Summary
우리는 장용 신경계의 신경 세포 및 교세포 구성 요소의 직접적인 연구를위한 세포 배양 프로토콜을 보여줍니다. coverslips는에 신경 / glia의 혼합 문화, 면역 전기 생리학, 개별 신경 세포와 아교 세포 기능을 검사 할 수있는 기능을 제공하는 성인 마우스 myenteric 신경 얼기에서 준비가되어 있습니다
Abstract
장용 신경계의 기능적 위장 운동성을 제어 위장관의 길이를 실행하는 뉴런과 교세포의 광대 한 네트워크입니다. myenteric 신경 얼기의 신경 세포와 교세포의 혼합 인구의 분리 및 문화에 대한 절차를 설명합니다. 차 문화는 뉴런과 교세포 사이에 개발 연결을 7 일 이상 유지 될 수 있습니다. 첨부 myenteric 신경 얼기와 세로 근육의 스트립 마우스 회장 또는 결장의 기본 원형 근육에서 제거하고 소화 효소를 받게됩니다. 무균 조건에서 분리 된 신경 세포 및 교세포 인구는 펠릿 다음 원심 분리 내에 보존되어 coverslips를에 도금. 24-48 시간 내, 신경 돌기의 가지가 발생하고 신경이 팬의 연결을 마커로 식별 할 수 있습니다. 문화 이틀, 고립 된 뉴런 화재 활동 전위는 패치 클램프 연구에 의해 관찰했다. 또한, 장내 아교 세포는 지문을 확인해 될 수 있습니다GFAP 염색에 의해 IED. 가까운 동격의 뉴런과 교세포의 네트워크는 5 일 안에 형성 - 뛰기. 장내 뉴런은 개별적이어야하며 직접적 면역, 전기 생리학, 칼슘 이미징, 및 단일 세포 PCR 등의 방법을 사용하여 연구 할 수 있습니다. 또한이 절차는 유전자 변형 동물에서 수행 할 수 있습니다. 이 방법은 수행하는 간단하고 저렴합니다. 우리는 더 나은 정상과 질병 상태에있는 ENS의 기능을 발견 할 수 있도록 전반적으로,이 프로토콜은 쉽게 조작 방식 장용 신경계의 구성 요소를 노출합니다.
Introduction
장용 신경계 (ENS)는 신경 및 위장 (GI) 요로의 전체 길이를 실행하는 아교 세포의 광대 한 네트워크이다. ENS는 기능적으로 연동, 액체 흡수 / 분비, 자극의 감각 등 (검토를 위해 1 참조) 등의 소화의 모든 측면을 제어합니다. 그것은 척수에있는 이상 만 500 개 이상의 뉴런을 포함하고 뇌에서 발견 된 모든 신경 전달 물질의 클래스가 포함되어 있습니다. 또한, ENS는 중추 신경계 2에서 입력없이 반사적으로 작동 할 수 있다는 점에서 독특합니다. ENS의 이해는 정상적인 생리적 역할을 이해하지만, (의 히 르츠 프룽 질환), 인수 (샤 가스), 질병 상태 (당뇨병 위 마비)에 보조 약 선천성 할 수 있습니다 신경 병증의 다양한의 참여를 이해하기 위해뿐만 아니라 중요하다 유도 (아편 대장 증후군), 부상 (수술 후 장폐색) 1 때문이다. 또한, 장내 뉴런은 다시 할 수 있습니다바이러스 감염 (수두 대상 포진) 3 servoir. 때문에 뇌와 창자에있는 세로토닌의 높은 수준의 유사성, 중추 신경 계통의 결함을 치료 목적으로 약물은 종종 ENS 2 원치 않는 부작용이 있습니다. 그것은 알츠하이머 질환과 파킨슨 병 등 많은 신경 병증은 ENS 이러한 질병 4의 병인을 연구하는 접근 모델을 만들고, 중앙 신경에있는 자신의 모습 오래 전에 장내 신경 세포에서 유사한 세포 변화를 보여주는 것 또한 주목할 만하다. 따라서 ENS의 철저한 이해는 질병 상태를 이해하고 약물 부작용을 예방 / 예측 필요성이다.
ENS의 뉴런은 전통적으로 8월 5일에서 7일까지 또는 양식 뉴런 wholemount 준비를 사용하여 기니 돼지에서 공부하고 있습니다. 뉴런이 큰 동물에서 연구 될 수있는 용이함에도 불구하고,이 모델 등 많은 한계가있다유전자 변형 종자,이 종의 특정 시약의 부족, 그리고 이러한 주제를 주문과 주택과 관련된 높은 비용의 부족. 쥐 장용 신경계 모델의 개발 시스템, 세포 배양 기술과 함께 사용할 수있는 다른 설치 방법의 광대 한 배열, 그리고 기니 돼지 모델에 대한 유효성 검사를 제공하는 기능 중 다양한 노크의 고유 한 장점을 가지고 .
