Summary
Dimostriamo un protocollo di coltura cellulare per lo studio diretto dei componenti neuronali e gliali del sistema nervoso enterico. Un neurone / cultura mista glia su vetrini è preparato dal plesso mienterico di topo adulto fornendo la possibilità di esaminare singolo neurone e la funzione glia di elettrofisiologia, immunoistochimica,
Abstract
Il sistema nervoso enterico è una vasta rete di neuroni e glia funzionare la lunghezza del tratto gastrointestinale che controlla funzionalmente motilità gastrointestinale. Una procedura per l'isolamento e la coltura di una popolazione mista di neuroni e glia dal plesso mienterico è descritto. Le colture primarie possono essere mantenuti per più di 7 giorni con connessioni di sviluppo tra i neuroni e glia. La striscia di muscolo longitudinale con l'allegata mienterico plesso è spogliato dal muscolo circolare sottostante dell'ileo mouse o del colon e sottoposto a digestione enzimatica. In condizioni di sterilità, l'isolata popolazione neuronale e gliale sono conservati all'interno del seguente centrifugazione pellet e placcato su vetrini. Entro 24-48 ore, si verifica crescita dei neuriti e neuroni può essere identificato da marcatori pan-neuronale. Dopo due giorni di cultura, isolati neuroni potenziali d'azione di fuoco, come osservato da studi di patch clamp. Inoltre, glia enterica può anche essere indicanied di GFAP colorazione. Una rete di neuroni e glia in stretta apposizione forma entro 5 - 7 giorni. Neuroni enterici possono essere individualmente e direttamente studiati utilizzando metodi come l'immunoistochimica, elettrofisiologia, imaging del calcio, e la PCR singola cellula. Inoltre, questa procedura può essere eseguita in animali geneticamente modificati. Questa metodologia è semplice da eseguire e poco costoso. Nel complesso, questo protocollo espone i componenti del sistema nervoso enterico in modo facilmente manipolata in modo da poter meglio scoprire la funzionalità del ENS in stati normali e malattie.
Introduction
Il sistema nervoso enterico (ENS) è vasta rete di nervi e glia che corre per tutta la lunghezza del tratto gastrointestinale (GI). L'ENS controlla funzionalmente tutti gli aspetti della digestione, tra cui la peristalsi, l'assorbimento di liquidi / secrezione, sensazione di stimoli, ecc (per una rassegna vedi 1). Esso contiene oltre 500 milioni di neuroni, più che trovato nel midollo spinale, e contiene ogni classe neurotrasmettitore presente nel cervello. Inoltre, l'ENS è unico in quanto può funzionare senza riflesso input dal sistema nervoso centrale 2. Comprensione della ENS è cruciale, non solo per capire il suo normale ruolo fisiologico, ma per capire il suo coinvolgimento in una varietà di neuropatie che può essere congenito (malattia di Hirschsprung), acquisita (Chagas), secondaria a condizioni di malattia (gastroparesi diabetica), farmaco indotta (sindrome dell'intestino oppiacei), oppure a causa di un infortunio (ileo postoperatorio) 1. Inoltre, i neuroni enterici possono essere un reservoir per infezioni virali (varicella zoster) 3. A causa delle sue somiglianze con il cervello e gli alti livelli di serotonina nell'intestino, i farmaci volti a curare i difetti del sistema nervoso centrale spesso hanno effetti collaterali indesiderati sul ENS 2. Si osserva inoltre che molte neuropatie come il morbo di Alzheimer e morbo di Parkinson mostrano cambiamenti cellulari simili nei neuroni enterici lunghi prima della loro comparsa in neuroni centrali, rendendo l'ENS un modello accessibile per studiare la patogenesi di queste malattie 4. Pertanto, una conoscenza approfondita della ENS è una necessità nel capire gli stati di malattia e la prevenzione / predire gli effetti collaterali farmacologici.
I neuroni del ENS sono stati tradizionalmente studiati nella cavia utilizzando preparati wholemount 5-7 o neuroni in coltura 8. Nonostante la facilità con cui i neuroni possono essere studiate in questo grande animale, questo modello ha molti limiti compresimancanza di ceppi geneticamente modificati, la mancanza di reagenti specifici per questa specie, e l'alto costo associato con l'ordinazione e che ospita questi soggetti. Lo sviluppo di un modello di sistema nervoso enterico murino ha il vantaggio unico di vari sistemi knock out, una vasta gamma di altre metodologie consolidate che possono essere utilizzati in combinazione con la tecnica di coltura cellulare, e la capacità di fornire una convalida per il modello cavia .
