Ein Protokoll für die Phagen-Display-und Affinity Auswahl mit rekombinantem Protein-Köder

Summary

Phagen-Display ist eine leistungsfähige Technik, Proteine ​​oder Proteineinheiten, die mit einem immobilisierten Molekül von Interesse in Wechselwirkung zu erfassen. Sobald eine Entscheidung über die Art der Phagen-cDNA-Bibliothek zu erstellen und zu Bildschirm gemacht worden ist, das hier beschriebene Protokoll ermöglicht eine effiziente Affinitätsselektion, die zu Identifizierung der Interaktionspartner.

Abstract

Verwendung von rekombinanten Phagen als Gerüst, um verschiedene Proteinabschnitte durch eine richtungs klonierten cDNA-Bibliothek zu immobilisierenden Molekülen codiert Köder präsentieren, ist ein effizientes Mittel, um Wechselwirkungen zu entdecken. Die Technik wurde weitgehend verwendet, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu entdecken, sondern der Köder-Molekül in Frage gestellt werden muss nicht auf Proteine ​​beschränkt. Die hier vorgestellten Protokoll optimiert worden, damit eine bescheidene Anzahl von Ködern in Replikaten gescreent werden, um die Identifizierung der unabhängigen Klonen da er das gleiche Protein zu maximieren. Dies ermöglicht eine größere Zuversicht, dass interagierende Proteine ​​identifiziert sind legitime Interaktoren des Köders Molekül. Die Überwachung der Phagen-Titer nach jeder Affinität Auswahlrunde bietet Informationen darüber, wie die Affinitätsselektion voran sowie auf die Wirksamkeit der negativen Kontrollen. Ein Mittel zum Titrieren der Phagen und wie und was zu im Voraus vorzubereiten, damit dieser Prozess so effizient wie Fortschrittemöglich ist, wird dargestellt. Attribute abgerufen Amplikons nach der Isolierung von unabhängigen Plaque werden hervorgehoben, die verwendet werden können, um festzustellen, wie gut die Affinitätsselektion fortgeschritten ist. Fehlerlokalisierungstechniken, Fehlalarme zu minimieren oder zu umgehen anhaltend erholt Phagen werden erläutert. Mittel zur Reduzierung der viralen Kontamination aufflammen werden diskutiert.

Introduction

Warum Phagen-Display-und Affinitätsselektion statt der unzähligen anderen für die Entdeckung und Untersuchung von Protein-Interaktionen mit anderen Molekülen verfügbaren Techniken? Phagen-Display kann einige einzigartige Vorteile gegenüber anderen Verfahren zum Nachweis von Protein-Ligand-Wechselwirkungen ^1-3 einschließlich der folgenden aufweist:

Sehr breite Repertoire der Köder Moleküle

Der wichtigste Grund ist in der Vielfalt der Moleküle wirken kann als Köder in Affinitätsselektion ^4. Phagendisplay ist ein sehr wirksames Mittel zur Isolierung von Protein-Fragmenten, die mit anderen Proteinen, Nukleotiden, Kohlenhydrate, etc. ^5. Wesentlichen interagieren, wenn ein Polymer / Molekül kann an einen Träger gebunden erzielbaren werden kann, kann zur Affinitäts mit Phagen-Proteine ​​gescreent werden. Zusätzlich kann das Köder-Molekül zugegriffen, um festzustellen, ob es die biologische Aktivität beibehält, wenn sie immobilisiert ⁶ werden, wenn die Bedingungen verwendet werden, um reduce / eliminieren seine Tätigkeit wirksam sind ⁶ oder, post-translationale Modifikationen auf den Köder vor der Affinitätsselektion einzuführen.

Phage Widerstand gegen äußere Faktoren

Ein zweiter Grund für die Verwendung von Phagen-Display, ist, dass es möglich ist, dass einige Köder erfordern Umweltstress (Hitze, hohe Konzentrationen Osmolyten, spezifischen Kofaktoren, usw..), Um ihre wechselwirkende Proteine ​​zu erfassen, oder die Phagen-Proteine ​​müssen irgendwie verändert werden vor der Affinitätsselektion. Der primäre Faktor untersucht, ist die Wechselwirkung zwischen Köder und Protein, nicht die Bedingung, dass die Wechselwirkung auftreten können oder wenn es tödlich für den Testorganismus. Die T7-Phagen ist besonders gut geeignet für solche Studien, da es hart experimentellen Bedingungen sowohl intakt und lebensfähig zu widerstehen (z. B. die veröffentlichte thermische Maximum für T7 Lebensfähigkeit ~ 60 ° C ^7). Als ein Beispiel des Änderns Phagen proProteine, bei der Prüfung der Arabidopsis thaliana Samen für Proteom-Proteinsubstraten der Reparatur-Enzym, Protein Isoaspartyl Methyl Transferase (PIMT), das Virus in diesen Studien verwendet hatte "gealtert" war für eine Woche vor jeder Affinität Auswahlrunde, um die Einführung zu fördern von isoaspartate (isoAsp) Reste bei empfindlichen Proteine ^​​6, die in Organismen, die erkennen und reparieren / verstoffwechseln solche Anomalien nicht möglich ist.

Metabolisch inert

Weiterhin werden die Phagen in der Regel resistent gegen Stoffwechselgiften und störende kleine Moleküle, die, zumindest, führen würde pleiotrope Wirkungen auf metabolisch aktive Testorganismen. Nach den Waschungen Stringenz wird das Gift, bevor eine große Menge von Bakterien zur Infektion eingeführt, das Gift ist auf einen Bereich um die Bakterien harmlos oder nachfolgenden Phagenreplikations verdünnt entfernt. Bei der Untersuchung der Protein-Targets PIMT ReparaturEnzym, S-Adenosylmethionin (AdoMet) wurde verwendet, um die Mikro-Titer-Platten-und immobilisierte Enzym zu aktivieren, um Zielprotein Abfangen zu ermöglichen, während sich auf S-Adenosyl Homocystein (AdoHcy) zur Inaktivierung des Enzyms und bieten eine nützliche Negativkontrolle sichern in das Wissen, dass das Virus nicht durch beider AdoMet oder AdoHcy ⁶ beeinflusst werden. Zusätzlich Mitglieder bestimmter spätEmbryoGenese Reichlich (LEA) Proteinfamilien, in diesem Labor untersucht, sind dafür bekannt, ihre Form in Gegenwart von Zusätzen wie Sucrose ^8, die hohen Konzentrationen von 200 mM in Sojabohnensamen an dem Punkt erreichen kann, zu verändern physiologischer Reife ^9. Das Virus wird nicht angenommen, dass durch Zugabe von 200 mM Saccharose in jeder Runde der Affinitätsselektion, möglicherweise für bestimmte LEA-Client-Protein-Wechselwirkungen erforderlich, was nicht der Fall autonom lebensfähigen Testorganismen ¹⁰ beeinflusst werden.