창자의 연동 작업을 주로 담당하는 외부 myenteric 신경 얼기 (경도와 원형 근육 사이)뿐만 아니라, 점막과 점막 플렉시 (: ENS는 위장관의 길이를 실행하는 세 가지 플렉시으로 구성되어 있습니다 주로 액체 흡수 / 분비 자극 1의 검출을 제어 점막, 각각) 아래에서 발견. 이 방법은 필링으로 세로 근육 / myenteric 신경 얼기 (LMMP) 준비의 격리로 시작GI 기관의 외부 근육 층 호텔 전문가. 이 극적으로 점막 층이 분리에 관여 할 때 발생하는 오염 문제에 아래로 잘라냅니다. 결과적으로,이 과정은 오히려 ENS의 분비 활동보다 운동성 신경 제어의 연구에 이상적입니다.
방법은 여기에 장내 뉴런과 교세포의 혼합 배양 결과를 발표했다. 뉴런의 적어도 두 가지 유형이 존재 이전의 전기 생리 및 면역 세포 관찰 9를 기준으로합니다. 아교 세포의 존재는 그들이 자신의 권리 연구하는 중요한 세포 유형뿐만 아니라이기 때문에 매우 유익하지만 그들은 장내 신경 (10)의 생존에 기여하고 신경 세포 표면에 11 고유 수용체의 발현을 유지한다. 또한, 장내 아교 세포의 결함은 '신경 gliopathies'12 만들어 낸 이상한 위장 운동성 질환 상태로 이어질 수 있습니다. 따라서 ENS 문화는 여기에 제시된 연구조사 익은 여러 가지 세포 유형의 esults.
이 방법론의 장점은 격리, 저렴한 도구 요구 사항 및 경험 실험실 요원에 의해 기술을 마스터하는 짧은 시간의 용이성이다. 방법의 한계는 전반적으로 낮은 세포 높은 조직 볼륨에서 수율 및 점막 및 점막하 플렉시에서 ENS 뉴런의 배제를 이용하실 수 있습니다. 이 절차는 전기 생리학, 면역, 단일 셀 PCR 및 기타 방법론 전문 학자에 매우 유용 할 것입니다.
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Protocol
모든 동물 관리 및 실험 절차에 따라이었고, 버지니아 커먼 웰스 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인.
1. 24 잘 접시에 무균 폴리-D-라이신과 라미닌 코팅 유리 coverslips를 준비
- 1 단계의 모든 절차는 무균 조건에서 수행되며, 후드, 멸균 시약. 유리 coverslips를 두 번 탈 이온수 (DDH 2 O)은 사전에 소독해야한다. 접시의 준비는 신경 세포의 분리 2 주 전에까지 수행 할 수 있습니다.
- 후드 아래, 24 - 웰 플레이트의 12 우물 멸균 유리 coverslips는을 배치 멸균 집게를 사용합니다.
- 미리 폴리 - D - 라이신 재고를 준비합니다. 5 MG 폴리 - D - 라이신에 멸균 ddH2O의 50 ML을 추가합니다. -20 ° C.에 소용돌이 3 ML의 분주에 저장 사용하기 전에 분주 해동.
- 피펫 80 μL : 25cm 2 당 1 ML 폴리 - D - 라이신 주식의 최종 농도에 대한각 유리 coverslip을 (2cm 2)의 위에 폴리 - D - 라이신 주식. 솔루션은 10 분 동안 정착하자.
- 폴리 - D - 라이신 사용하여 진공을 제거하고 살균 DDH 2 O와 배의 coverslips을 씻어
- 플레이트 후드 아래에 적어도 2 시간 동안 건조하도록 허용합니다.
- 접시는 4 ° C 또는에 저장 될 수있다 - 20 ° C 라미닌 코팅을 진행하기 전에.
- 미리 라미닌 주식을 준비합니다. 얼음에 라미닌을 해동하고 사용하는 동안 얼음에 보관하십시오. 50 ㎍ / ㎖의 농도로 희석, 많은 농도에주의를 지불한다; 각이 많이 다릅니다. 부지의 농도에 따라 약 20 ML DDH 2 O는 라미닌의 각 유리 병에 추가됩니다. -80에서 나누어지는 (5 ML) 및 저장 ° C. 사용하기 전에 얼음에 분주 해동.
- 5 ㎍ / cm 2 라미닌과 코트 coverslips는, 각 coverslip에 대한 라미닌 주식의 피펫 200 μL.
- 1 시간 동안의 coverslips에 라미닌 솔루션을 품어.
- 나머지 라미닌 솔루션을 기음과 한 번 coverslips를 씻어DDH 2 O coverslips는 표면을 긁어하지 마십시오.
- 최대 2 주 4 ° C에서 보관 플레이트.