L'ENS è contenuto tre plessi che corrono la lunghezza del tratto gastrointestinale: l'esterno myenteric plesso (tra il muscolo longitudinale e circolare) che è principalmente responsabile per le azioni peristaltici dell'intestino, così come la mucosa e della sottomucosa plessi, ( trovato sotto e all'interno della mucosa, rispettivamente) che controlla in gran parte l'assorbimento di liquidi / secrezione e il rilevamento di uno stimolo. Questo metodo inizia con l'isolamento del plesso (LMMP) preparazione muscolare / myenteric longitudinale mediante pelaturalo strato muscolare esterno del tratto GI. Questo riduce drasticamente il problema della contaminazione che sorgono quando lo strato di mucosa è coinvolta nel isolamento. Come risultato, questo processo è ideale per lo studio del controllo della motilità neuronale piuttosto che azioni secretori della ENS.
Il metodo qui presentato risultati in una coltura mista dei neuroni enterici e glia. Almeno due diversi tipi di neuroni sono basate presenti sulle precedenti osservazioni elettrofisiologiche e immunocitochimica 9. La presenza di cellule gliali è estremamente vantaggiosa, in quanto non sono solo un tipo di cellula importante studiare nel loro diritto, ma contribuiscono alla sopravvivenza dei neuroni enterici 10 e di mantenere l'espressione del recettore nativo sulla superficie delle cellule neuronali 11. Inoltre, carenze di glia enterica possono portare ad anomalie della motilità gastrointestinale stati di malattia, coniato 12 'neuro-gliopathies'. Pertanto, la cultura ENS presentata qui risultati in diversi tipi di cellule che sono maturi per le indagini.
I vantaggi di questo metodo sono la facilità di isolamento, i requisiti di strumento poco costoso, e un breve periodo di tempo per padroneggiare la tecnica da parte di personale di laboratorio con esperienza. Limitazioni della metodologia includono bassa resa cella complessiva da elevati volumi di tessuto e l'esclusione dei neuroni dell'ENS di plexi mucosa e sottomucosa. Questa procedura sarà molto vantaggioso per gli studiosi specializzati in elettrofisiologia, immunoistochimica, PCR singola cellula, e altre metodologie.
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Protocol
Tutto cura degli animali e le procedure sperimentali sono stati in conformità con e approvati dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa presso la Virginia Commonwealth University.
1. Preparazione di sterili vetrini poli-D-lisina e laminina-rivestite in piastre da 24 pozzetti
- Tutte le procedure di passaggio 1 sono eseguite in condizioni sterili, sotto cappa, e con reagenti sterili. Vetrini e doppia acqua deionizzata (DDH 2 O) devono essere sterilizzati in anticipo. Preparazione delle lastre può essere fatto fino a due settimane prima dell'isolamento neurone.
- Sotto il cofano, utilizzare pinze sterili per posizionare vetrini autoclave a 12 pozzetti di una piastra a 24 pozzetti.
- Preparare azione poli-D-lisina prima del tempo. Aggiungere 50 ml di ddH2O sterile a 5 mg di poli-D-lisina. Vortex e conservare in 3 ml aliquote a -20 ° C. Scongelare aliquote prima dell'uso.
- Per una concentrazione finale di 1 ml di brodo di poli-D-lisina ogni 25 cm 2: pipetta 80 microlitridi azione poli-D-lisina in cima ad ogni vetrino vetro (2 cm 2). Lasciare riposare la soluzione per 10 minuti.
- Rimuovere poli-D-lisina usando il vuoto e sciacquare coprioggetto 3x con sterile DDH 2 O.
- Lasciare le piastre ad asciugare per almeno 2 ore sotto il cofano.
- Piastre possono essere conservati a 4 ° C o - 20 ° C prima di procedere al rivestimento laminina.
- Preparare laminina magazzino prima del tempo. Scongelare laminina su ghiaccio e tenere in ghiaccio durante l'uso. Diluire ad una concentrazione di 50 ug / ml; prestare attenzione alla concentrazione lot; ogni lotto sarà diverso. A seconda della concentrazione molto, circa 20 ml di DDH 2 O sarà aggiunto ad ogni flacone di laminina. Aliquota (5 ml) e conservare a -80 ° C. Scongelare aliquote sul ghiaccio prima dell'uso.
- Coprioggetto Cappotto con 5 mg / cm 2 laminina; pipetta 200 ml di magazzino laminina su ogni vetrino.
- Incubare soluzione laminina su vetrini per 1 ora.
- Aspirare rimanente soluzione laminina e risciacquare coprioggetto una volta conDDH 2 O. Evitare di raschiare superficie del coprioggetto.
- Conservare le piastre a 4 ° C per un massimo di due settimane.