Dieses Labor hat sich auf ENTDECKEN konzentriertG-Protein-Protein-Wechselwirkungen in reifen, dehydriert oder keimenden Samen, die den Mechanismus der gespeicherten Proteom Schutz während der Dehydratisierung ¹¹ oder Reparatur von Komponenten des gespeicherten Proteom, die anfällig für isoAsp Bildung sind, wenn das Saatgut aufgesaugt ⁶ zugrunde liegen. Somit ist die Produktion und Aufreinigung der rekombinanten Proteine ​​als Köder in einem aktiven Zustand erforderlich ist, und sicherzustellen, dass sie so bleiben, bevor und nachdem sie immobilisiert werden, obwohl häufig schwierig ist, ist ein Grundpfeiler unserer Arbeit. Doch wie jedes rekombinante Proteinproduktion Szenario ist anders, die Optimierung der Bedingungen für die Produktion rekombinanter Proteine ​​wird hier nicht angesprochen werden. Die Benutzer werden aufgefordert, zu versuchen, wo immer möglich, zu bestimmen, ob das immobilisierte Protein noch funktionsfähig ist (z. B. wenn es ein Enzym, tun ein Enzym-Assay in den Vertiefungen von Mikrotiterplatten). Dies wird etwas Vertrauen, dass der Köder ist biologisch aktiv und daher, dass alle entdeckten Wechselwirkungenetwas häufiger auf biologische Relevanz haben.

Protocol

Eine grafische Darstellung der unter (1) beschriebene Verfahren beschreibt die zwei Hauptkomponenten für die Affinitätsselektion unter Verwendung einer Phagen-Display-Bibliothek: A) eine Phagen-Display-Bibliothek cDNA wahrscheinlich Proteine ​​mit Affinität für den Köder zu kodieren und, b) eine gereinigte rekombinante Köder Protein. Herstellung von Köder (rekombinantes Protein) wurde ausgiebig untersucht und Literatur skizziert Best Practices für die Sicherung von löslichen, aktiven, rekombinanten Protein aus E. coli ^12-13, eukaryotische Hefe ^14, Insekten ^15-16, Pflanzen ^{17-18, 19-20} oder Säugetierzellen gibt es zuhauf.

In dem folgenden Protokoll, markiert ein hexahistidyl rekombinante Protein hat als Köder verwendet. Dies ermöglicht, dass die Überprüfung Köder-Proteine ​​bleiben in den Brunnen nach Inkubation über Nacht-und Waschschritte.

1. ELISA für rekombinante Proteinbindung in der Mikrotiterplatte Wells

1. Mark einMikrotiterplatte mit dauerhafter Tinte und bezeichnen die Brunnen werden, welche Proteinkonzentrationen enthalten. Führen Sie diese in 3 Wiederholungen von Brunnen. Fügen Sie 3 Wiederholungen einer Negativkontrolle Konzentrationsreihe (nicht hexahistidyl-markierten Protein; BSA funktioniert gut als diesem Hintergrund Prüfung).
2. Ausgiebig Waschen Sie die Platte mit Wasser und Wasser zu entfernen durch Schmatzen die Platte umgedreht auf 4 Lagen Küchenpapier zwischen den Waschgängen.
3. Immobilisieren, in den ersten 3 Vertiefungen in 100 &mgr; l Tris, pH 7,5, (oder Puffer nach Wahl) die höchste Konzentration des rekombinanten Proteins (10 ug / ml). In den nächsten drei Vertiefungen, die das rekombinante Protein bei (1,0 ug / ml), etc., auf 1,0 ng / ml. Machen Sie dasselbe mit der BSA-Konzentration Serie.
4. Decken Sie Speisen mit Plastikfolie und lassen Sie über Nacht bei 4 ° C
5. Am nächsten Morgen, entfernen Proteins durch schmatzende Platte auf den Kopf auf 4-5 Schichten Papiertuch.
6. Brunnen waschen 5x mit 200 ul 1x TBS jeder Zeit, so dass die Pufferin den Vertiefungen ~ 1 min bei jeder und Entfernen der Waschpuffer durch Schmatzen die Platte nach oben auf der Papierhandtücher nach jedem Waschen.
7. Sperrung der ELISA-Platte auf einem Drehschüttler mit 200 ul 5% (w / v) BSA und 200 &mgr; l 5% (G / V) Blockierungsreagenz in TBS bei Raumtemperatur für 2 h (oder sitzt stationär über Nacht bei 4 ° C bei praktisch ) in Plastikfolie eingewickelt.
8. Entfernen Sie überschüssiges Blockierungslösung durch Schmatzen die Platte umgedreht auf die Papierhandtücher. Waschen Sie 4x 1 min mit je 200 ul 1x TBS, das Entfernen der Waschlösung durch Schmatzen die Platte auf den Kopf.
9. Verdünnen Penta-HIS primären Antikörper 1/2, 000 in Blockierungspuffer und liefern 100 ul in jede Vertiefung. Inkubieren 1-2 h bei Raumtemperatur mit der stationären Platte.
10. Entfernen Sie den primären Antikörper durch Schmatzen die Platte umgedreht auf den Papierhandtücher. Mit 200 &mgr; l 1 × TBST waschen 4x 1 min jedesmal. Entfernen Sie jede Wasch durch Schmatzen die Platte auf den Kopf.
11. Verdünnen Sie die sekundären Antikörper(Ziegen-Anti-Maus-alkalische Phosphatase-Konjugat) in Blockierungspuffer inkubiert und 100 ul in jede Vertiefung für 1 h bei Raumtemperatur mit der stationären Platte.
12. Entfernen Sie die sekundäre Antikörper durch Schmatzen die Platte umgedreht auf den Papierhandtücher. Mit 200 &mgr; l 1 × TBST waschen 4x 1 min jedesmal. Entfernen Sie jede Wasch durch Schmatzen die Platte auf den Kopf.
13. Platz 200 ul von para-Nitrophenylphosphat (pNPP) Substratlösung in jede Vertiefung. Das Substrat ist bei -20 ° C ein Feststoff, so stellen Aliquots und rufen Sie die erforderliche Anzahl von Teilmengen für den Nachweis aus dem Gefrierfach nötig auch vor der Zeit, so ist es vollständig von diesem Zeitpunkt aufgetaut.
14. Bei 30 min stoppen die Reaktion durch Zugabe von 50 ul 3 M NaOH in jedes Loch.
15. Die Absorption bei 405 nm sofort auf der ELISA-Plattenlesegerät.

Hinweis: Wenn das rekombinante Protein von Interesse sich nicht in die Vertiefungen legen, ist es möglich, zu verändern thZusammensetzung E / pH des Puffers wesentlich (Carbonat-Puffer, pH 10,0) oder fügen Chaotrope (Harnstoff), um zu versuchen, Protein Bindung an die Vertiefungen von Mikrotiterplatten zu unterstützen. Jedoch die Wiederherstellung, daß das rekombinante Protein: 1) bleibt an der Mikrotiterplatten unter den Bedingungen für die Affinitätsselektion und, 2) behält seine biologische Aktivität nach der Entfernung des hohen pH / Chaotrop empfohlen.

2. Wachsende bakteriellem Wirt (BLT5403) für Titrierung

1. Autoklav (2A) zehn 250 ml-Erlenmeyerkolben und 3 Kulturröhrchen. Machen LB Flüssigkeit und LB-Agar zum Gießen festen Medien-Platten. Coole LB-Agar bis 50 ° C und fügen Ampicillin bis 100 ug / ml vor aseptisch Gießen in Petrischalen in einem Strömungshaube (Abbildung 2B).
2. Auch in einem Strömungshaube (2B) Serie ein LB, 100 ug / ml Ampicillin (LB ^AMP100) Agar-Platte für Einzelkolonien BLT5403 ab Lager in 15% gehalten (v / v)Glycerin bei -80 ° C (Fig. 2C). Zeigen Platte auf den Kopf bei 37 ° C über Nacht in einem Inkubator für Wachstum (2D).
3. Am Morgen impfen 50 ml LB ^AMP100 in einem 250 ml-Erlenmeyerkolben mit einer Einzelkolonie von der Platte aufgenommen. Inkubieren bei 37 ° C, 200 rpm in einem Horizontalschüttler (Fig. 2E und 2F), und mit einem Spektrophotometer, um die Zelldichte auf _OD600 = 0,5 bis 0,6 (2H) überwachen.
4. Gießen Sie die Zellen in ein 50 ml-Falcon-Röhrchen oder ähnlich, und halten bei 4 ° C bis zur Verwendung (2G). Die Zellen werden in der Regel lebensfähig bleiben für ca. 1 Woche.
5. Stellen Sie 500 ml LB, legen Sie sie in einem Schikanefernbach-Kolben und autoklavieren. Sobald es steril ist, wird der Kolben bei 4 ° C (2G) oder bei Raumtemperatur bis zur Nacht des "DAY ONE" unten.