2. 신경 분리 솔루션의 사전 준비
- (: 118 염화나트륨, 4.6 KCl을 1.3 2 PO 4, 1.2 황산 마그네슘, 25 NaHCO3를 11 포도당, 2.5 염화칼슘 NaH를 mm 단위) 크렙스 솔루션을 준비합니다. 장소 13.79 g 염화나트륨 (FW 58.44) 0.686 g KCl을 (FW 74.55) 0.312 g의 NaH 2 PO 4 (FW 120), 0.289 g 황산 마그네슘 (FW 120.4), 4.20 g NaHCO3를 (FW 84.01), 3.96 g 포도당 (FW 180.2), 2 L DDH 2 0 0.555 g 염화칼슘 (FW 111). 4 ° C.에 진정
- 미디어 (10 % 태아 소 혈청 (FBS) 및 항진균 / 항생제 F12 미디어) 씻어 준비 : F12 매체의 500 ML 병으로, 50 ML FBS 및 항진균 / 항생제 100X 액체 (GIBCO) 5 ㎖를 추가합니다.
- 장내 신경 미디어 (Neurobasal B-27와 미디어, 2 mM의 L-글루타민, 1 % FBS, 10 NG / ML, 아교 파생 Neurotr 준비ophic 인자 (GDNF) 및 항진균 / 항생제 100X 액체). GDNF 주식을 만들려면 -80 ° C.에 10 μg의 GDNF에 1 ML ddH2O을 추가하고 50 μl를 분주, 가게에 다시 동결 완전한 신경 세포 미디어 50 ML 유리 병의 경우, 47.5 ML Neurobasal 미디어 1 ML B-27 (50X), 500 μL FBS, 500 μl의 200 mM의 L-글루타민 (GIBCO) 50 μL GDNF 재고, 500 μL 항생제 / 결합 항진균 100X 액체. 미디어 GDNF의 신선도를 보장하기 위해이 비싼 휴대 미디어 혼합물의 대량의 오염을 방지하기 위해 작은 50 ML 일괄 처리에서 이루어집니다.
3. 마우스에서 수확 세로 근육 / Myenteric 신경총 (LMMP) 준비
- 동물 실험을 수행하기 전에 해당 국가 및 기관의 윤리 장소에 있어야합니다. 25g (일반적으로 나이 8 주 이상)에 무게 어른 스위스 웹스터 마우스는 이전의 실험 6 그룹으로 보관되어 있습니다. 두 쥐의 조직은 회장 장내 뉴런과 교세포의 분리에 사용되는 세 생쥐에 사용됩니다대장 세포의 분리.
- 수술 영역을 준비합니다. 작은 외과 가위, 직각 집게, 면봉, 3 개의 200 mL 유리 비커와 유리 / 플라스틱 막대 (붓) 수집합니다. 모든 전원이 완전히 세척하고 오염을 최소화하기 위해 사용하기 전에 세척되어 있는지 확인합니다. 이 단계는 실험 하루 전에 수행 할 수 있습니다.
- 산도를 안정화하기 위해 적어도 30 분 동안 carbogen (95 % 산소, 5 % CO 2)에 얼음과 거품에 크렙스 솔루션을 배치합니다.
- 원하는 온도에서 안정화하기 위해 다양한 장비와 따뜻한 화학 물질을 켭니다; 37 열 수조 (들) ° 4 ° C, 장소 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)와 물 목욕에 0.5 % 트립신 (37 ° C에 C, 차가운 원심 분리기 ). 완전한 신경 세포 미디어와 린스 미디어 냉장 유지해야한다.
- 장소 150 ML 얼음 추위 '더러운', '깨끗한'및 'LMMP'라는 3 개의 200 ML 유리 비커에 크렙스 포입. 거품 비커 carbogen와 'LMMP'로 분류.
- 윤리위원회, 안락사 m의 승인에 따라자궁 경부 전위 또는 CO 2 질식하여 여러개.
- 70 % 에탄올로 수술 표면에 깨끗한 피부에 지느러미 드러 누움에 마우스를 놓고 집게를 사용하여 복부 피부를 들어 올립니다. 가위, 오픈 복강 내부 소화 기관을 공개 사용.
- 회장의 섹션을 리프팅과 장간막를 공개하여 위장관의 길이를 제거합니다. 가위로 장간막을 통해 싹둑 부드럽게 제거하고 회장 / 결장의 장간막을 끌어 않도록주의하면서, 회장 및 결장을 해명한다.
- 소장의 전체 길이가 풀어 후에는 소장을 통해 맹장에 위 원위부와 근위부 절단하여 회장을 제거합니다. 참고 :이 절차는 근위부에 맹장 원위부에서 결장을 제거하여 대장 조직을 수행 할 수 있습니다 항문.
- 조직은 더욱 근위 및 원위 결장, 그리고 jejenum 및 회장 사이에 나눌 수 있습니다. 이 절차의 나머지는 회장의 분리를 참조합니다; t그 절차는 대장 LMMP의 분리에 대해 동일합니다. 차가운 얼음 크렙스는 '더러운'표시와 함께 유리 용기에 전체 회장을 놓습니다.
- 회장을 청소하는 도구를 작성하고 제출 돌을 사용하여 무딘 큰 20 G 바늘 얼음 차가운 크렙스을 포함하는 큰 주사기 (10 ㎖)에 연결합니다.