2. Preparazione anticipo di Neuron Isolation Solutions
- Preparare la soluzione di Krebs (in mM: 118 NaCl, 4.6 KCl, 1.3 NaH 2 PO 4, 1.2 MgSO4, 25 NaHCO 3, 11 di glucosio, e 2,5 CaCl 2). Luogo 13,79 g di NaCl (FW 58.44), 0,686 g di KCl (FW 74.55), 0,312 g NaH 2 PO 4 (FW 120), .289 g MgSO4 (FW 120,4), 4,20 g NaHCO3 (FW 84.01), 3,96 g di glucosio (FW 180,2), e 0,555 g di CaCl 2 (FW 111) in 2 L DDH 2 0. Raffreddare a 4 ° C.
- Preparare sciacquare i media (F12 media con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e antibiotico / antimicotico): Per una bottiglia da 500 ml di F12 media, aggiungere 50 ml di FBS e 5 ml di antibiotico / antimicotica Liquid 100x (Gibco).
- Preparare enterico neurone multimediale (Neurobasal Un supporto con B-27, 2 mM L-glutammina, 1% FBS, 10 ng / ml, Glial Neurotr DerivatoFattore ophic (GDNF), e antibiotica / antimicotica Liquid 100x). Per rendere GDNF magazzino, aggiungere 1 ml ddH2O a 10 mcg GDNF e congelare di nuovo in aliquote di 50 microlitri, conservare a -80 ° C. Per un ml fiala di supporto dei neuroni completi 50, combinare 47,5 ml Neurobasal Un supporto, 1 ml di B-27 (50x), 500 ml di FBS, 500 microlitri 200 mM L-glutammina (Gibco) 50 microlitri magazzino GDNF e 500 microlitri antibiotici / antimicotico Liquid 100x. Supporto è realizzato in piccoli lotti 50 ml per assicurare freschezza di GDNF e per evitare la contaminazione di grandi quantità di questa miscela costosi supporti cella.
3. Harvest longitudinale del muscolo / plesso mienterico (LMMP) Preparazione di topi
- Etici nazionali e istituzionali dovrebbero essere a posto prima di effettuare esperimenti su animali. Adulti svizzeri Webster topi di peso superiore a 25 g (in genere più di 8 settimane di età) sono alloggiati in gruppi di 6 prima di esperimenti. I tessuti di due topi sono utilizzati per l'isolamento dei neuroni enterici ileali e glia e tre topi sono utilizzati perisolamento di cellule del colon.
- Preparare area chirurgica. Raccogliere piccole forbici chirurgiche, pinze angolate, tamponi di cotone, tre bicchieri di vetro 200 ml, e una bacchetta di vetro / plastica (pennello). Assicurarsi che tutte le forniture vengono accuratamente lavati e risciacquati prima di utilizzare per ridurre al minimo la contaminazione. Questa fase può essere eseguita il giorno prima dell'esperimento.
- Collocare soluzione di Krebs su ghiaccio e bolla con carbogeno (95% di ossigeno, 5% CO 2) per almeno 30 minuti per stabilizzare il pH.
- Accendere varie attrezzature e prodotti chimici caldi per stabilizzarsi a temperature desiderate; bagnomaria caldo (s) a 37 ° C, centrifuga raffreddare a 4 ° C, luogo soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) e il 0,5% tripsina a bagnomaria (37 ° C ). Supporti neurone completi e risciacquare media dovrebbero rimanere refrigerato.
- Posto 150 ml di ghiaccio freddo gorgogliare Krebs in tre bicchieri di vetro 200 ml etichettate 'sporco', 'pulito', e 'LMMP'. Coppa Bubble etichettato 'LMMP' con CARBOGEN.
- A seguito di approvazione da parte del comitato etico, eutanasia mouse per dislocazione cervicale o CO 2 asfissia.
- Posizionare il mouse in recumbence dorsale sulla superficie chirurgica, pelle pulita con il 70% EtOH, e sollevare la pelle addominale con pinze. Utilizzando le forbici, cavità addominale aperta e rivelare organi digestivi interni.
- Rimuovere la lunghezza del tratto gastrointestinale sollevando una sezione di ileo e rivelando il suo mesentere. Snip attraverso mesentere con le forbici per rimuovere delicatamente e svelare ileo e colon, facendo attenzione a non tirare dal mesentere dell'ileo / colon.
- Dopo la lunghezza dell'intestino viene dispiegato, rimuovere l'ileo tagliando attraverso l'intestino distale allo stomaco e prossimale al cieco. Nota: questa procedura può anche essere eseguita con tessuto colico rimuovendo il colon da distale a cieco al prossimale l'ano.
- I tessuti possono essere ulteriormente suddivisi tra colon prossimale e distale, e jejenum, e ileo. Il resto di questa procedura farà riferimento all'isolamento dell'ileo; tegli procedura è la stessa per l'isolamento di LMMP colon. Porre l'intero ileo in un contenitore di vetro con ghiaccio freddo Krebs segnato 'sporca'.
