. 접시를 원심 분리기에게 펄스와 1 시간 동안 오븐에 넣습니다.
- 1 분 동안 1,800 rpm에서 오븐 소용돌이에서 플레이트를 제거합니다.
샘플을 안전하게 시간이 될 수 있습니다최대 1 주일이 단계에서 ELD. 플레이트를 비축 할 수 있고, 필요한 경우 샘플은, 비드 칩 응용 프로그램을 준비하기 위해 재구성 될 수있다. 절차를 진행하는 경우, 상온에서 접시를두고 열 블록의 전원을 켭니다. 그렇지 않으면, -20 ° C에서 접시를 저장
6. 이종 교잡
경고 : 샘플 5.5 시간은 염색에 대한 다음 날에 사용할 수 있습니다하지 않는 한 하이브리드를 거쳐 단계를 씻을 수 없습니다.
- 열 블록의 전원을 켜고 95 ° C.로 설정 오븐의 전원을 켜고 48 ° C.로 설정
- 온도가 안정화 된 후에, 20 분 동안 가열 블록에 플레이트를 배양.
- 플레이트가 변성되는 동안 4 ° C에서 비드 칩의 상자를 제거하고 벤치에 설정합니다. (상온 키트) XC4의 병을 가지고 100 % 에탄올 330 ㎖를 추가합니다. 잘 흔들어 실온에서 밤새 품어. 포름 아미드 / EDTA 혼합 (95 % 포름 아미드, 0.2 %를 준비EDTA (0.5 M), 양에 의하여 4.8 % H 2 O)과 별도의 15 ML 단위로 고정. 초과 포름 아미드는 비축 할 수있다.
- 열 블록에서 샘플 플레이트를 제거합니다. 실온에서 30 분 동안 배양한다.
- 플레이트가 냉각되는 동안, HYB 실을 준비하고 있습니다. 한 실 처리 매 4 비드 칩 필요합니다.
베이스의 전면 두꺼운 구멍을 정렬, HYB 챔버베이스의 상단에 고무 매트를 놓습니다. 기본에 새겨 져 바코드 심볼은 여전히 (그림 2 참조) 볼 수 있어야합니다. - 1000 μL 피펫을 사용하여 기본에 새겨진 여덟 가습 저수지에 각각 PB2의 400 μl를 분배. PB2는 "포스트-3"상자 또는 팩에서 찾을 수 있습니다. 기초에 HYB 실 덮개를 놓고 첫 번째 대각선 반대편에 두 개의 걸쇠를 닫아 양쪽 끝을 걸쇠.
- 칩 '엑스포을 최소화하기 위해, 각각의 박스에서 비드 칩의 개별 실버 팩을 제거하지만공기와 빛에 있는지, 아직을 열지 마십시오. 정중 칩의 바코드를 스캔하고 그들이 온되는 박스 ID가 함께 추적 시트에 장착 될 순서를 기록한다. 각각의 DNA 샘플은 비드 칩에 분배 될 위치에 대한 철저한 이해가 필요합니다.
- 각각의 상자에서 비드 칩의 개별 실버 팩을 제거 할 수 있지만, 공기와 빛에 대한 칩 '노출을 최소화하기 위해, 아직을 열지 마십시오. 정중 칩의 바코드를 스캔하고 그들이 온되는 박스 ID가 함께 추적 시트에 장착 될 순서를 기록한다. 각각의 DNA 샘플은 비드 칩에 분배 될 위치에 대한 철저한 이해가 필요합니다.
- 30 분은 냉각 바로 전에 실버 비드 칩 팩을 열고, 완료했다. 그들의 투명한 플라스틱 소매에서 칩을 제거합니다. 구슬을 건드리지 않고, 칩을 배향, HYB 실 삽입의 모든 비드 칩을 배치인서트의 표면에 새겨 져 바코드 기호와 바코드.