- 세 개 이상의 대형 조각으로 회장을 절개하여 회장에서 찌꺼기를 청소합니다. 커에서 회장 섹션을 제거하고 회장 조각의 끝으로 무딘 바늘을 배치합니다.
- 모든 배설물은 별도의 폐기물 용기에 제거 될 때까지 조심스럽게 용기 섹션을 크렙스를 실행합니다. '깨끗한'표시 크렙스의 용기에 세척 섹션을 배치합니다. 전체 회장이 정리 될 때까지 반복합니다.
- LMMP를 제거하려면 약 2 작은 세그먼트로 회장을 잘라 - 4cm입니다. 플라스틱이나 유리 막대에 회장의 세그먼트를 배치, 회장은 snuggly 히 적합하지만 (1 ~ 2 ㎜) 느슨하거나 팽팽해서는 안됩니다. 부드럽게 장간막의 비트를 제거하여 LMMP의 제거를 시작하기는 여전히 첨부집게를 사용하여 위장 (GI) 요로 에드. 부드럽게 엄지 손가락을 사용하여로드에 튜브를 고정하여 막대 주위에 회전하는 GI 기관을 방지합니다.
- 기본 원형 근육에서 LMMP을 분리, 먼저 부드럽게 부드럽게 세로 근육의 차이를 만드는, 정상에서 세그먼트의 아래로 장간막이 붙어 있던 전체 라인을 따라 포셉의 가장자리를 문질러. 그런 다음 부드럽게 크렙스 적신 면봉을 사용하여 세로 근육을 멀리 애타게.
- 세로 근육 갭의 상단에서 시작하고 길이 근육은 단지 원형 근육에서 분리 시작할 때까지 매우 가벼운 압력을 적용하는 동안 가벼운 수평 스트로크를 사용하여 멀리 애타게, 장간막 부착 점을 따라 전체 지구 아래이 작업을 수행합니다.
- 그런 다음 부드럽게 GI 관 해결하기 시작, 세로 근육이 서서히 관의 주위에 원형 근육에서 모든 방법을 분리로 처음부터 끝까지 다시 이동. 완료되면,LMMP 자연스럽게 GI 관의 나머지를 올 것이다.
- 'LMMP'표시 비커 세로 근육의 결과 얇은 스트립을 배치합니다. 모든 세그먼트에 대해이 단계를 반복합니다.
- LMMP의 모든 지구가 하나의 마우스에서 수집 한 후, 사용중인 다른 마우스에 대해 절차를 반복합니다. 철저하게 다시 사용하기 전에 '더러운'와 '깨끗한'비커를 씻어.
- 생물학적 오염을 제거하기 위해 배 LMMP을 씻어. 차가운 얼음 크렙스 세 개의 2 ㎖ 에펜 도르프 튜브를 채 웁니다. 원심 분리기 356 XG에 30 초 동안 첫 번째 튜브와 스핀 LMMP 스트립을 배치 4 ° C로 냉각 조심스럽게 피펫으로 뜨는을 제거하고 다음 깨끗한 크렙스 채워진 튜브에 LMMP 스트립을 이동합니다. 나머지 각 튜브에 대해이 절차를 반복합니다.
4. 다이제스트 LMMP
- 10 ㎖ carbogen - 버블 크렙스 용액에 13 밀리그램 콜라 2 형 및 3 MG BSA를 배치하여 소화 솔루션을 준비합니다.
- 소화 용액을 사용 SCIS에 헹궈 LMMP 장소 세그먼트미안하다이 작은 조각으로 LMMP을 싹둑.
- ° C 물 목욕 셰이커 37 60 분 가볍게 carbogen 함께 부풀어 오른되는 동안의 다이제스트 LMMP.
- 소화가 완료된 후, 원심 분리기 356 XG에서 13 분 동안 원심 분리하여 세포를 수집 4 ° C로 냉각
- 이 시점에서 모든 절차는 세포 배양 후드에서 무균 조건 하에서 수행되어야합니다! 모든 시약 및 컨테이너를 사용하기 전에 소독해야한다.
- 원심 분리하는 동안, 1 mL를 배치하여 0.05 %의 트립신 용액을 제조 0.25 % 트립신을 따뜻하게하고 4 ML은 멸균 50 ML의 세포 배양 관에 HBSS를 따뜻하게.
- 원심 분리 후 제거하고 상층 액을 버린다. 진공 청소기를 사용하지 마십시오,이 가능성이 낮은 원심 분리 속도에 의한 세포 펠렛을 빨아 것입니다. 조심스럽게 0.05 % 트립신 용액 5ml와 깨끗한 튜브에 세포 펠렛과 장소를 제거합니다.
- 37 7 분간 흔들어 ° C의 물을 욕조에 0.05 % 트립신 용액에 세포를 소화. 7 마일을 초과하지 않도록N 총 트립신 치료 나 신경의 멸망.
- 트립신 처리의 7 분 후 차가운 린스 미디어 10 mL로 트립신을 중화.