- Creare uno strumento per pulire l'ileo, smussato un grosso ago 20 G con una pietra deposito e collegarlo a una grossa siringa (10 ml) contenente ghiaccio freddo Krebs.
- Pulire materia fecale dal ileo sezionando l'ileo in tre o più pezzi di grandi dimensioni. Rimuovere una sezione ileale dal bicchiere e posizionare l'ago smussato nell'estremità di un pezzo ileale.
- Eseguire delicatamente Krebs attraverso la sezione dell'intestino fino a quando tutta la materia fecale è rimosso in un contenitore dei rifiuti. Posizionare la sezione pulita nel contenitore di Krebs marcato 'pulito'. Ripetere fino a quando tutta l'ileo è pulito.
- Per rimuovere il LMMP, tagliare l'ileo in piccoli segmenti, di circa 2-4 cm. Posizionare un segmento di ileo su una bacchetta di vetro o plastica; ileo dovrebbe adattarsi snuggly ma non essere allentato o teso (~ 2 mm). Inizia la rimozione del LMMP rimuovendo delicatamente bit di mesentere ancora attachpostazioni per l'(GI) del tratto gastrointestinale con una pinza. Prevenire il tratto GI di ruotare intorno canna da appuntare delicatamente il tubo per l'asta con il pollice.
- Separare il LMMP dal muscolo circolare sottostante; prima strofinare delicatamente il bordo della pinza lungo l'intera linea in cui è stato attaccato il mesentere, da cima a fondo del segmento, creando delicatamente una lacuna nel muscolo longitudinale. Poi stuzzicare delicatamente via il muscolo longitudinale utilizzando un batuffolo di cotone imbevuto di Krebs.
- Inizia nella parte superiore del gap nel muscolo longitudinale e stuzzicare distanza utilizzando il più leggero tratto orizzontale mentre si applica una pressione molto leggera finché il muscolo longitudinale comincia soltanto a separare dal muscolo circolare; farlo cadere l'intero striscia sul punto di attacco mesentere.
- Poi iniziare delicatamente per aggirare il tubo GI; muovendo dall'alto verso il basso e indietro come il muscolo longitudinale viene lentamente separato dal muscolo circolare tutto intorno al tubo. Al termine, ilLMMP sarà naturalmente venire fuori il resto del tubo GI.
- Posizionare la striscia sottile risultante di muscolo longitudinale nel bicchiere marcato 'LMMP'. Ripetere per tutti i segmenti.
- Dopo che tutte le strisce di LMMP sono state raccolte da un topo, ripetere la procedura per eventuali altri topi utilizzati. Sciacquare bene i bicchieri 'sporchi' e 'pulito' prima del riutilizzo.
- Sciacquare il LMMP 3x per rimuovere la contaminazione biologica. Riempire tre 2 ml provette Eppendorf con ghiaccio freddo Krebs. Mettere le strisce LMMP nella prima provetta e centrifugare per 30 sec a 356 xg in una centrifuga refrigerata a 4 ° C. Rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta e spostare le strisce LMMP al prossimo pulita Krebs tubo pieno. Ripetere questa procedura per ciascun tubo rimanente.
4. Digest LMMP
- Preparare la soluzione digestione ponendo 13 mg collagenasi di tipo 2 e 3 mg in 10 ml BSA carbogeno-gorgogliare soluzione di Krebs.
- Luogo segmenti di LMMP sciacquato in soluzione di digestione e di uso SICsori desiderate ricavare LMMP in piccoli pezzi.
- Digest LMMP per 60 min a 37 ° C in bagno d'acqua con agitatore mentre viene delicatamente gorgogliare carbogeno.
- Dopo la digestione è completa, raccogliere le cellule per centrifugazione per 8 min a 356 xg in centrifuga refrigerata a 4 ° C.
- Da questo punto in avanti tutte le procedure devono essere eseguite in condizioni sterili in una cappa di coltura cellulare! Tutti i reagenti ei contenitori devono essere sterilizzati prima dell'uso.
- Durante la centrifugazione, preparare la soluzione tripsina 0,05% disponendo 1 ml riscaldato 0,25% tripsina e 4 ml di HBSS riscaldato in una provetta sterile da 50 ml di coltura cellulare.
- Dopo la centrifugazione, rimuovere e scartare il surnatante. Non utilizzare un vuoto; questo probabilmente aspirare il pellet cellulare dovuto basse velocità di centrifugazione. Rimuovere con attenzione il pellet e il luogo in provetta pulita con 5 ml di soluzione di tripsina 0,05%.
- Digerire cellule in soluzione tripsina 0,05% a 37 ° C bagnomaria con agitazione per 7 min. Non superare i 7 min di trattamento tripsina totale o neuroni perirà.
- Neutralizzare la tripsina con 10 ml di risciacquo freddo media dopo 7 minuti di trattamento con tripsina.