- 벗겨 샘플 플레이트의 뚜껑을 폐기합니다. 샘플 판에서 샘플의 15 μl를 타고 천천히 배열의 입구에 분배 (그림 3 참조). 특별한 치료는 이전에 기록 된 비드 칩 순서와 일치, 정확한 위치에 정확한 비드 칩의 올바른 샘플을 배치하는주의해야합니다. 멀티 채널 피펫 칩에 액체를 분배하기 위해 사용될 수 있지만, 사전 고려는 접시에 행의 수는 항상의 수와 일치하지 않기 때문에 안전하게 비드 칩 상에 배치 될 수있는 샘플의 수만큼만, 대기음주의해야 칩의 행.
- 일단 모든 샘플은 해당 배열에 배치되어 시각적으로 액체 코팅되지 기포 나 지역에 대한 칩을 검사합니다. 이러한 문제가 있으면, 부드럽게 삽입 바위. 필요한 경우, 더 많은 액이 어레이에 추가 될 수있다. 올바른 DNA 샘플을 추가 할주의하십시오.
- HYB 실을 엽니 다가습 저수지에 삽입을 배치 할 거라고. 칩의 바코드 HYB 챔버베이스에 새겨 바코드에 배치해야합니다. HYB 실 덮개를 교체하고 첫 번째 대각선 반대편에 걸쇠를 닫아 네 개의 걸쇠를 닫습니다.
- 16 ~ 24 시간 동안 오븐에 HYB 챔버를 품어. 를 이동할 때 실을 기울 않도록주의하십시오.
- 하나 이상의 플레이트가 처리되어야하는 경우, 6.2 단계로 리턴한다. 하루에 24 개 이상의 비드 칩을 처리하는 것은 치료로서, 소모품 또는 칩의 대량을 취급 할 때, 인간의 오류의 가능성을 최소화하기 위해 두 향후 단계에서 칩을 처리하는 데 필요한 시간의 양을 최소화하기 위해 권장되지 않는다해야 극력 공기에 대한 노출을 제한하기 위해 취할 수. XC4 한 병이 최대 24 비드 칩에 충분하다.
셋째 날
7. 염색 준비
- 오븐에서 HYB 챔버를 제거하고 실내 테 부화25 분 동안 mperature. 이상이 HYB 실 처리하면 그들의 이중 제거 매 10 분 엇갈리게. 건조 칩을 유지하기 위해, 아직 HYB 실을 열지 마십시오.
- HYB 챔버 냉각하는 동안, C 상자 -20 ° "포스트-1"에서 XC1, XC2, TEM, STM 및 ATM의 튜브를 제거하고 해동하는 벤치에 설정합니다. -20 ° C에서 "포스트-2"상자에서 RA1의 병을 가지고 상온의 물을 욕조에 녹여 (4 ° C 전날 시약을 재사용하는 경우). 뿐만 아니라, 95 % 포름 아미드의 튜브를 해동. 각 시약의 두 개의 튜브, 10 ㎖의 RA1, 15 ml의 포름 아미드, 및 (상온, 회사가 제공하는 상자에있는) 150 밀리리터 XC3 처리 8 비드 칩이 필요합니다.
- 처리 된 모든 칩의 경우, 하나의 유리 슬라이드, 하나의 플라스틱 흐름을 통해 중괄호, 두 금속 걸쇠, 하나의 플라스틱 스페이서가 필요합니다. 플라스틱 스페이서의 경우 만 분명 하나를 사용하며, 불투명 한 스페이서를 분리하고 폐기. 또한, 두 개의 구슬 칩 세척 요리비드 칩 트레이는 하나의 액체 조립 스테이션과 하나의 플라스틱 조립 줄과 함께 필요합니다.
- 에탄올을 분사하고 건조 닦아 유리 슬라이드를 청소합니다.
- 흐름을 통해 실 랙에 부착있어 뜨거운 물 목욕을 켜고 44 ° C.로 설정 부드럽게 모든 거품을 제거하기 위해 챔버 랙을 흔들어.