Hinweis: Die bakteriellen WirtszellenBLT5403, eine plasmidgetragenen Quelle des T7 nativen Kapsidprotein ohne die die T7 Mitte und low-copy-Vektoren nicht erfolgreich replizieren exprimieren, sind äußerst anfällig für das Virus. Es ist zwingend notwendig, um eine Kontamination zu vermeiden. Verunreinigungen werden schließlich treten an diesem Punkt alle Oberflächen in Kontakt mit dem Virus / infizierten Bakterien muss mit 70% (v / v) Ethanol abgewischt oder mit Detergens gewaschen (2I) werden. Wenn diese unwirksam ist, ist eine gründliche Dekontamination von allen Oberflächen, die Envirocide (2J) standhalten kann erforderlich. Starten BLT5403 Zellen aus dem Gefrierschrank Bestand jedes neue Runde der Affinitätsselektion zur Linderung Kontamination der Lager in 4 ° C und sorgen kräftige Zellen werden im Protokoll verwendet. Filter Barriere Pipettenspitzen sind unerlässlich.

3. Affinity Auswahl

ONE DAY

1. Mark eine Mikrotiterplatte mit dauerhafter Tinte und bezeichnen die Brunnen werden die prot enthalteneins / Änderungen. (Aufgrund der Verunreinigung Fragen werden die Platten nicht wiederverwendet). Führen Sie diese in 3 Wiederholungen von Brunnen für jedes Protein und Behandlung.
2. Ausgiebig Waschen Sie die Platte mit Wasser und Wasser zu entfernen durch Schmatzen die Platte umgedreht auf 4 Lagen Küchenpapier zwischen den Waschgängen. Immobilisieren, in 100 &mgr; l Tris, pH 7,5, (oder Puffer nach Wahl) das rekombinante Protein (10 ug / ml) in sechs Bohrungen oder BSA (10 ug / ml) in drei Vertiefungen, für insgesamt 9 Vertiefungen für die erste Runde der Affinitätsselektion. Decken Gericht mit Plastikfolie und lassen Sie über Nacht bei 4 ° C (2G).
3. Stellen Sie sicher, dass es 9 x 250 ml-Erlenmeyerkolben (siehe 2.1) gereinigt, autoklaviert und entsprechend gekennzeichnet (Codierung mit farbigen Band gut funktioniert, 2F).
4. Berechnen des Volumens des Phagen-Lysats für jede Vertiefung auf dem Titer der verwendeten Bibliothek und der Anzahl von Phagen, die gescreent werden, basieren.
5. Stellen Sie sicher, dass frische BLT5403 Zellen sind gebrauchsfertigTitern für diese Affinität Auswahlrunde morgen (3A).
6. Ausreichende 1x TBS (150 mM NaCl, 50 mM Tris-Base, pH 7,6) und TTBS 1x (1x TBS + 0,05% (v / v) Tween 20) sind 10 × 200 &mgr; l Waschanlagen für die Anzahl von Vertiefungen verwendet führen . Zusätzlich vorinkubiert die TTBS an der Affinitätsselektion Temperatur. Stellen Sie sicher, dass eine Sicherung, versiegelt, 50 ml Falcon-Röhrchen aus 1x TTBS an der Affinitätsselektion Temperatur mit ausreichender 1x TTBS existiert.
7. Bereiten Sie 3 Behandlungen x 3 Wiederholungen x 3 dreifach von 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen (27 gesamt) mit 990 ul jeder LB ^{100 AMP} und entsprechend zu kennzeichnen (z. B. 10 ^-2). Diese sind für die infizierten Bakterien aus den Vertiefungen von Mikrotiterplatten abgerufen morgen. Markieren der Verdünnung auf einer Seite des Rohres (10 ^-2) und einer aufsteigenden Reihe auf der anderen Seite ("1"). Für jedes Eppendorf-Röhrchen, auch beschriften ein Borosilikat-Rohr und ein LB ^{100 AMP} Platte. In diesem way, die Platten und Borosilikat Reagenzgläser werden mit 1, 2, 3, 4, 5, usw.. zu machen Titerung schneller gehen. Danach kann die einfache Zahl der Verdünnung und der Behandlung auf dem Eppendorf-Röhrchen angepasst werden (z. B. # 12 Rohr war die dritte dreifach der ersten Replikation des BSA-Verdünnungssteuerung für 10 ^-5). Shop Eppendorf-Röhrchen und LB ^{100 AMP} Platten über Nacht bei 4 ° C (Abb. 2G und 3B).

Zum Beispiel: Starten Beschriftung 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen für 10 ^-2 drei Verdünnungen von Phagen aus der BSA-Replikation sowie einen 1, 2 und 3 (drei Dreifachwerte von Phagen-Titer für die Replikation eins), und markieren Borosilikat Teströhrchen 1, 2 und 3, in dem die infizierten Bakterien wird mit nicht-infizierten Bakterien und Top-Agarose vor dem Gießen auf LB-Agarplatten ^{AMP 100} (Fig. 3C) gemischt werden.

8. Für die serielle dilutions, Label-und Eppendorf-Röhrchen, jedem, fügen Sie 900 ul LB ^{100 AMP.} Sobald die ersten Verdünnungen (10 ^-2) der infizierten Bakterien werden für jedes Protein / Behandlung, Replikation und dreifach, morgen hergestellt, werden sie gut gemischt und 100 ul von ihnen aufgenommen und in den entsprechenden Eppendorf-Röhrchen mit 900 &mgr; l ^LB-100 hinzugefügt ^AMP für die 10 ^{-3-Verdünnung} (Rohre 4, 5 und 6 für die Replikation einer BSA-Kontrolle). (9 7, 8) und diese werden ihrerseits gemischt werden und die 10 ^-3 Verdünnung verwendet werden, um die 10 ^{-4-Verdünnungen} zu machen. Mit den 10 ^-4 Verdünnungen für die 10 ^-5 Verdünnungen (10, 11, 12), usw. um den Titer der ersten der drei BSA Replikationen (wells) erhalten.
9. Das gleiche wird für die BSA-Replikation zwei durchgeführt werden (auch 2), BSA-Replikation drei (auch 3), die drei Wiederholungen des vergifteten Köder und schließlich die drei Wiederholungen der Köderbrunnen. Am Ende sollte es Rohre f markiert seinrom 1-135 (135 ist die letzte dreifacher Ausfertigung der letzten Replikation der Köder bei der maximalen Verdünnung von 10 ^-6). Diese Eppendorf-Röhrchen über Nacht lagern bei 4 ° C (Fig. 3C zeigt die Eppendorf und Borosilikatröhrchen für alle Verdünnungen der Triplikaten der drei Wiederholungen (die drei Vertiefungen) BSA.
10. Start 2 oder 3 Kulturröhrchen BLT5403 Zellen (von Einzelkolonien von einer frisch ausgestrichenen LB über Nacht ^AMP100 Platte aufgenommen, von Schritt 2.2) wächst in der Inkubation Schüttler (2E und 2F) als eine Nacht-Kultur. Um die 500 ml LB (Punkt 2.5 oben), fügen Ampicillin bis 100 ug / ml und legen Sie die Fernbach-Kolben in der Klemme im Schüttelinkubator so wird es bei 37 ° C sein und belüftet den folgenden Morgen (2F).