- 356 X g에서 13 분 동안 세포를 원심 분리기. 제거하고 용지를 버리십시오.
- 원심 분리하는 동안 멸균 15 ML의 세포 배양 튜브의 상단에 살균 Nitex 메쉬 부분을 균형.
- 원심 분리 후 제거하고 상층 액을 버린다. 3 ML 완전한 신경 세포 미디어 triturating으로 부드럽게을 Resuspend 세포 혼합물. 이 단계 세포 혼합물이 분쇄되는 미래의 모든 단계에서 기포가 발생하지 않도록. 모든 triturations 매우 조심스럽게 수행해야합니다. 깨끗한 15 ML 세포 배양 튜브에 Nitex 메쉬를 필터링 셀 솔루션입니다.
- 옵션 : 모자 세포 배양 튜브와 30 분 동안 온화한 회전 및 기울이기와 냉장 훌라 믹서 장소 (또는 회전을 제공하는 믹서). 이 단계는 선택 사항이지만 권장됩니다.
- 선택 사항 : 훌라 믹서 한 후, 세포를 씻어 2 ML 차가운 린스 미디어를 추가 할 수 있습니다.
- 원심 분리하여 세포를 (8 분 356 XG) 수집합니다. 제거하고 상층 액을 버린다.
- 1,200 μL 완전한 신경 미디어 세포를 resuspend을. 부드럽게 1 ML 플라스틱 피펫 팁을 사용하여 세포를 씹다. 공기 방울을 생성하지 않습니다. 대부분의 덩어리가 깨진되고 세포가 액체로 중단 될 때까지 천천히 부드럽게 피펫.
- 미리 코팅 된 유리 커버 슬립을 포함하는 12 우물 각각에 완전한 매체 750 μl를 추가하고 분쇄 세포 용액 100 μL를 추가합니다.
- 5 % CO 2와 37 ° C에서 세포 배양 인큐베이터에서 뉴런을 배양한다.
- 전지 매체 2 일 간격의 절반을 변경합니다.
- 뉴런은 1 일 이후에 전기 생리학 레코딩을위한 준비 - 문화 2 일.
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Representative Results
LMMP - 유래 세포, 뉴런과 다른 세포 유형의 직후 격리 쉽게 분명하지 않습니다. 생활은 불명료 한 표현형의 원형 세포뿐만 아니라 불완전하게 소화 조직 조각과 결합 조직에서 조직 암성로 볼 수 있습니다. 이 표류가없는 관심과 크게 이틀 첫 번째 미디어의 변화와 함께 제거됩니다. 건강한, 생존 세포도 제거되므로이 전에 슬라이드를 청소하지 마십시오.
문화 한 하루 후, 뉴런은 신경 돌기 가지를 표시하기 시작합니다. 뉴런의 특정 식별 여전히이 시간에 불명료 할 수 있습니다. 세포 실험 챔버로 전송하기에 충분한 접착을 제공, 그들은 문화 중 하나 하루 전기 생리학 연구를위한 준비가 될 것입니다. 5 - 그러나, 세포는 약 일 2 ~ 문화와 기능 연구를위한 이상적인 (전기 생리학, 칼슘 이미징)의 두 일 후에 더 자기편이다.
ENT "> 신경 세포의 형태 학적 특징은 문화에서 약 일주일 (그림 1) 이후 뚜렷한됩니다. 신경 세포 (glia의 산재 유행처럼 거의 '신경절'에 긴 돌기를 표시하고 자랄 때 이상적인 immunocyctochemical 기능은, 약 10 일 후에 확인할 수 있습니다 그림 2).이 염색이이 방법을 사용하여 이러한 세포의 시냅스 상호 작용을 연구 할 수 있습니다 제안합니다.문화 한 하루 후, 뉴런들은 사인 가야 비 또는 '정의 기능', 활동 전위 (그림 3)에 의해 인식됩니다. Electrophysiologically, 그들은 기능적으로 적어도 두 개의 신경 세포 유형으로 분류 될 수있다 : 후 과분극을 포함 뉴런과 나트륨과 칼륨 후 과분극 및 훨씬 적은 나트륨과 칼륨 전도도 (그림이없는 신경의 전류 / 밀도의 관계를 증가 4). AHP 긍정과 부정 Neurons은 각각 AH 및 이전 기니 작품에서 볼 S 뉴런과 상관 관계가 나타납니다. AHP 부정적인 뉴런 (S 뉴런)가되는 지점 몇번 하나의 긴 돌기가있을 때 AHP 긍정적 인 뉴런 (AH 뉴런)는 세포체 주위에서 발생하는 여러 긴 돌기가있다. 이것은 그림 1의 면역 세포 코딩과 함께, 그 신경 인구는 매우 이질적이다 제안합니다.