- HYB 챔버는 25 분 동안 냉각되면, PB1 (약 200 mL)로 세척 접시를 채우십시오. PB1은 "포스트 -4"실온 상자에서 찾을 수있다.
- 하나 HYB 챔버를 엽니 다. (그림 4 참조) 한 구석에 실을 잡고 부드럽게 대각선으로 박리하여 비드 칩에서 커버 씰을 제거합니다. 봉인이 제거되면 즉시 비드 칩 트레이에 칩을 배치하고 구슬을 건드리지 않고 PB1에 잠수함. 용지함이 모든 칩 건조시켜 않도록주의하면서, 구슬 칩 채워질 때까지 반복합니다.
- 조심스럽게 기포를 제거하고 1 분 동안 물속에 잠긴 칩을 떠나 트레이를 선동.PB1과 두 번째 세척 요리를 기입하십시오. 다시 트레이를 선동.
- 두 번째 세척 접시에 구슬 칩 트레이를 이동합니다. 조심스럽게 다시 선동, 선동하고 1 분 동안 담가 보자.
- 액체 흐름을 통해 조립 역에서 홈에 4 개의 검은 플라스틱 흐름을 통해 괄호를 배치합니다. 액체가 거의 팔 어셈블리 브래킷 (약 150 ㎖)의 높이에 도달 할 때까지 PB1과 역 채우기.
- 트레이에서 비드 칩을 제거하고 플라스틱 흐름을 통해 중괄호에 어셈블리 스테이션에 배치합니다. 칩 바코드 어셈블리 역에 새겨 져 바코드 심볼 위에 정렬되어야합니다. 조립 스테이션에 맞게 할 수있는 다른 세 개의 칩에 대해 반복합니다.
- 비드 칩 위에 투명한 플라스틱 스페이서를 놓습니다. 스페이서의 외부 가장자리는 조립 스테이션 내에 브래킷을 둘러싸한다. PB1에 잠긴 다른 칩에 대해 반복합니다.
- 홈에 그것을 피팅에 의해 어셈블리 역에서 플라스틱 조립 줄을 놓습니다. 부드럽게 조립 바 대하여 슬라이드의 후단을 밀어 천천히 액체로 전면을 낮추어 플라스틱 스페이서 위에 슬라이드 유리를 배치. 슬라이드 위에 홈은 비드 칩과 바코드 끝에 슬라이드 사이의 간극을두고 직접 칩의 바코드보다 아래쪽에 직면한다. PB1에 잠긴 다른 칩에 대해 반복합니다. 전체 흐름을 통해 어셈블리 다이어그램의 경우, 그림 5 참조.
- 칩과 슬라이드 사이의 거품을 확인합니다. 거품이 나타날 경우, 부드럽게 바코드 끝에 슬라이드를 제기하고 다시 시도하십시오. 영구 거품 종이 실험실 수건 (킴 와이프)와 유리에서 닦아 낼 수 있습니다.
- 유리 슬라이드 주위에 두 개의 금속 걸쇠, 바코드 끝으로 하나 뒤쪽으로 하나의 스냅. 걸쇠의 가장자리해야 그립 칩에서 플라스틱 흐름을 통해 중괄호. PB1에 잠긴 모든 칩에 대해 반복합니다.
- 완성 된 흐름을 통해 어셈블리를 제거하고 B에 수평으로 배치ench. 유리 슬라이드에서 액체가 탈출 할 수 있도록 수직으로 조립 팁을하지 않도록주의하십시오. 더 많은 칩을 세척 트레이에서 대기하는 경우, 그들은 동일한 PB1하에 조립 될 수있다. 다른 칩은 원래 HYB 실에서 대기하는 경우, 조립 스테이션에있는 모든 액체를 버리고 설거지를하고, 7.6 단계로 돌아갑니다.
- 일단 모든 비드 칩은 가능한 한 유리 슬라이드 근처에 수술 가위를 타고 오프 스페이서의 양쪽 끝을 잘라 자신의 흐름을 통해 어셈블리에 있습니다.