Hinweis: Runde drei und vier ungefähre Verdünnungen von bis zu 10 ^-10 Volumen erfordern phage, um die Lautstärke der LB ^AMP100.

TAG ZWEI

11. Am nächsten Morgen, legen Sie die autoklaviert, leere 9 x 250 ml-Erlenmeyerkolben (eine für jede Mikrotiterplatte) in den Klammern in der Inkubation Shaker. Impfen der 500 ml LB ^{100 AMP} mit 500 ul von einer der-Nacht-Kulturen von Zellen BLT5403 begann gestern Abend (siehe Schritt 3.8 oben), wieder zu verschließen und starten Sie es wächst (37 ° C, 220 rpm). Schalten Sie das Spektralphotometer (2H) und stellen Sie es auf die Absorption bei 600 nm gelesen.
12. Entfernen Sie die Mikrotiterplatte von 4 ° C, entfernen Sie die Kunststoff-Folie, und entfernen Sie das ungebundene Protein von der Platte durch Waschen mit 200 ul 10x jedes Mal von 1x TBS pH 7,5 und Schmatzen die Platte umgedreht auf dem Papiertuch zwischen Wäschen. Block mit 200 ul 5% (w / v) BSA und 200 &mgr; l 5% (G / V) Blockierungsreagenz in TBS für 1 h (oder über Nacht, wenn bequem) mit der Platte in Plastikfolie eingewickelt.
13. Waschen Sie die Sperr solution 10x mit 200 ul jedes Mal von 1x TBST, Schmatzen die Platte umgedreht auf 4 Lagen Küchenpapier zwischen den Waschgängen. Es ist möglich, die Vertiefungen mit 200 ul Wasser in diesem Stadium zu füllen, decken Sie sie mit Plastikfolie und legen Sie sie bei 4 ° C für maximal 1 Woche zu speichern.

Hinweis: Starten Sie die Kultur bald genug, dass durch die Zeit, die Phagen-infizierten BLT5403 von der Fertigstellung der Affinitätsselektion bereit sind, hinzuzufügen, die Zellen in den 500 ml sind zwischen 0,6 und 1,0 OD _600. Wenn sie weit über 1,0 wachsen, kann die Lyse nicht aufgrund von Ressourcenbeschränkungen auftreten, wie Zellen nähern stationären Phase. Wenn die Zellen eine OD ₆₀₀ von 0,6 zumindest vor der Einführung des Phagen nicht erreichen, kann die Multiplizität der Infektion zu hoch sein, schnell die Zellen abzutöten, die die Darstellung des Lysats beeinflussen können. Wenn die Zellen noch nicht näher eine OD ₆₀₀ von 0,6 mit der Beendigung der Affinitätsselektion, inokulate der Kolben mit BLT5403 aus der zweiten (oder auch von beiden zweiten und dritten) Teströhrchen bei 37 º C (Fig. 2F) Schütteln. Wenn eine OD ₆₀₀ von 1,0 zu schnell nähert, schalten Sie die Heizung und den Shaker und den Deckel öffnen, um die Kultur zu kühlen und verhungern die Bakterien Sauerstoff. Wieder aufzunehmen Heizung / einmal Phagen Schütteln wurden hinzugefügt.

Von hier verwenden Filterbarriere Tipps, um Phagen Kreuzkontamination zu vermeiden.

14. Sobald der Kolben wird geimpft, legen Sie die Phagen-Bibliothek (100 ul) in mit den Proteinen, verschließen Sie die Platte mit Plastikfolie und bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
15. Bei 55 min, notieren Sie die OD ₆₀₀ der Zellen. Die Verdopplungszeit ist etwa alle 20 min. Gesetz entsprechend (siehe "Hinweis" oben).
16. Am Ende einer Stunde entfernen Sie die Plastikfolie von der Platte und sofort durch Ausschütteln des Phagen in das verwandelt Abfall und dann schnell Zugabe von 200 ul 1x TB waschenST. (Verwenden Sie ein multipipettor mit 1 = 100 ul Kopf und die Pipette auf Set 2 [dh liefert 200 ul / Kolben Depression] für diese und es schnell geht). Stellen Sie einen Timer für 1 min. Nach 1 min, schütteln Puffer in verwandelt Abfall, klatschen Platte auf den Kopf auf Papiertuch und legen Sie wieder auf der Bank (25 ° C-Platte). Wiederholen Sie die Schritte 10x Waschen.
17. Nach dem ^10. Wäsche, nehmen 200 ul BLT5403 Zellen aus der 50 ml-Falcon-Röhrchen bei 4 ° C und steckte sie in den Boden der Brunnen, aus dem die letzte Wäsche von TTBS entfernt wurde. Wickeln Sie die Platten in der Plastikverpackung und bei 37 ° C für 20 min gestellt, jede Phagen noch auf den Köder, um die Bakterien zu infizieren, stecken (siehe Hinweis in der Diskussion über die anhaltend abgerufen Phagen-und / oder Hoch Hintergrund aus wahllos bindenden Phagen).
18. Am Ende der 20 Minuten, packen die Platten und nehmen 10 ul Bakterien aus dem BSA bei 25 ° C die Replikation ein und legen Sie es in den 990 ul LB ^{100 AMP} markiert"1". Zweimal wiederholen mehr für diesen Schacht (Rohre 2 und 3), was 3 Triplikaten von 1/100 Verdünnungen der Phagen aus diesen auch. Dies ist ein BSA-Replikation dreimal abgetastet. Diese Verdünnungen werden verwendet, um die mittlere Titer ± SEM für die Replikation von BSA zu schätzen.
19. Machen Sie dasselbe für die Replikation 2 und 3 des BSA (drei dreifachen Proben von je 10 ul), für die drei replizierten Vertiefungen der vergifteten Köder-Protein und für den Köder-Protein. Setzen Sie diese 27 Eppendorf-Röhrchen zur Seite und bekommen die restlichen 170 ul der infizierten Bakterien in den Vertiefungen wachsende Richtung Lyse.
20. Wenn die Bakterien in dem Kolben wird bei OD ₆₀₀ = 0,6-1,0, dekantiert 50 ml Zellen aus der Fernbach-Kolben in jeder der neun 250-ml-Erlenmeyerkolben. Nehmen Sie die restlichen 170 ul des Phagen-infizierten BLT5403 Bakterien in der BSA-Replikation ein gut und es zu den 50 ml Zellen mit "BSA Rep 1" (gelbe Band) hinzufügen. Tun Sie dies für alle neun Brunnen und legte sie Schütteln im Inkubator (
21. Überwachung der Zellen in 37 ° C-Schüttler inkubiert, von Zeit zu Zeit für die Lyse (etwa 3 Stunden von der Zeit der Inokulation). Nehmen Sie die Verdünnungen aus den 27 ersten Verdünnungen (10 ^-2) in die entsprechenden, beschriftet Eppendorf-Röhrchen während dieser Zeit.
22. Um diese Verdünnungen von den ersten 27 Verdünnungen von 3.12 durchzuführen, nehmen Sie 100 ul der LB mit Bakterien aus Eppendorf-Röhrchen 1 (BSA Replikation ein, zuerst der dreifachen Proben aus dieser Verdünnung 1/100 davon auch) und an die ADD 900 ul LB in Eppendorf-Röhrchen 4 (1 x 10 ^{-4-Verdünnung} von BSA Replikation ein, zuerst der Dreifachproben von dieser gut).
23. Entsorgen Sie die Filterbarriere Tipp für eine neue, bevor man 100 ul der LB mit Bakterien aus Eppendorf-Röhrchen 4 bis zu den 900 ul LB in Eppendorf-Röhrchen 7 (1 x 10 ^-5 Verdünnung der BSA-Replikation ein, zuerst der dreifach hinzufügen Proben aus dieser gut). Fortsetzung der Verdünnungen (deigenen bis 1 x 10 ^-6) für alle Triplikaten aller Replikationen aller Proteine ​​und Behandlungen (135 Rohre insgesamt).
24. Sobald die Zellen lysiert, bringen die Kultur auf 0,5 M NaCl durch Zugabe von 5 ml einer 5 M NaCl Lager und Transfer zu einem markierten Zentrifugenflasche.
25. Zentrifugieren bei 8000 × g für 10 min bei 4 ° C. Dekantieren Stand (Virus) in einen sauberen, sterilen 50 ml-Falcon-Röhrchen.
26. Fügen Sie ein paar Tropfen Chloroform zu der Überstand dekantiert, in der Falcon-Röhrchen.
27. Lagerung bei 4 ° C für die nächste Runde der Affinitätsselektion.