- Centrifugare le cellule per 8 min a 356 x g. Rimuovere ed eliminare i media.
- Durante la centrifugazione, bilanciare un tratto di rete Nitex sterilizzato in cima ad una provetta sterile 15 ml di coltura cellulare.
- Dopo la centrifugazione, rimuovere e scartare il surnatante. Delicatamente miscela di cellule risospendere triturando in 3 ml mezzi neuroni completi. Evitare la generazione di bolle d'aria durante questa fase e tutti i futuri passi in cui miscela di cellule viene triturato. Tutti Triturazioni dovrebbe essere fatto molto delicatamente. Soluzione cella filtrante attraverso Nitex maglia in clean 15 ml di tubo di coltura cellulare.
- Opzione: cella Cap tubo cultura e luogo in mixer Hula refrigerata (o qualsiasi mixer che fornisce la rotazione) con rollio delicato e ribaltamento per 30 min. Questo passaggio è facoltativo ma consigliato.
- Opzionale: Dopo mixer Hula, aggiungere 2 ml di risciacquo freddo media per lavare le cellule.
- Raccogliere le cellule per centrifugazione (8 min, 356 xg). Rimuovere e scartare il surnatante.
- Risospendere le cellule in 1.200 microlitri mezzi neuroni completi. Triturare le cellule delicatamente usando 1 ml di punta della pipetta di plastica. Non generare bolle d'aria. Pipettare lentamente e delicatamente fino a quando la maggior parte dei pezzi sono interrotte e le cellule sono sospese in un liquido.
- Aggiungere 750 ml di mezzi completi per ciascuno dei 12 pozzetti contenenti un vetrino di vetro pre-rivestito e aggiungere 100 microlitri della soluzione di cellule triturato.
- Incubare neuroni in coltura cellulare incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2.
- Cambiare metà dei mezzi cellulari ogni 2 giorni.
- I neuroni sono pronti per le registrazioni elettrofisiologiche dopo 1-2 giorni di coltura.
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Representative Results
Subito dopo l'isolamento di cellule LMMP-derivati, i neuroni e altri tipi di cellule non sarà immediatamente evidente. Vivente, cellule rotonde di fenotipo indistinto può essere vista come detriti tessuto dai frammenti di tessuto non digeriti e tessuto connettivo. Questo relitto è di alcuna preoccupazione e sarà in gran parte rimossa con la prima variazione media in due giorni. Non tentare di pulire le diapositive prima di questo, come le cellule vitali sani saranno rimossi.
Dopo un giorno di cultura, i neuroni cominciano a mostrare la crescita dei neuriti. Identificazione specifica dei neuroni potrebbe essere ancora indistinta in questo momento. Purché le cellule sono abbastanza aderente di trasferire a una camera sperimentale, saranno pronte per studio elettrofisiologico dopo un giorno di coltura. Tuttavia, le cellule sono più aderenti, dopo due giorni di cultura e ideale per studi di funzione (elettrofisiologia, imaging di calcio) da circa 2 - 5 giorni.
ent "> Caratteristiche morfologiche di neuroni diventano distinti dopo circa una settimana di cultura (Figura 1). caratteristiche immunocyctochemical ideali possono essere identificati dopo una decina di giorni, quando i neuroni mostrano proiezioni a lungo e crescere in maniera quasi 'gangliare' come la moda intervallati con glia ( figura 2). Tale colorazione suggerisce che potrebbe essere possibile studiare le interazioni sinaptici di queste cellule usando questa metodologia.Dopo un giorno di cultura, i neuroni sono riconosciuti per la loro condizione sine qua non e 'la definizione di funzione', il potenziale d'azione (Figura 3). Elettrofisiologicamente, essi possono essere funzionalmente classificati in almeno due tipi di neuroni: i neuroni che contengono un dopo-iperpolarizzazione e aumentate relazioni attuali / densità di sodio e di potassio e neuroni che non hanno un dopo-iperpolarizzazione e significativamente meno sodio e potassio conduttanza (Figura 4). AHP n positivi e negativieurons appaiono correlate a AH e neuroni S visto nel precedente lavoro di guinea, rispettivamente. Neuroni positivi AHP (neuroni AH) avere molteplici proiezioni lunghe provenienti da tutto il corpo cellulare, mentre i neuroni negativi AHP (S neuroni) hanno una lunga proiezione che rami molte volte. Questo, in combinazione con la codifica immunocitochimiche in figura 1, suggerisce che la popolazione neuronale è molto eterogenea.