8. 염색 및 확장
- 흐름을 통해 챔버 랙 온도 프로브를 여러 위치에서 44 °의 C에 도달했음을 확인합니다. 온도가 절반 이상 정도에 의해 OFF되면, 수조의 온도를 조정한다.
- 아래 어셈블리를 슬라이딩 상단에있는 괄호를 후킹하여 실 선반에 구슬 칩의 흐름을 통해 어셈블리를 놓습니다. 비드 칩의 뒷면 챔버 랙을 터치해야합니다. g아가씨 슬라이드 시약 저수지를 형성하기 위해 상단의 홈과, 바깥 쪽을 향하도록해야한다. 모든 비드 칩 어셈블리에 대해 반복합니다.
- 200 μL 피펫을 사용하여 유리 탱크에 액체를 분배하여 흐름을 통해 어셈블리 RA1to 150 μl를 추가합니다. 30 초 동안 품어. 배를 반복합니다.
- 1000 μL 피펫을 사용하여 유리 탱크에 액체를 분배하여 흐름을 통해 어셈블리 XC1to 450 μl를 추가합니다. 10 분 동안 품어.
- 유리 탱크에 액체를 분배하여 흐름을 통해 어셈블리에 450 μL의 XC2를 추가합니다. 10 분 동안 품어.
- 유리 탱크에 액체를 분배하여 흐름을 통해 어셈블리에 200 μL의 TEM을 추가합니다. 15 분 동안 품어.
- 유리 탱크에 액체를 분배하여 흐름을 통해 어셈블리에 450 μL에게 95 % 포름 아미드 / EDTA 믹스를 추가합니다. 1 분 동안 품어. 1X를 반복합니다.
- 5 분의 흐름을 통해 어셈블리를 품어.
- 온도 (L)에 온수욕 설정isted은 STM의 튜브에 (37 ° C 하나도 표시되지 않은 경우). 각 STM 관이 나와 같은 온도를 가지고 있는지 확인하십시오.
- 흐름을 통해 어셈블리에 450 μL의 XC3를 추가합니다. 1 분 동안 품어. 1X를 반복합니다.
- 온수 욕 온도가 희망 온도에 도달하면, 유리 저장조로 액체를 분배하여 관류 어셈블리 250 μLSTM을 추가한다. 10 분 동안 품어.
- 유리 탱크에 액체를 분배하여 흐름을 통해 어셈블리에 450 μL의 XC3를 추가합니다. 1 분 동안 품어. 1X를 반복합니다.
- 5 분의 흐름을 통해 어셈블리를 품어.
- 유리 탱크에 액체를 분배하여 흐름을 통해 어셈블리에 250 μL의 ATM을 추가합니다. 10 분 동안 품어.
- 유리 탱크에 액체를 분배하여 흐름을 통해 어셈블리에 450 μL의 XC3를 추가합니다. 1 분 동안 품어. 1X를 반복합니다.
- 5 분의 흐름을 통해 어셈블리를 품어.
- 흐름을 통해 250 μL의 STM 추가유리 저장조로 액체를 분사에 의해 어셈블리. 10 분 동안 품어.
- 유리 탱크에 액체를 분배하여 흐름을 통해 어셈블리에 ADD4 50 μL의 XC3. 1 분 동안 품어. 1X를 반복합니다.
- 5 분의 흐름을 통해 어셈블리를 품어.
- 반복 8.14-8.19 1X 단계를 반복합니다.
- 챔버 랙에서 흐름을 통해 어셈블리를 제거하고 물 목욕을 끄십시오.
9. 세척 및 씰링
- PB1 (약 315 mL)로 염색 비드 칩 세척 접시를 채우십시오. 두 개의 수직 세척 요리와 하나의 수직 비드 칩 트레이는 적어도 하나의 진공 매니 폴드와 함께 필요합니다.