4. Tag drei

1. Autoklaven oder bleichen alle Laborgeräte, die bei der Erzeugung dieses Affinität Auswahlrunde verwendet worden ist, um für die nächste Runde vorzubereiten.

5. Titrierung

1. Anzahl, wie viele feste LB ^{100 AMP} Platten, da es Verdünnungen in aufsteigender Reihenfolge (es sollte jetzt ein Teller für jeden Borosilikatröhrchen und Eppendorf-Röhrchen, die jeweils mit der gleichen Anzahl sein). Put die Platten in der 37 ° C-Inkubator (Fig. 3D).
2. Melt-Top-Agarose (1,0 g Bacto Trypton, 0,5 g Hefeextrakt, 0,5 g NaCl, 0,6 g Agarose, machen bis 100 ml, Autoklav) durch Lösen der Top-Agarose Flasche und abwechselnd die Mikrowelle die Flasche und wirbeln sie zu mischen, bis die Oberseite Agarose vollständig geschmolzen ist. Legen Sie die Flasche im Wasserbad auf 50 ° C (3E) abkühlen.
3. Nehmen Sie ein Borosilikat 10 ml Pipette mit einer Pipette Pumpe angebracht. Zünden Sie eine Bunsenbrenner. Schalten Sie ein Styropor Falcon Rohrhalter oder Kühler Deckel auf den Kopf auf die Bank und legen Sie die LB100 AMP Platten 1 bis 6 (frisch aus dem 37 ° C-Inkubator) darauf obersten Plate 1 (Abbildung 4A). Das Styropor hält die Platten warm.
4. Setzen Sie 250 ul BLT5403 Zellen von 4 ° C in jede der nummerierten Borosilikat Reagenzgläser am ersten Tag oben hergestellt (Abschnitt 3.7 und Fakten 4B und 4C). Arreichen die nummerierten Borosilikatröhrchen in der gleichen Reihe wie die aufsteigenden Verdünnungen in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen (4A).
5. Setzen Sie 100 ul von der Verdünnung in ein Eppendorf-Röhrchen in den 250 ul Zellen in Borosilikat Reagenzglas 1 (Abb. 4D und 4E). Heizen Sie den ersten 5 in der Pipette über der Flamme ein wenig (nicht zu viel! ~ 3 Seitenhiebe, 4F) und tauchen Sie in die geschmolzene Top-Agarose. Ziehen Sie 3 ml und liefern schnell in das Reagenzglas auf der Zellen / Phagen (4G).
6. Mix von schnippte mit dem Finger, während das Rohr mit der anderen Hand (4H) halten und den Inhalt auf der Platte (Abb. 4E). Kippen Sie die Platte und verwenden Sie das Reagenzglas Blasen und trockene Stellen zu jagen, bis die ganze Platte wird von der Top-Agarose bedeckt. Legen Sie sie beiseite, aufrecht auf der Bank abkühlen.
7. Entsorgen Sie die Borosilikatröhrchen, werfen Sie die Filterbarriere Spitze, erhalten einefrische und weiter, bis alle Verdünnungen wurden vergoldet. Abrufen LB ^{AMP-Platten 100} aus dem Inkubator, wenn sie nicht mehr als 6 zu einer Zeit aufgebraucht werden oder aber sie abkühlen, und der Top-Agarose zu schnell erstarrt.
8. Nachdem die Top-Agarose ist solide, drehen die Platten auf den Kopf (es ist wichtig, dies zu tun). Andernfalls wird der Agar / Agarose "weint", kondensiert auf dem Deckel, fällt auf der Top-Agarose und läuft über sie, unter den Phagen mit ihm macht es unmöglich, genau Titer) und entweder: 1) legte die Platten in den 37 ° C-Inkubator [zurück 4 Stunden später, um den Titer zählen als T7 ist aggressiv] ODER: 2) Lassen Sie sie den Kopf auf die Bank und sie bereit sind, um am nächsten Morgen Titer zählen.
9. Nimmt man alle notwendigen Vorkehrungen zum Schutz vor Bruches oder Verletzungen, wenn es nicht, setzen Sie die Top-Agarose-Flasche Kappe wieder auf lose-und Mikrowellen der Top-Agarose, bis es kocht. Tun Sie dies zweimal. Abkühlen lassen, ziehen dieKappe und legte es weg. Schalten Sie das Wasserbad bis auf die üblichen Temperatur oder schalten Sie es. Setzen Sie die Verdünnungen in der 4 ° C Kühlschrank. Sie werden benötigt, um die Titer zu interpretieren und / oder Redo einige der Titrierung.

6. Ermittlung und Berechnung der Titer

1. Untersuchen Sie die auf den Platten gebildet Plaque und entsorgen die mit konfluenten Lyse (5A zB 10 ^-2 Verdünnung). Bestimmen Sie, welche der verbleibenden serielle Verdünnungen ausreichend paar Plaque produziert haben, um eine genaue Tally (nd den 5A 5B) zu ermöglichen. Notieren Sie die Anzahl der Plaque von diesen Platten (Tabelle 1, Abbildung 5B).
2. Multiplizieren die Anzahl der Plaque von der Verdünnung und multipliziert diese Zahl durch 100, die Anzahl der Plaque-bildenden Einheiten pro ml der infizierten Bakterien aus den Vertiefungen (erhalten taken dh nur 10 &mgr; l der infizierten Bakterien wurden für jedes der Dreifach und s genommeno dies muss mit 100 multipliziert werden, um Zählungen pro ml) zu erhalten. Durchschnittlich die Anzahl der Plaque-bildenden Einheiten (PFU) pro Milliliter (PFU / ml unverdünnter infizierten Bakterien aus der Mikrotiterplatte gut gemacht), über die drei dreifach von diesem gut gemacht.
3. Bilden Sie ein Grand-Durchschnitt der Zählungen für die drei Wiederholungsvertiefungen und die Berechnung der Standardfehler des Mittelwerts (Tabelle 1). Dies ist, was in der Figur der Erhöhung Phagen-Titer für jede Runde der Affinitätsselektion und Behandlung (Fig. 5C) aufgezeichnet werden.