그림 1. 마우스를 세로 근육에서 분리 된 장내 뉴런과 교세포의 면역 특성은. 공 초점 현미경 전체 마운트 회장 세로 근육 신경 세포의 특정 β-III-튜 블린 (Abcam, 토끼, 1:1,000) 염색 (A) 마우스의 준비를 밝혔다. 세포는 고립 된 L에서calbindin (C) (Chemicon, 토끼, 1:1,000) 및 calretinin (D)에 대한 긍정적 인 얼룩, ongitudinal 근육 / myenteric 신경 얼기 (LMMP) 준비는 신경 세포 (β-III-튜 블린, Abcam, 토끼, 1:1,000 B)를 포함 (Swant, 토끼, 1:2,000). 아교 세포 (E)는 아교 특정 마커 GFAP (Chemicon, 마우스, 1:500)를 시각화했다. 항체는 적절한 염소 차 항체 알렉사 488 (녹색, 분자 프로브, 1:1,000) 0을 통해 시각화했다. 핵 Hoescht 33342을 (파란색, CG, 1 ㎍ / ㎖)을 사용하여 시각화 하였다. 일차 항체 (F)는 생략 될 때는 염색 보이지 않았다. . 수정 스미스, TH, 외에서 재 인쇄 모르핀은 나트륨 채널의 억제를 통해 장내 신경의 흥분성을 감소 PLoS 하나는 원문... 10.1371/journal.pone.0045251.g001 (2012) 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 <./ P>
그림 2. 마우스를 세로 근육에서 분리 된 뉴런과 교세포는 서로 가까이에 성장합니다. 공 촛점 현미경 이미지는 뉴런 (녹색, β-III-튜 블린, Abcam, 토끼, 1:1,000)와 아교를 (빨강, GFAP, Chemicon, 마우스 표시 , 1:500) 쉽게 서로 인접한 성장하고 체외에서 상호 작용을 표시하는. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. 양식 장용 뉴런과 교세포의 전기 생리학. CU에서rrent 클램프 모드, 모든 뉴런 (A)의 전류 주입에 활동 전위가 표시됩니다. 아교는 (B) 활동 전위를 가지고 있지 않지만 전류 주입에 대한 응답으로 큰 electrotonic 잠재력을 표시 않습니다. A & B의 -0.01에서 Na 전류 주입 시작 열한 0.01 nA의 단계에서 0.09 nA의에 증가 프로토콜. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 4. 마우스 회장에서 배양 신경 세포는 electrophysiologically 이질적인 집단이다. 현재 클램프 모드, 활동 전위의 뉴런 결과에 0.09 nA의의 전류 주입합니다. S 뉴런 (A)는 즉시 휴식 막 잠재력에 F로 돌아가자극을 따르게. AH 형 뉴런 (B) 휴식 막 잠재력이 서서히 초기 값으로 반환하기 전에 아래의 기준을 내리는 어떤 자극에 따라 afterhyperpolarization (AHP)을 표시합니다. . 수정 스미스, TH, 외에서 재 인쇄 모르핀은 나트륨 채널의 억제를 통해 장내 신경의 흥분성을 감소 PLoS 하나는 원문.. 10.1371/journal.pone.0045251.g001은 (2012).
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Discussion
사용 동물
이 프로토콜은 스위스 웹스터 마우스에 최적화되어 있습니다. 그러나,이 방법은 쥐와 같은 다른 작은 포유 동물과 생쥐의 다른 변종에 쉽게 적응할 수있다. 우리는 성공적으로 C57 마우스 및 μ-아편 수용체 녹아웃으로 예비 고립감을 수행했습니다. 그러나 생쥐의 다른 변종 GI 기관의 형태 학적 변화로 인해 문제가 될 수있는 것도 가능하다. 또한, 최종 분리의 뉴런의 결과 혼합에 영향을 미칠 수 LMMP 준비 13 일의 신경 회로에서 마우스 변종 사이의 알려진 차이 (대 글루 Balb / C C57BL / 6)가있다. 또한, 연령이 방법을 사용하면 연령과 관련된 신경 세포의 손실은 콜린성 뉴런과 해당 아교 세포에 특정한 myenteric 신경 얼기에서 발생, 고려되어야하며, 14 세 12 개월 빠르면 볼 수 있습니다. 마지막으로, 다른 시험편이 프로토콜을 채택 할 때동물의 ES는주의 myenteric 신경 얼기 오히려 원형 근육에 붙어 남아보다 세로 근육 떨어져 오는 것을 확인해야한다.
사용하는 조직
뉴런과 교세포는이 프로토콜을 사용하여 회장과 대장 모두에서 배양 할 수 있습니다. 회장 고립을 사용할 조직의 큰 금액과 세로 근육이 두꺼운 원형 근육에서 분리되는 용이성으로 인해 쉽게 수행 할 수 있습니다. 두 동물의 최소와 같은 전기 생리학 또는 면역 세포와 같은 응용 프로그램을위한 24 - 웰 플레이트의 12 우물을 차지하기 위해 필요합니다. 대장 물질의 분리가 더 문제입니다. 두꺼운 대장 세로 근육 원형 근육에서 분리하는 것이 더 어렵다. 또한, 기본 원형 근육 눈물이 더 취약하고, 대장 얇다. 최소한 세 동물, 12 나르는를 차지해야합니다 그래서 또한, 대장은 회장보다 훨씬 짧다24 - 웰 플레이트의 LS. 회장 및 결장 수확 같은 동물 별도로 도금,하지만 추가 동물이나 작은 세포 도금 영역의 사용은 대장 격리를 위해 필요합니다 수 있습니다 둘.