- 걸쇠와 괄호 사이에 얇은 금속 막대를 삽입 후 회전시켜 흐름을 통해 어셈블리를 분해합니다. 옆 유리 슬라이드를 설정하고 비드 칩을 제거합니다. 즉시 수직 비드 칩 트레이에 비드 칩을 배치하고 PB1에 잠수함. EAC 얼굴을 돌보는 모든 흐름을 통해 어셈블리에 대한 반복H 구슬 같은 방향으로 칩과 공기에 대한 노출을 최소화.
- 부드럽게 거품을 제거하기 위해 비드 칩 트레이를 선동. 5 분 PB1에 잠긴 비드 칩을 품어. XC4와 제 2 수직 세척 접시를 채우 전날 준비했습니다. 다시 비드 칩 트레이를 선동.
- XC4 가득 세척 접시에 비드 칩 트레이를 이동합니다. 부드럽게 거품을 제거하기 위해 트레이를 선동. 5 분 동안 품어 다시 선동.
- 그 때문에 모든 비드 칩의 얼굴에 구슬이 위쪽으로, 한 번의 부드러운 동작, 세척 접시에서 비드 칩 트레이를 당겨 테스트 튜브 랙에 설정합니다. 자가 잠금 핀셋, 트레이에서 비드 칩을 밀어 테스트 튜브 랙에 배치합니다. 모든 구슬 칩에 대해 반복합니다.
- 조심스럽게 진공 데시 케이 터에 칩의 테스트 튜브 랙을 전송. 닫고 적절한 밀봉을 보장 진공의 전원을 켭니다. 50 ~ 55 분 동안 품어. 필요한 경우, 배양 중에 스캐너 워밍업.
10. 스캐닝
- 화진공 떨어져 RN 천천히 대기에 압력을 반환합니다. 비드 칩이 건조 있는지 확인합니다. 필요한 경우, 액체 또는 이물질을 제거하기 위해 모서리와 종이 타월로 칩의 바닥을 닦습니다.
- 스캔 소프트웨어를 활성화하고 스캔 트레이에 비드 칩을 이동합니다. 디코드 화일 클라이언트 소프트웨어를 활성화하고 해당 박스 ID를 함께 원하는 비드 칩 바코드를 입력해서 칩의 디코드 파일 (dmaps)를 다운로드. 스캔되지 않은 비드 칩 안전하게 최대 72 시간 동안 건조하고, 어두운 영역에 저장 될 수있다.
- 칩이 제대로 트레이에 장착되고 디코딩 파일이 소프트웨어에 의해 인식되면, 스캔을 시작합니다.
Representative Results
스캔하는 동안 제대로 처리 비드 칩은 밝고 뚜렷한 빨강과 녹색 레이저 광 강도를 표시해야합니다. 그림 6에서, 이스 칸 스캔 소프트웨어가 성공적으로 사용자 정의 패널 SNP 유전자형 배열에 하이브리드 표준 게놈 DNA 샘플을 표시합니다. 확장 및 염색 단계에서 부착 한 표지 뉴클레오티드는 두 레이저의 조명에서 형광. 이러한 뉴클레오티드는 선택적으로 단편화 DNA 가닥으로 혼성화 비드의 올리고 뉴클레오티드 사슬 연장, 및 올리고 뉴클레오티드 사슬이 변이체의 사이트에서 종료하도록 설계된대로, 얻어진 신호의 색상과 강도가 존재 대립 유전자를 결정하기 위하여 사용될 수있는 바와 같이 SNP 사이트.
회사로부터 직접 받아 chipID와 위치에 샘플 ID와 임상 정보와 일치하는 사용자가 생성 한 샘플 시트 및 배열 특정 SNP 매니페스트는 SCA를 가져 오려면 모두 필요하다nner 출력 파일 GenomeStudio 분석 소프트웨어로. 예를 들어 샘플 시트는 회사의 웹 사이트에서 찾을 수 있습니다. GenomeStudio 프로젝트가 건설되면, 유전자형은 소프트웨어에 의해 자동으로 생성 된 결과 강도 클러스터에서 얻을 수 있습니다. 다중 디스플레이 옵션이 존재하지만, 기본보기, 규범 시타 (대립 유전자 강도 비) 대 규격-R (정규화 된 강도 값), 종종 세 가지 클러스터를 구별하는 가장 쉬운 플롯이다. 대부분의 SNP는 마이너 대립 유전자 빈도에 따라 하나, 둘 또는 세 개의 클러스터를 표시한다.