7. Plaque-Isolierung, PCR und Sequenzierung

1. Am Ende der Affinitätsselektion Runde 4, wählen Sie 18 einzelne, genau definierte, Plaque und Kolonien, mit einer sterilen Pasteur-Pipette, Zahnstocher, gelben Pipettenspitze oder einem ähnlichen Gerät, Kern diese Plaque von den Titerung Platten. Bei der Verwendung von Rohren oder Tipps, zuerst nass das innen mit dem Tris-HCl, pH 8,5, in der Eppendorf-Röhrchen (5D).
(Abb. 5E). Lassen Sie die Lampe mit der Pipettenspitze noch in der Agar / Top-Agarose und saugen den Kern (5F, siehe Pfeil).
2. Vertreibt den Kern in 100 ul Tris-HCl, pH 8,5, in der entsprechenden Rohr (5G) und kurz vortexen.
3. Erhitzen Sie 20 ul von diesem Volumen bei 65 ° C für 10 min.
4. Zentrifugieren des erhitzten Volumens bei 13.000 × g in einer Tischzentrifuge bei Raumtemperatur für 10 min. Nehmen 3 ul aus dem Überstand dieser Aliquot in PCR-Reaktionen mit T7 und T7-UP-DOWN-Primer verwendet werden.
5. Für jede der 18 isolierten Plaque, erwärmten Lösungen, machen Sie eine 50 ul PCR-Reaktion unter Verwendung eines Annealing-Temperatur von 58 ° C und 35 Zyklen.
6. Führen Sie 20 ul each Reaktion auf einem 1% (w / v) Agarose-Gel, enthaltend 0,015% (v / v) Ethidiumbromid. Visualisieren Sie mit einem Transilluminator mit geeigneten Augenschutz und Handschuhe Nitril Labor. (ACHTUNG: Ethidiumbromid ist ein starkes Mutagen.) Fotografieren Sie das Gel und Entsorgung von kontaminiertem Material richtig (6A und 6B).
7. Wenn die Amplikons sind einzelne Produkte, und nicht aus einem leeren Vektor (Produkt läuft in der Nähe von 100 bp auf einem 1% (w / v) TAE-Agarose-Gel, 6A und 6B Pfeile), reinigen Sie die restlichen 30 ul für die Verwendung als Sequenzierung Vorlage. Wenn nicht ein einziges Produkt auf dem Gel (6B, Plaque 15), schneiden Sie die prominenteste Band (e) aus dem Gel und extrahieren die DNA aus dem Gel mit einem Kit.
8. Reihenfolge die Amplikons, die nicht leer sind Vektoren unter Verwendung der T7-UP Grundierung.
9. Untersuchen jeder Sequenz der Linker-Arme, und aus dieser Information bestimmen, wo der Beginn des Einsatzes befindet. Verwenden Sie die Basic Local Alignment Search Tool (BLAST, die National Library of Medicine), um die Identität der kodierten cDNA zu bestimmen, ob der Einsatz in dem Rahmen, und wenn ja, was ist Teil der Protein-kodierende Sequenz (CDS), die durch die angezeigt wurden und gefangen Köder.

Representative Results

Die Möglichkeit, die Kapazität des Köders mit Phagen präsentierten Proteinen interagieren (metabolisch Vergiftung der Köder) beeinträchtigen eine starke negative Kontrolle für diese Technik. Es ist auch ratsam, um zu bestimmen, wenn der Köder, wenn sie auf die Mikrotiterplatte gebunden ist, behält seine Funktion. Beide Prüfungen werden das Vertrauen, das die Interaktion, auf Phagen-Proteine ​​durch die nonpoisoned Köder erholt sind legitim zu erhöhen.

Probenahme drei dreifach aus jeder Vertiefung trägt wesentlich zu der Zeit und Arbeit in der Affinitätsselektion, bietet aber eine genauere Schätzung der Titer in jedem gut als nur einmal Probenahme. Während die meisten der Titer für die dreifach sind in guter Übereinstimmung zu beachten, dass die dreifach für die Replikation 2 der BSA in Runde vier sind sehr unterschiedlich (Tabelle 1). Durch Abtasten mehrere Male, sind die letzten geschätzten deckt sich nicht so anfällig für Fehler und Pipettieren eine genauere Schätzung der ter tatsächliche Titer und die Variation um dieser Schätzung, gut-zu-gut erhalten (Tabelle 1, Abbildung 5C).

Steigende Phagentiter, bevorzugt für die nonpoisoned Köder, da die Zahl der Affinitätsselektion Anstieg komplettiert, bietet auch das Vertrauen, dass die Technik funktioniert (5C). Die Zurückhaltung von einem steigenden Anteil von Phagen, Einsatz in nonpoisoned Köderbrunnen wie die Anzahl der Auswahlen Affinität steigt auch glücksverheißenden (6A und 6B).

Nach fortgeschrittenen Runden Affinitätsselektion, eine Erhöhung der Anzahl von unabhängig erholt Phagen, legen haben (erkennbar als PCR-Produkte in der Größe größer als ~ 100 bp, 6B), bezogen auf die erste Runde (6A) und die Ansiedlung von diese Amplikons auf ein paar gleich große Bands (Anmerkung Spuren 5-9, 11-18 in 6B </ Strong>), ist ein guter Hinweis darauf, dass bestimmte Klone, die in der Affinitätsselektion ausgewählt (6A und 6B). Nach der Sequenzierung einer Reihe von Plaque in der letzten Runde der Affinitätsselektion erhalten wird, ist Abruf einer ähnlichen Bereich (verschiedene Klone) des gleichen Proteins unabhängige Bestätigung, dass der Teil der angezeigten Protein eine bona fide Affinität für den Köder. Diese unabhängig gewonnene Phagen auch Informationen darüber, welche Teil des Gesamtproteins, die zur Wechselwirkung mit dem Köder ist. Wenn der Phagen-cDNA-Bibliothek wurde mit Random-Priming aufgebaut ist, kann eine große Vielfalt von Teil-und full-length-Protein-Deckung (in den Grenzen des Phagen an die cDNA-Insertion Größe tolerieren) gerechnet werden, was zu mehreren, unabhängigen Klonen die den gleichen Teil des Proteins. Auch die angrenzenden out-of-Frame-Hits sollten genau geprüft werden, um festzustellen, ob sie ein ähnliches Motiv, auf die die ba kodierenes bindet. (Dies setzt voraus, dass die Bibliotheken wurden nicht mit ^{ORF-3-Technologie} aufgebaut).

Tabelle 1. Berechnungen für die durchschnittlichen Titer / ml infizierten Bakterien aus den Vertiefungen der vierten Runde der Affinitätsselektion für die drei Behandlungen. Die Zahlen für jedes dreifacher Ausfertigung der 10 ^-3 Verdünnung der Plaque von der ersten Replikation der Köder gut genommen von 5B übernommen. Klicken Sie hier, um größere Tabelle anzuzeigen .

Abbildung 1. Insgesamt grafische Darstellung der Phagen-Display-Verfahren A) Zugriff auf eine Phagen-Bibliothek unter Verwendung von zufällig grundiert, Poly-A-RNA ausgewählt, für die Erzeugung der cDNA vorzugsweise so aufgebaut, und b) ein Köder, ist, soweit möglich, überprüfbare als biologisch aktive, selbst wenn sie auf einem festen Träger immobilisiert ist und, falls möglich, inaktiviert durch Zugabe eines Inhibitors (zB kompetitiv die Bindung von Köderprotein inhibiert). RT: Reverse Transkription.