세포 배양 기간
전기 생리학 기록은 최적의 문화 2~6일 후 고립 된 뉴런 장내 / 교세포에서 수행되며이 때 세포는 전체 세포 씰을 만들기위한 둥근와 휘기 쉬운, 이상적인 조건입니다. 문화 세포의 주 되신 후에는 아첨 세포가 플레이트에 고착로 시각적으로 차별화. 세포가 더 단단히 플레이트에 장착하면 면역 세포 실험은 가장 많은 세척 단계에서 세포의 손실을 방지하기 위해, 하루에 약 10, 이루어집니다. 마우스를 장내 세포까지 3 주간에 대한 문화를 유지하고 있습니다. 시간이 지남에 따라 수용체와 신경 전달 물질의 발현 패턴이 문화 공부 못하고있다. 신경 세포의 생존에 그러나 이전의 연구전통 기니 돼지 장내 신경 세포와 분리 / 생화학 분화 형태는 뉴런 15 일까지 살아남은까지 다른 동물 소스에서 파생 된 뉴런은 동일한 작업을 수행 할 수 있습니다 것을 제안 삼주 8, 조직 화학적 및 형태 학적 특성의 높은 수준을 유지하는 것으로 나타났습니다 .
세포 수익률
회장에서 분리 할 때이 기법의 세포의 전반적인 수익률은 두 생쥐 24 잘 접시 12 우물이다. myenteric 신경 얼기는 총 창자 벽의 1 % 미만으로 구성으로 이것은 조직의 양에 비해 뉴런의 상대적으로 낮은 숫자입니다. 이 방법의 단점은 얻은 세포의 수를 늘리기 위해 하나의 사용 동물의 수를 증가해야한다는 것입니다. 동물의 숫자가 증가하는 경우, 여러 실험실 구성원 LMMP의 분리의 첫 번째 단계에서 협력하는 것이 좋습니다. 이 마지막 P하기 전에 세포가 분열 상태에있는 시간의 양을 감소쌓이면이 증가 세포 생존.
세포 밀도
기록으로,이 프로토콜은 저밀도 세포의 합류 (- 문화 어느 날 한 후 측정 한 40 % ~ 10)의 회장 격리를 산출하기 위해 두 동물을 사용합니다. 저밀도 세포 도금 최종 문화에 오염의 위험을 줄이기 위해이 방법에 이상적입니다. 단일 세포 전기 생리학을 수행 할 때 또한 유용하다. 세포 수는 더 많은 동물을 사용하거나 최종 도금 지역 만 오염 증가의 위험을 감소 증가 할 수 있습니다. 높은 세포 밀도가 필요한 경우이 문제를 설정, 어느 단계 또는 항생제의 사용 증가를 세척하는 것은 권장합니다 증가합니다.
세포의 이질성
이러한 프로토콜을 사용하여 획득 한 뉴런으로 전기 생리학 특성에 표시된 적어도 두 개의 기능적으로 구별 인구 (그림 3)으로 구성되어 있습니다. 그러나 알려진 많은 종류가 있습니다 기니 돼지 15 동일에있는 특정 신경 화학적 코딩 패턴 뉴런은 아마도 마우스의 사실이다의. 이 셀의 이질성이 방법의 장점과 단점이 모두 있습니다. 다른 사람의 사이에서, 면역 세포 또는 세포 - 세포 상호 작용을 관찰 한 세포 기능 연구를 수행 할 때 세포의 이질성이 도움이됩니다. 문화의 신경 / glia의 상호 작용 (그림 3)을 공부하면 세포의 이질성은 특히 유리할 수있다. 그러나 세포의 이질성은 단백질 발현 등의 변화가 어떤 하나의 셀 유형 또는 신경 세포의 종류에 공헌 할 수있는, immunoblotting을 같은 방법으로 방해합니다. intraganglionic 및 근육 장내 아교 16 일 : 두 개의 아형이 LMMP 준비에 존재하는 표시된대로 아교 세포의 검사는 덜 문제가 될 것입니다. 다른 세포 유형은 또한를 Cajal 또는 섬유 아 세포의 간질 세포로,이 문화에 존재할 수 있습니다.