세 개의 클러스터는 AA, AB, BB 또는 대립 유전자 (그림 7 참조)를 보여주는 샘플을 나타냅니다. 이 클러스터는 소프트웨어의 분석 도구 모음에서 "모두의 SNP를 클러스터"를 선택하여, 회사에서 직접 표준 클러스터링 위치 템플릿을 가져 와서, 또는 클릭하고 수동으로 EDI 강도 플롯의 색깔의 원형을 드래그하여 하나 유전자형을 할당 할 수 있습니다 t를 호출합니다. (빨간색, 보라색, 파란색) 강도 음모에 샘플의 색은 전화 (AA, AB, 또는 BB, 각각)을 나타내고, 검은 색은 전화를 나타냅니다. 소프트웨어의 전체 데이터 창에 표시 SNP를 스크롤함으로써, 각 SNP에 대한 클러스터링을 보거나 호출 할 수 있습니다. 클러스터가 만족 통화를 할당되면, 소프트웨어의 전체 데이터 창은 각각의 특정 SNP에 각각의 샘플에 대한 유전자형을 나열합니다. 테이블 위의 열 선택기 옵션은 데이터 형식을 전환 할 수 있습니다.
데이터에 대한 심층 분석을위한 분석 도구 모음을 통해 또는 직접 전체 데이터 테이블에서 하나를 내보낼 수 있습니다.
그림 1. 개요 - Infinium 분석 프로토콜.683/50683fig1highres.jpg "대상 ="_blank "> 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 전체 그리고, Hyb 상공 회의소베이스와 매트 플러스 뚜껑. [12] 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3 Beadchip로드 -.. 입구 포트에서 샘플을 분배 [12] 더 보려면 여기를 클릭하십시오 이미지.
그림 4 Beadchip Coverseal을 제거 -.. 코너에 실을 잡고 부드럽게 대각선 껍질 [12] 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 5. 전체 Beadchip 흐름을 통해 조립 - BeadChip는 스페이서 유리 슬라이드에서 분리 걸쇠에 바인딩됩니다.> 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6. 성공적인 BeadChip 스캔 - A) BeadChip는 모두 빨간색과 녹색의 레이저로 스캔, 스캔 소프트웨어 모두 표시 동시에. 강도 QC를 통과하는 부분은 왼쪽으로 BeadChip 디스플레이에 녹색을 강조 할 것입니다. 강도 QC 실패한 섹션 BeadChip 디스플레이에 적색 강조한다. B)를 스캔이 완료되면, 소프트웨어는 적색 및 녹색 디스플레이를 오버레이한다. 확대 된 이미지가 표시됩니다. 각 구슬의 색과 강도는 대립 유전자의 존재를 나타냅니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 7. NORM-THETA 클러스터 프로필 대 SNP NORM-R -. AA, AB, BB와 유전자형, 빨간색, 보라색, 파란색 B 색) SNP 요구하는 편집 기능을 나타내는 세 가지 클러스터와) 유효 SNP. 동형 접합 AB해야 중간 클러스터, 취소라고 남아 있습니다. BB 클러스터가 잘못 AB. C)별로 실적 SNP라고한다. 뚜렷한 클러스터가 존재하지 않기 때문에 어떤 유전자형이 강도 음모에서 얻을 수 없습니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
Discussion
대형 유전자형 어플리케이션은 더 많은 인간 질병의 기초 유전 메커니즘을 이해하기 위해 사용되어왔다. 게놈 넓은 협회 분석을 통해 의미있는 변형의 발견은 추가 연구를 위해 후보 지역에 플래그를 할 수 있습니다. 또, 유전자형 데이터 시퀀싱 프로젝트의 품질 관리를위한 좋은 도구이다.