Figura 1. Caratterizzazione immunoistochimica dei neuroni enterici e glia isolate dal muscolo longitudinale del mouse. Microscopia confocale ha rivelato un neurone-specifico β-III-tubulina (Abcam, coniglio, 1:1000) colorazione in tutto il monte ileale muscolo longitudinale (A) Preparazione del mouse. Cellule isolate da lplesso (LMMP) preparati muscolari / mienterico ongitudinal contengono neuroni (B, β-III-tubulina, Abcam, coniglio, 1:1000) che macchiano positivamente per calbindina (C) (Chemicon, coniglio, 1:1000) e calretinina (D) (Swant, coniglio, 1:2.000). Cellule gliali (E) sono stati visualizzati con la glia-specifico marcatore GFAP (Chemicon, mouse, 1:500). Gli anticorpi sono stati visualizzati mediante degli capra anticorpo secondario Alexa 488 (verdi, Molecular Probes, 1/1.000) 0. Nuclei sono state visualizzate utilizzando Hoescht 33342 (blu, CG, 1 pg / ml). Nessuna colorazione è stato visto quando anticorpo primario è stato omesso (F). . Modificato e ristampato da Smith, TH, et al Morphine Diminuisce enterico Neuron Eccitabilità attraverso l'inibizione dei canali del sodio PLoS One, doi:... 10.1371/journal.pone.0045251.g001 (2012) Clicca qui per ingrandire la figura <./ P>
Figura 2. Neuroni e glia isolate dal muscolo longitudinale topo crescono in stretta vicinanza l'uno all'altro. Microscopia confocale indicano i neuroni (verde, β-III-tubulina, Abcam, coniglio, 1:1000) e glia (rosso, GFAP, Chemicon, topo , 1:500) prontamente crescere adiacenti tra loro e sembrano interagire in vitro. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 3. Elettrofisiologia di neuroni enterici in coltura e glia. Nel cumodalità morsetto rrent, tutti i neuroni (A) appare potenziali d'azione su di iniezione di corrente. Glia (B) non hanno potenziali d'azione, ma vengono visualizzate le grandi potenzialità elettrotoniche in risposta ad iniezione di corrente. Protocolli in una start & B con una iniezione di corrente di -0.01 nA e aumentare a 0.09 nA in undici 0.01 nA passi. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 4. Neuroni coltivati dalla ileo topo sono una popolazione eterogenea electrophysiologically. Nella modalità morsetto corrente, una iniezione di corrente di 0,09 nA in neuroni risultati in potenziali d'azione. S neuroni (A), immediatamente tornare al potenziale di membrana di riposo fopo la stimolazione. AH-tipo di neuroni (B) mostrano un afterhyperpolarization (AHP) dopo stimolazione in cui il potenziale di membrana a riposo scende al di sotto di riferimento prima lentamente tornare al valore iniziale. . Modificato e ristampato da Smith, TH, et al Morphine Diminuisce enterico Neuron Eccitabilità attraverso l'inibizione dei canali del sodio PLoS One, doi:.. 10.1371/journal.pone.0045251.g001 (2012).
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Discussion
Animali utilizzati
Questo protocollo è stato ottimizzato per Swiss Webster topi. Tuttavia, questo metodo è facilmente adattabile ad altri mammiferi di piccole dimensioni quali ratti e ad altri ceppi di topi. Abbiamo effettuato con successo isolamenti preliminari con i topi C57 e del recettore μ-oppioidi knock-out. Tuttavia, è anche possibile che altri ceppi di topi possono essere problematico a causa di variazioni morfologiche nel tratto GI. Inoltre, vi sono differenze note tra ceppi di topi (C57BL / 6 vs Balb / c) nella circuiteria neuronale della preparazione LMMP 13, che può influenzare la conseguente mix di neuroni nel isolamento finale. Ulteriormente, età dovrebbe essere preso in considerazione quando si utilizza questo metodo, come perdite neuronali legati all'età verificano nel plesso mienterico che sono specifici per i neuroni colinergici e loro corrispondenti glia, e può essere osservato a 12 mesi di età 14. Infine, quando adattando questo protocollo ad altre species di animali, occorre prestare attenzione a garantire che il plesso mienterico viene via con il muscolo longitudinale piuttosto che rimanere attaccati al muscolo circolare.
Tessuto Usato
Neuroni e glia possono essere coltivate sia dal ileo e colon mediante questo protocollo. Isolamenti ileali sono più facili da eseguire a causa di una maggiore quantità di tessuto disponibili e la facilità con cui il muscolo longitudinale separa dal muscolo circolare di spessore. Sono necessari almeno due animali per occupare 12 pozzetti della piastra da 24 pozzetti per applicazioni quali elettrofisiologia o immunocitochimica. L'isolamento di materiale colon è più problematico. Il muscolo longitudinale colon spessore è più difficile da separare dal muscolo circolare. Inoltre, il muscolo circolare sottostante è più sottile nel colon, rendendolo più suscettibile alle rotture. Inoltre, il colon è significativamente più breve del ileo così tre animali, come minimo, sono tenuti ad occupare 12 welLS di una piastra da 24 pozzetti. Sia l'ileo e il colon possono essere raccolte e seminate separatamente dallo stesso animale, ma saranno necessari ulteriori animali o l'utilizzo di meno spazio placcatura cellulare per l'isolamento del colon.