EP "> 도금 셀이 방법에서는, 세포는 열두 우물에 도금되어 있습니다. 때때로, 이러한 우물 하나 또는 두 개의 분리 후 첫날 오염을 개발할 것입니다. 이 경우, 오염 된 우물에서 슬라이드를 즉시 파기되어 잘은 남은 오염을 죽이기 위해 70 % 에탄올로 세척합니다. 이 프로토콜은 적은 우물 또는 하나의 접시에 분리 된 세포의, 그 결과로 판에 수정할 수 오염의 위험이 증가합니다. 다시, 때 오염 증가, 별도의 세척 단계 나 증가 항생제 사용의 위험을 권장합니다. 프로토콜에 사용되는 항생제 / 항진균 액체 (GIBCO)는 암포 테리 신 B, 스트렙토 마이신과 페니실린으로 구성되어 있습니다. 다른 항생제 조합 또는 증가 된 농도는 세척하고 신경 세포 미디어를 완료 준비하는 동안 오염의 감소를 최적화 할 수 있습니다.
부착 세포
세포에 도금하는coverslips는이 라미닌 및 폴리 - D - 라이신 코팅. 라미닌은 장내 뉴런과 교세포의 생존에 중요하며, 신경 돌기 가지와 신경 발달 17을 장려하고, 같은이 격리에 필수적인 것으로 간주됩니다. 그러나, 오르니 틴이나 리겔, 등, 폴리 - D - 라이신 대안 첨부 요소는 원하는대로 시도 할 수 있습니다.
결론적으로,이 격리는 장내 신경과 학습 기술의 넓은 범위를 위해 적당한 아교의 혼합 문화를 제공합니다. 이 방법은, 마스터 쉽고 저렴, 시간 효율적입니다. 그것은이 셀 모델은 ENS와 관련된 다양한 병리의 이해에 기여할 것으로 우리의 희망입니다.
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Disclosures
저자는 더 큰 경쟁 관심이 없는지 선언합니다.
Acknowledgments
건강 그랜트 DA024009의 국립 연구소, DK046367 및 T32DA007027.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses (12 mm diameter) | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407- 5 mg | |
| 24-well cell culture plate | CELLTREAT | 229124 | May use any brand |
| Laminin | BD Biosciences | 354 232 | |
| ddH2O | Can prepare in lab | ||
| 15 ml Sterile Centrifuge Tube | Greiner Bio-one | 188261 | May use any brand |
| 50 ml Sterile Centrifuge Tube | Greiner Bio-one | 227261 | May use any brand |
| NaCl | Fisher BioReagents | BP358-212 | MW 58.44 |
| KCl | Fisher BioReagents | BP366-500 | MW 74.55 |
| NaH2PO4 .2H2O | Fisher Chemicals | S369-3 | MW137.99 |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506-500G | MW 120.4 |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6014-5KG | MW 84.01 |
| glucose | Fisher Chemicals | D16-1 | MW 180.16 |
| CaCl22H2O | Sigma Aldrich | C5080-500G | MW 147.02 |
| F12 media | Gibco | 11330 | |
| Fetal Bovine Serum | Quality Biological Inc. | 110-001-101HI | May use any brand |
| Antibiotic/antimycotic 100x liquid | Gibco | 15240-062 | |
| Neurobasal A media | Gibco | 10888 | |
| 200 mM L-glutamine | Gibco | 25030164 | |
| Glial Derived Neurotrophic Factor (GDNF) | Neuromics | PR27022 | |
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 8940 | May use any brand |
| Dissecting Tissue Forceps | Fisher Scientific | 13-812-41 | May use any brand |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | May use any brand |
| 250 ml Graduated Glass Beaker | Fisher Scientific | FB-100-250 | May use any brand |
| 2 L Glass Erlenmyer flask | Fisher Scientific | FB-500-2000 | May use any brand |
| Plastic rod (child's paint brush) | Crayola | 05 3516 | May use any brand |
| Carbogen | Airgas | UN 3156 | 5% CO2 |
| 10 ml Leur-lock Syringe | Becton Dickinson | 309604 | May use any brand |
| 21 G x 1 1/2 in. Hypodermic Needle | Becton Dickinson | 305167 | May use any brand |
| Collagenase type 2 | Worthington | LS004174 | |
| Bovine Serum Albumin | American Bioanalytical | AB00440 | |
| 2 ml Microcentrifuge Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 13-864-252 | May use any brand |
| Nitrex Mesh 500 µM | Elko Filtering Co | 100560 | May use any brand |
| Pipette Set | Fisher Scientific | 21-377-328 | May use any brand |
| Sharpeining Stone | Fisher Scientific | NC9681212 | May use any brand |
| Equipment | |||
| LabGard ES 425 Biological Safety Cabinet (cell culture hood) | Nuaire | NU-425-400 | May use any brand |
| 10 L Shaking Waterbath | Edvotek | 5027 | May use any brand |
| Microcentrifuge 5417R | Eppendorf | 5417R | May use a single larger centrifuge with size adapters |
| Allegra 6 Series Centrifuge | Beckman Coulter | 366816 | May use any brand |
| HuluMixer Sample Mixer | Invitrogen | 15920D | |
| AutoFlow Water Jacket CO2 Incubator | Nuiare | NU-4750 | May use any brand |
| Analytical Balance Scale | Mettler Toledo | XS104 | May use any brand |
References
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