시료 처리량을 극대화하기 위해, 여러 개의 샘플 플레이트 증폭 단편적인, 재 부유 상태로 저장 될 수있다. 여덟 판은 여러 일괄 처리를위한 프로토콜의 첫 번째 24 시간을 결합하고 칩의 처리 ~ 2-8일에 대한 충분한 자료를 제공하고, 하루에 증폭 될 수있다. 증폭 된 플레이트를 미리 비축하고, 새로운 샘플을 스캐닝이 이전 실행에서 시작 직후 칩에 혼성화되는 경우, 처리는 추가적인 샘플 준비 동안 정지 할 필요없이 연속적으로 실행할 수있는 경우. 따라서, 비록 샘플 전체를 받아야하는 3 일 정도 걸릴 것입니다분석 데이터는 매일 발생 될 수있다. Assuming24 칩이 매일 처리되고, 5 일 근무제는 12 샘플 비드 칩에서 실행되는 1,000 이상 DNA 샘플 수 있습니다. 모든 단계 또는 시약이 실패하면 어떤 보정을 적용 할 수 있습니다 전에 그러나, 여러 일괄 처리 성능 저하에 대한 위험이있을 수 있습니다. 배열 스캔하거나 분석 할 때까지 오류 통지를 벗어날 수도, 처리량이 최대화되어있는 경우 따라서, 프로토콜의 다양한 단계에있는 수백 개의 샘플이 이미 발견시 같은 결함이 치료를 받고 있습니다. 분실 된 시약 및 데이터가 복구 될 수 없으므로, 사용자는 가속 플로에 대한 필요성에 대해 이러한 위험을 계량한다.
GenomeStudio 분석 소프트웨어 진정 유전자형 프로세스의 성공을 측정하는 제 기회이다. 규범 세타 강도 플롯 대 규격-R이 제대로 클러스터 된 경우이 값이 SLI 다르지만, 샘플의 평균 통화 비율 (전체의 SNP %가 성공적으로 입력), 99 %를 접근해야ghtly 배열 유형에 따라 다릅니다. 85-90%보다 낮은 전화 요금과 함께 모든 샘플의 데이터는 신뢰할 수없는 폐기해야합니다. 품질 관리 목적으로, 결과는 가능한 이전에 공지 된 유전자형마다에 비교되어야한다. 이러한 데이터가 존재하지 않는 경우는, 의도적 샘플 중복 판 또는 배열 게재 위치를 확인하는 유용한 도구입니다. 이러한 중복 쌍은 별도의 칩, 접시, 배치, 또는 프로젝트에 배치해야합니다, 그들의 유전자형 세대에 확인. 특정 QC 제약 연구자의 취향에 따라 다양하지만, 일반적인 SNP 제약은 샘플 호출 성공, 하디 - 와인버그 평형, 또는 케이스 및 컨트롤 사이 missingness을 기반으로하는 일반적인 샘플 제약은 전화 요금, 멘델의 불일치, 또는 상호 참조를 기반으로하면서 임상 성 데이터에 대한 X-염색체의 이형 접합의 [13].
어떤 문제가 발생하면, 분석 제품군에있는 컨트롤 대시 보드는에 제출 될 수있다원인을 확인하기 위해 회사. 이러한 컨트롤은 종종 확률이 높은 단계 또는 시약 실패 문제를 좁힐 수 있습니다. 그 중 하나의 SNP가 Infinium의 유전자형 실험을 통해 발견하는 경우, 자신의 강도 플롯 재확인 추가 연구가 수행되기 전에 클러스터링 오류 GenomeStudio에 있어야합니다.