Durata di Colture Cellulari
Registrazioni elettrofisiologiche sono eseguite in modo ottimale in isolato neuroni enterici / glia dopo 2-6 giorni di cultura, in questo momento, le cellule sono le condizioni ideali arrotondati e flessibile per fare un sigillo a cellula intera. Dopo una settimana in cellule di coltura diventano più piatta e più visivamente differenziati come le cellule aderiscono alla piastra. Esperimenti di immunocitochimica sono fatto meglio quando le cellule sono più saldamente attaccati alla piastra, intorno al giorno 10, per evitare la perdita delle cellule durante numerose fasi di lavaggio. Cellule enteriche del mouse sono state mantenute in coltura per un massimo di tre settimane. Modelli di recettore e di espressione neurotrasmettitore nel tempo devono ancora essere studiato in queste culture. Tuttavia, precedenti studi sulla sopravvivenza neuronalee biochimici / differenziazione morfologica nei tradizionali cavia enterici isolamenti neuroni hanno scoperto che i neuroni sono sopravvissuti fino a 15 giorni e mantenere un elevato grado di proprietà istochimiche e morfologiche fino a tre settimane 8, il che suggerisce che i neuroni prelevati da altre fonti animali possono fare lo stesso .
Cella Yield
La resa globale di cellule di questa tecnica è di 12 pozzetti di una piastra a 24 pozzetti da due topi quando isolando dall'ileo. Questo è un numero relativamente basso di neuroni rispetto al volume del tessuto, come il plesso mienterico consiste di meno dell'1% della parete intestinale totale. Uno svantaggio di questo metodo è che per aumentare il numero di cellule ottenute, si deve aumentare il numero di animali utilizzati. Quando il numero degli animali sono aumentate, si suggerisce che vari membri laboratorio collaborano nella prima fase del isolamento della LMMP. Questo riduce la quantità di tempo le cellule sono in uno stato interrotto prima finale plante e questo aumenta la sopravvivenza delle cellule.
Cella Densità
Come scritto, questo protocollo utilizza due animali per produrre un isolamento ileale di confluenza cellule a bassa densità (~ 10 - 40% misurata dopo un giorno di coltura). Placcatura cellule a bassa densità è ideale in questa metodologia per ridurre il rischio di contaminazione della coltura finale. E 'utile anche quando viene eseguito elettrofisiologia singola cellula. Numero di cellule può essere aumentata utilizzando più animali o riduzione dell'area di placcatura finale, ma aumenta il rischio di contaminazione. Per controbilanciare questo problema quando sono richieste elevate densità cellulari, sia aumentato il lavaggio passi o il maggiore uso di antibiotici è suggerito.
Cella Eterogeneità
Neuroni acquisiti tramite questi protocolli sono costituiti da almeno due popolazioni funzionalmente distinte, come indicato dalla caratterizzazione elettrofisiologica (Figura 3). Tuttavia, ci sono molti tipi noti di neuroni con specifici modelli di codifica neurochimici trovato nella cavia 15 e lo stesso vale probabilmente il mouse. Questa eterogeneità delle cellule è sia un vantaggio e svantaggio di questo metodo. Cella eterogeneità è utile quando si eseguono studi funzionali monocellulari osservando le interazioni cellula-cellula o in immunocitochimica, tra gli altri. Cella eterogeneità può essere particolarmente vantaggioso quando si studiano interazioni neuroni / glia in coltura (figura 3). Tuttavia, eterogeneità cellulare è un ostacolo alla metodologie come immunoblotting, dove i cambiamenti nell'espressione della proteina, ecc, non possono essere conferite a qualsiasi tipo di cellula o di tipo neurone. Esame della glia sarà meno problematico, in quanto solo due sottotipi siano comprovate nella preparazione LMMP: intragangliari e intramuscolare glia enterica 16. Altri tipi di cellule possono anche essere presenti in questa cultura, come le cellule interstiziali di Cajal o fibroblasti.
ep "> Celle di placcaturaIn questo metodo, le cellule sono placcati in dodici pozzi. Occasionalmente, uno o due di questi pozzi si svilupperà contaminazione nel primo giorno dopo l'isolamento. In questo caso, i vetrini dai pozzi contaminati vengono prontamente eliminati e il pozzo sono risciacquati con il 70% di etanolo per uccidere la contaminazione residua. Questo protocollo può essere modificato per piastra tutte le cellule isolate in minori pozzi o in un piatto unico, e come risultato, il rischio di contaminazione aumenterà. Ancora una volta, quando i rischi di aumento contaminazione, fasi di lavaggio in più o aumento l'uso di antibiotici è suggerito. Il liquido antibiotico / antimicotico (Gibco) utilizzato nel protocollo consiste di amfotericina B, streptomicina e penicillina. Altre combinazioni di antibiotici o da maggiori concentrazioni possono essere utilizzati per ottimizzare la riduzione della contaminazione durante la preparazione del risciacquo e completare supporti neurone.