.. Fig. 2 Ein Teil der Ausrüstung und Material zur Durchführung Phagen-Display erforderlich Sterile Technik erfordert Zugang sowohl: a) einen Autoklaven, b) einer Sterilbank. Phagen-Bibliotheken und BLT5403 bakterielle Lager erfordern -80 & # 176, C Temperaturen für längere Lagerung C) wachsen Phagen und Bakterien erfordert, DF) 37 ° C Inkubator, von denen eine, EF) wachsen können Flüssigkulturen (Orbital) ist. Optimierung des Experiments durch Farbcodierung, F) minimiert Fehler. BLT5403 Zellen zur Titrierung kann bis zu einer Woche, G) bei 4 ° C gelagert werden Optimierung der Platzierung des, H)-Spektralphotometer für folgende Zelldichten neben der umlaufenden Shaker können Sie Zeit sparen. Häufig Behandlung von Oberflächen und Pipetten mit, I) leistungsfähige Reinigungsmittel und J) Envirocide, kann helfen, das Risiko einer viralen Kontamination zu minimieren. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

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3. Eine mögliche Set-up ermöglicht nützlich für glatte Affinitätsselektion. A) Die BLT5403 sind ein oder zwei Tage vor der Titerung gewachsen und überzogen, ohne virale Einführung, um festzustellen, dass sie nicht mit dem Virus kontaminiert. Titrieren am Tag der Affinitätsselektion kann durch vorab Herstellung von erleichtert werden: B) prelabeling Eppendorf und c) Borosilikatröhrchen verwendet werden B) Aliquotieren die Verdünnungslösungen LB ^100AMP und speichert sie bei 4 ° C über Nacht D.. ) Legen Sie die vornummerierte, LB-Agar ^100AMP haltigen, Petrischalen bei 37 ° C ca. 1 Stunde vor Titern. E erwärmen) Schmelz die sterile Top-Agarose (Lösen Sie die Kappe) und es in einem vorgeheizten 50 ° C Wasserbad abkühlen auf diese Temperatur eine Stunde vor Titerung beginnt. Verwenden Sie ein leAd-Donut, die Flasche Kentern zu vermeiden, wie Top-Agarose entfernt wird. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Abbildung 4. Titerung den Phagen aus einer Runde der Affinitätsselektion gewonnen. Überzug beginnt so bald wie möglich nach der Infektion auf künstliche Inflation des Titers. A) Der erste Satz von Virus-infizierten BLT5403 Verdünnungen und den Borosilikatröhrchen in Racks montiert verhindern. Mit Filterbarriere Tipps: BC) 250 ul BLT5403 Zellen aus dem Lager von 4 ° C sind auf die Borosilikat-Röhrchen überführt. Mit Filterbarriere Tipps: DE) Die BLT5403 in der ersten Borosilikatröhrchen mit dem fi infiziertrst Virusverdünnung. F) Die Borosilikat-Pipette wird über einer offenen Flamme Verstopfung zu verhindern und um die Top-Agarose warm beheizt. . Mäßig die Pipette nicht erhitzen oder die Bakterien gebrüht und sterben G) 3 ml geschmolzenem Top-Agarose schnell abgerufen und übergossen den Bakterien in der Borosilikatröhrchen H) Das Rohr ist kurz zuckte, um den Inhalt zu mischen und;. I) Die Inhalte gegossen auf die vorgewärmten LB-Agar-Platten ^100AMP, mit dem Rohr, um Blasen an den Seiten der Platte zu bewegen und sicherzustellen, dass die Top-Agarose deckt die gesamte Platte. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

5. Typische Titer Wiedernisse. A) Die unteren Verdünnungen (10 ^-2) fast immer in konfluenten Lyse für alle Behandlungen in der ersten Auswahlrunde Affinität (das Virus in der Abbildung erzeugt worden sind, übermäßig lange was zu einer übermäßigen Plaquegröße, die Fotografie zu erleichtern) führen. B) Die entsprechenden Verdünnungen von Plaque werden mit einem Sharpie zu verfolgen indizierten Plaque halten gezählt. C) Die Titer drastisch für Köderbrunnen während verbleibenden mehr oder weniger stabil für BSA oder vergiftete Köder. In späteren Runden, ist Titer von Köderbrunnen Hochebenen und weiteren Affinitätsselektion unproduktiv. D) Eine gut isolierte Plaque für die Sequenzierung durch Benetzung der Weide Pipette mit Lösung aus dem Eppendorf-Röhrchen, wobei Sie auf die überschüssige Flüssigkeit mindestens beseitigen ausgewählt und gesammelt laufen über mehrere Plaque und verunreinigen den Kern. E) Die Pipette wurde durch die Plakette mit der Pipette Glühbirne bereits komprimiert geschoben worden. F) Die Glühbirne wurde veröffentlicht, während die Pipette ist noch in der Top-Agarose, saugen die Plaque bis in die Pipette (Pfeil). G) Die entkernten Plaque ist im Begriff, in die Flüssigkeit in der entsprechenden Eppendorf-Röhrchen geliefert werden. Phagen-Verdünnungen (Volumen der infizierten Bakterien pro Volumen von LB ^100AMP) auf den Petrischalen (zB 10 ^-3 = 1/1, 000 Verdünnung) dargestellt. Die drei dreifachen Proben von der Replikation gut 1 als Reise abgekürzt. 1, Trip. 2 und Trip. 3, alle für die Replikation ein (Rep. 1 = gut 1). Die Zahlen am unteren Rand der Platten in B) sind die tatsächlichen Zahlen Plaque auf den Platten ausgezählt. Diese sind für die 10 ^-3 Verdünnung der Bakterien aus der vierten Runde der Affinitätsselektion (R4 im Bild) über den Köder. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Abbildung 6. Typische PCR-Ergebnisse für Affinitätsselektion über einen geeigneten Köder. A) Der Anteil der Leervektor Plaque (Pfeile) ist in der Regel recht hoch, aber zunächst, in Köderbrunnen, B) in den folgenden Runden ab. Die Plakette enthält Einsatz tendenziell auf diejenigen, die gleich großen Einsatz in dieser Auswahlrunde später Affinität zu begleichen. MWM: Molekulargewichtsmarker.

Discussion

Indem das Experiment in drei replizierten Vertiefungen, kann einzeln erfasst Phagen des gleichen Proteins, das an dem Köder zu unterscheiden, selbst wenn sie die gleichen Klon (dh kein Unterschied in der Nukleotidsequenz der CDS-Region, die erfasst worden ist, aber diese haben sich von unabhängigen Brunnen abgerufen). Ansonsten ist der einzige Weg, um unter den gleichen Phagen-Protein-Bindung an den Köder kodiert, zu unterscheiden, ob sie unabhängig voneinander revers transkribiert Regionen, die in einem Teil der Nukleotidsequenz unterscheiden.

Die Verwendung von einem Fernbach-Kolben, in dem alle der Bakterien zur Verwendung bei der Verstärkung der Affinität ausgewählten Phagen wachsen erlaubt eine viel weniger hektischen Überwachung des Bakterienwachstums bis zum Infektion nach Affinitätsselektion als zu versuchen, 9-Erlenmeyerkolben zu überwachen. Dekantieren diese Bakterien, nur vor der Infektion, in vorgewärmten Erlenmeyer-Kolben beseitigt auch Unterbibliothek Titer Abweichungen auf die alteRationen in der Vielfalt der Infektion aufgrund der schlechten Bakterienwachstum in bestimmten Flaschen. Daher sollten Änderungen in Phagen-Titer von Rund-Rund auf die Anzahl der Phagen in den Vertiefungen gehalten und die Änderung im Titer unter replizierten Vertiefungen minimal sein abhängen.