실패 Infinium의 유전자형 실험으로 인해 인간의 처리 오류 또는 품질이 낮은 입력 DNA 가능성이있다. 샘플 정량화 정확하고 정확해야합니다. 최상의 결과를 위해, 모든 시약은 시료에 추가 또는 칩은 프로토콜에 의해 볼륨 세트에 분배해야합니다. 피펫은 올바르게 조정해야합니다. 시약 만료 후 실행할 수 없습니다 한 번 해동 다시 냉동하지 말아야 RA1 시약 저장. 가능한 염색 및 확장 오류를 최소화하기 위하여, 포름 아미드 / EDTA 혼합물을 매월 신선한 준비되어야한다. 모두 -20 ° C 시약은 수동 제상 냉동고에 보관해야합니다. 명세서에 사용 된 모든 실험기구aining, 프로토콜의 확장 및 세척 부분은 즉시 폐기에 물과 중성 세제로 깨끗이 세척해야한다. HYB 실 가습 저수지 테스트 튜브 브러시와 중성 세제로 세정해야한다. 일주일에 한 번, 자신의 사용 설명서의 지시에 따라 유리 슬라이드는 10 % 표백제로 세척해야한다.
Disclosures
이 문서의 저자가 공개하는 경쟁 금전적 이해 관계가 없습니다.
Acknowledgments
이 작품에 대한 자금 지원은 NIH P20 GM103456, NIH RC2 AR058959, 그리고 NIH R56 AI063274에 의해 제공되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumable or Equipment | Manufacturer | Part Number | Minimum Required for 96 Samples |
| 0.8 ml Deep Well Plate | Thermo Scientific | AB-0765 | 1 |
| Plate Mats | Thermo Scientific | AB-0674 | 2 |
| Reagent Basin | Fisher Scientific | 13-681-502 | 9 |
| Heat-seal Sheets | Thermo Scientific | AB-0559 | 1 |
| Flow-through Spacer | Fisher Scientific | NC9563984 | 6 |
| Pipette tips - 200 μl | Rainin | GP-L200F | 192 |
| Pipette tips - 10 μl | Rainin | GP-L10F | 16 |
| Pipette tips - 1,000 μl | Rainin | GP-L1000F | 16 |
| DNA Suspension Buffer | Teknova | T0220 | 0.5 ml |
| 0.1 N NaOH | Fisher Scientific | AC12419-0010 | 0.5 ml |
| Isopropanol (HPLC grade) | Fisher Scientific | A451 | 15 ml |
| Ethanol (200-proof) | Sigma-Aldrich | 459836 | 330 ml |
| Formamide (100%) | Thomas Scientific | C001K38 | 15 ml |
| EDTA (0.5 M) | Amresco | E177 | 0.2 ml |
| 10 μl 8-channel Pipette | Rainin | L8-10XLS | 1 |
| 200 μl 8-channel Pipette | Rainin | L8-200XLS | 2 |
| 1,000 μl Single-channel Pipette | Rainin | L-1000XLS | 1 |
| Microplate Shaker | VWR | 13500-890 | 1 |
| Refrigerated Microplate Centrifuge | VWR | BK369434 | 1 |
| Hybridization Oven | Illumina | SE-901-1001 | 1 |
| Hybex Microsample Incubator | SciGene | 1057-30-0 | 1 |
| Hybex MIDI Heat Block Insert | Illumina | BD-60-601 | 1 |
| Heat Sealer | Thermo Scientific | AB-0384 | 1 |
| Hyb Chamber w/ Insert and Mat | Illumina | BD-60-402 | 2 |
| Surgical Scissors | Fisher Scientific | 13-804-20 | 1 |
| Flow Through Assembly Parts | Illumina | WG-10-202 | 8 |
| Wash Rack and Dish | Illumina | BD-60-450 | 1 |
| Genepaint Chamber Rack | Tecan | 760-800 | 1 |
| Temperature Probe | Illumina | A1-99-109 | 1 |
| Staining Rack and Dish | Illumina | WG-10-207 | 1 |
| Self-Closing Tweezers | Ted Pella, Inc | 5374-NM | 1 |
| Vacuum Manifold | Ted Pella, Inc | 2240 | 1 |
| iScan or HiScan | Illumina | - | 1 |
References
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