Cellule allegando
Le cellule sono placcati sucoprioggetto rivestiti con laminina e poli-D-lisina. Laminina è importante per la sopravvivenza dei neuroni enterici e glia, e incoraggia la crescita dei neuriti e lo sviluppo neuronale 17, e, come tale, è considerato essenziale a questo isolamento. Tuttavia, i fattori di attacco alternative ai poli-D-lisina, come l'ornitina o Matrigel, possono essere processati come desiderato.
In conclusione, questo isolamento fornisce una coltura mista dei neuroni enterici e glia adatto per una vasta gamma di tecniche di studio. Questa metodologia è facile da padroneggiare, poco costoso, e il tempo efficiente. La nostra speranza è che questo modello di cellulare contribuirà alla comprensione di diverse patologie associate con l'ENS.
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Disclosures
Gli autori dichiarano che non esistono grandi interessi in competizione.
Acknowledgments
National Institute of Health di Grant DA024009, DK046367 & T32DA007027.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses (12 mm diameter) | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407- 5 mg | |
| 24-well cell culture plate | CELLTREAT | 229124 | May use any brand |
| Laminin | BD Biosciences | 354 232 | |
| ddH2O | Can prepare in lab | ||
| 15 ml Sterile Centrifuge Tube | Greiner Bio-one | 188261 | May use any brand |
| 50 ml Sterile Centrifuge Tube | Greiner Bio-one | 227261 | May use any brand |
| NaCl | Fisher BioReagents | BP358-212 | MW 58.44 |
| KCl | Fisher BioReagents | BP366-500 | MW 74.55 |
| NaH2PO4 .2H2O | Fisher Chemicals | S369-3 | MW137.99 |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506-500G | MW 120.4 |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6014-5KG | MW 84.01 |
| glucose | Fisher Chemicals | D16-1 | MW 180.16 |
| CaCl22H2O | Sigma Aldrich | C5080-500G | MW 147.02 |
| F12 media | Gibco | 11330 | |
| Fetal Bovine Serum | Quality Biological Inc. | 110-001-101HI | May use any brand |
| Antibiotic/antimycotic 100x liquid | Gibco | 15240-062 | |
| Neurobasal A media | Gibco | 10888 | |
| 200 mM L-glutamine | Gibco | 25030164 | |
| Glial Derived Neurotrophic Factor (GDNF) | Neuromics | PR27022 | |
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 8940 | May use any brand |
| Dissecting Tissue Forceps | Fisher Scientific | 13-812-41 | May use any brand |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | May use any brand |
| 250 ml Graduated Glass Beaker | Fisher Scientific | FB-100-250 | May use any brand |
| 2 L Glass Erlenmyer flask | Fisher Scientific | FB-500-2000 | May use any brand |
| Plastic rod (child's paint brush) | Crayola | 05 3516 | May use any brand |
| Carbogen | Airgas | UN 3156 | 5% CO2 |
| 10 ml Leur-lock Syringe | Becton Dickinson | 309604 | May use any brand |
| 21 G x 1 1/2 in. Hypodermic Needle | Becton Dickinson | 305167 | May use any brand |
| Collagenase type 2 | Worthington | LS004174 | |
| Bovine Serum Albumin | American Bioanalytical | AB00440 | |
| 2 ml Microcentrifuge Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 13-864-252 | May use any brand |
| Nitrex Mesh 500 µM | Elko Filtering Co | 100560 | May use any brand |
| Pipette Set | Fisher Scientific | 21-377-328 | May use any brand |
| Sharpeining Stone | Fisher Scientific | NC9681212 | May use any brand |
| Equipment | |||
| LabGard ES 425 Biological Safety Cabinet (cell culture hood) | Nuaire | NU-425-400 | May use any brand |
| 10 L Shaking Waterbath | Edvotek | 5027 | May use any brand |
| Microcentrifuge 5417R | Eppendorf | 5417R | May use a single larger centrifuge with size adapters |
| Allegra 6 Series Centrifuge | Beckman Coulter | 366816 | May use any brand |
| HuluMixer Sample Mixer | Invitrogen | 15920D | |
| AutoFlow Water Jacket CO2 Incubator | Nuiare | NU-4750 | May use any brand |
| Analytical Balance Scale | Mettler Toledo | XS104 | May use any brand |
References
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