Eine außergewöhnliche Vorteil mit Phagen-Display ist die große Macht der Technik hat bei der Identifizierung von Phagen-angezeigt-Protein, das eine Affinität zu einem bestimmten Köder haben. Aufgrund der Effizienz, mit der die Phagen-Replikation in der Wirts BLT5403, auch nur einen einzigen Phagen, die eine seltene CDs, die in einem gut in der ersten Auswahlrunde Affinität gehalten wird, sollte der Mantel-Fusionsprotein haben eine hohe Affinität für den Köder, wird in der zweiten Runde von viel größerer Zahl vertreten sein. Von der vierten Runde sollte diese Phagen die Mehrheit der Phagen in der lysierten Kultur vorhandenen darstellen.

Diese Fähigkeit des Phagen auf hohe Titer repliziert ist auch eine Begrenzung der technique. Wenn eine bestimmte Köder hat einen Proteinpartner wechselwirkenden, für die es eine hohe Affinität in der Bibliothek, ist es sehr schwierig, Proteine ​​binden können, die berechtigter den Köder jedoch mit einer geringeren Affinität zu erfassen, da diese dazu neigen, durch den hochaffinen Bindungsprotein outcompeted werden . Der Einsatz von Next Generation Sequencing-Techniken, um solche seltenen Phagen zu identifizieren, ist eine mögliche Mittel zur Umgehung dieser Einschränkung ^ein. Darüber hinaus die Anfälligkeit der BLT5403 den T7-Phagen Ergebnisse in Anfällen von "Verunreinigung" in der gesamten Labor, das Ausdauer, ziemlich hart Dekontaminations (zB Envirocide) und ausgezeichnete steriler Technik zu überwinden erfordert. Verunreinigungen können zu einer erheblichen Zeitverlust in den Fortschritt der Affinitätsselektion führen, wie man versucht, zu identifizieren und zu beseitigen die Quelle.

Ein Mittel, die den Erfolg in Partitionierung Phagen in enge und lose "Bindemittel" beschränkt hat, ist zu versuchen, wieder das lose Bindemittel ersten by Einführung in die Vertiefungen einer Lösung (1% SDS oder ähnliche Chaotrop) zur Phagen, die weniger eng mit dem Köder gebunden sind, zu entfernen. Diese Lösung kann dann entfernt werden, vor der Einführung der Bakterien in die Vertiefungen, die erwartet werden, um diejenigen Phagen gebunden bleibt, um den Köder infiziert. Diese Technik kann auch die Hintergrund, fälschlicherweise bindenden Phagen, erheblich. Wenn jedoch diese Technik verfolgt, die Zahl der Teilbibliotheken, Wiederholungen und Duplikate Affinität in nachfolgenden Runden ausgewählt wird verdoppelt, was erheblich zu der Zeit und Kosten hinzu.

Nach dem Verlauf der Phagen-Titer Anstieg über mehrere Runden der Affinitätsselektion kann durch ein großes Volumen von LB und einer großen Anzahl von LB ^{100 AMP} Platten, Filterbarriere Spitzen, Eppendorf-Röhrchen usw. ausgeführt werden. Das ist teuer wie das erforderlich ist, um auch eine bescheidene Anzahl von Phagen untersuchen Sequenzierung. Titrieren einer großen Anzahl von Verdünnungen von mehreren Wiederholungen treatments in dreifacher Ausfertigung erfordert viel Zeit, so dass die Bedeutung der Einrichtung so viel von dem Material wie möglich am Tag vor der Affinitätsselektion im Vordergrund steht.

Eine aufregende Möglichkeit, das gerade untersucht wird, um die Position der unabhängigen Phagenproteine ​​zu verwenden, die Bindung an einen Köder, um die physikalischen Eigenschaften und die dreidimensionale Struktur des Bereichs des Proteins in Wechselwirkung mit dem Köder zu modellieren. Beispielsweise die Prüfung der Eigenschaften der Zielproteine ​​zu einer Reihe von homologen späten Embryogenese gebunden Reichlich (LEA) Proteine ​​aus Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) und Sojabohne (Glycine max), war eine wichtige Erkenntnis, dass die LEA-Proteine ​​in der Region des gebundenen Proteine, die die meisten (oder zu den) hydrophilen der Bindungsproteine ^​​11 waren. Rückblickend, da die LEA-Proteine ​​sind die Hypothese aufgestellt, um ihre Kunden-Moleküle aus Denaturierung während der Dehydratisierung zu schützen, es kann sein, surmised daß der Bereich der Client-Moleküle besonders anfällig für Funktionsstörungen ohne LEA Schutz konnten die meisten binden kann Wasser (hydrophil) sein.

Es ist ratsam, die Zeit zwischen der Einführung von Bakterien in die Vertiefungen und deren Wiederherstellung zu minimieren, so dass die Titer nicht aufgeblasen. Stellen Sie sicher, dass die Verdünnungen durch Plattierung einige BLT5403 ohne virale Infektion zu überprüfen, dass die bakterielle Lager nicht verunreinigt ist und dass die größten Verdünnungen sind ausreichend, um konfluente Lyse vermeiden ausreichend.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tryptone	Becton Dickinson Co.	211705
Yeast Extract	Becton Dickinson	212750
Agar	Becton Dickinson	214010
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-10
Agarose	Research Products International	A20090
Blocking Reagent	EMD Chemicals Inc.	69064
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-100
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	BP359-212
Sodium Dodecyl Sulfate	Fisher Scientific	BP166-500
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-5
Chloroform	Fisher Scientific	BP1145-1
Escherichia coli BLT5403	EMD Chemicals Inc.	BLT5403	Genotype: F- ompT hsdSB (rB - mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR)
Ampicillin, Sodium Salt	Research Products International	A40040
Ethidium bromide	Fisher Scientific	BP102-1
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich Corp.	A-9647
Penta-HIS primary antibody	Qiagen Inc.	34660
Goat anti-mouse alkaline phosphatise conjugate	Sigma-Aldrich Corp.	A-5153
para-Nitrophenylphosphate	Sigma-Aldrich Corp.	N-7653
T7-UP primer	EMD Chemicals Inc.		5'-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3'
T7-DOWN primer	EMD Chemicals Inc.		5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'
Qiaquick PCR Purification kit	Qiagen Inc.	28104
Qiaquick Gel Extraction kit	Qiagen Inc.	28706
Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit	Invitrogen Life Technologies	4336917
Heating Block	Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.)	18780
96-well Cell Culture Plates	Corning	Costar 3590
Isotemp Incubator Oven	Fisher Scientific	516D
Pasteur Pipettes, 5 ¾ in	Fisher Scientific	13-678-20A
ChromaView Transilluminator	UVP Inc.	TS-15
UV Shield	Oberon	071AF
Gloves, Nitrile	Fisher Scientific	19-170-010C
Sterile 1.5 ml tubes	USA Scientific Inc	1615-5500
10 ml Borosilicate Pipettes	Fisher Scientific	13-678-25E
Borosilicate culture tubes	Fisher Scientific	14-961-27
Uniskan I, ELISA plate reader	Labsystem and Flow Laboratories, Helsinki, Finland	Type 362