Summary
एक पशु मॉडल के रूप में zebrafish के बढ़ते उपयोग यौगिकों और समाधान के ज्ञात मात्रा के वितरण के लिए प्रभावी तरीकों के विकास की आवश्यकता है. नीचे वर्णित नलिका - पोषण प्रक्रिया वयस्क zebrafish को सुरक्षित रूप से और कुशलता से, मज़बूती से समाधान की सटीक मात्रा के मौखिक प्रसव के लिए अनुमति देता है.
Abstract
zebrafish जैव चिकित्सा अनुसंधान में vivo मॉडल में एक महत्वपूर्ण बन गया है. प्रभावी तरीके विकसित और वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए समाधान में यौगिकों या एजेंट देने के लिए उपयोग किया जाना चाहिए. वयस्क zebrafish के लिए मौखिक रूप से यौगिकों के प्रशासन के लिए मौजूदा तरीकों मछली द्वारा स्वैच्छिक खपत में परिवर्तनशीलता के कारण गलत कर रहे हैं. एक नलिका - पोषण प्रक्रिया जैव चिकित्सा अनुसंधान के क्षेत्र में अध्ययन के लिए zebrafish को संक्रामक एजेंटों की सटीक मात्रा में वितरित करने के लिए विकसित किया गया था. उम्र के 6 महीनों में वयस्क zebrafish के 150 मिलीग्राम / एल के साथ anesthetized थे एमएस-222 बफर और एक कट 22 जी सुई की नोक से जुड़ी लचीला कैथेटर आरोपण ट्यूबिंग का उपयोग कर समाधान के 5 μl के साथ gavaged. ट्यूबिंग की नोक गहरे नाले (लगभग 1 सेमी) पिछले बढ़ाया तक लचीला टयूबिंग zebrafish के मौखिक गुहा में उतारा गया. समाधान तो धीरे से आंत्र पथ में इंजेक्ट किया गया था. इस विधि मछली uneventfully उबरने के साथ, समय के 88% प्रभावी था. यहएक व्यक्ति एक घंटे में 20-30 मछली नलिका - पोषण कर सकते हैं प्रक्रिया के रूप में भी कुशल है. इस विधि के ठीक वयस्क zebrafish में संक्रामक रोगों के अध्ययन, या अन्य यौगिकों की पढ़ाई के लिए एजेंट के प्रशासन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Introduction
Zebrafish के लिए मौखिक रूप से यौगिकों के प्रशासन के लिए मौजूदा तरीकों प्रशासन यौगिकों फ़ीड पर शीर्ष में लिपटे, जिलेटिन आहार 1 में मिलाया, नमकीन चिंराट 2 में bioencapsulated, लिपिड समझाया आहार 3, मोम स्प्रे मोती 4 के साथ और लस आधारित आहार के माध्यम से मिलाया शामिल हैं. के 5 सीमाएं मौखिक प्रशासन के इन तरीकों उच्च लीचिंग दरों और व्यक्ति मछली से अधूरा या अप्रत्याशित परिसर खपत में शामिल हैं. संक्रामक रोग के अध्ययन में, मछली को दिलाई संक्रामक खुराक अध्ययन की सफलता के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है जानने क्योंकि ये चर समस्याग्रस्त हैं. इसके अलावा, पिछले काम पानी स्नान में प्रशासित कुछ यौगिकों अध्ययन के तहत हो सकता है कि पेट के प्रभाव होते हैं पहले गहरे नाले zebrafish को विषाक्त घाव कारण है कि दिखाया गया है. 6
नलिका - पोषण एके साथ एक उत्पाद की सटीक मात्रा में प्रशासन के लिए अन्य प्रयोगशाला जानवरों की प्रजातियों में इस्तेमाल एक मानक तरीका हैजैव चिकित्सा और दवा अनुसंधान के क्षेत्र में अध्ययन के लिए nown एकाग्रता. हाल ही में साहित्य में वर्णित किया गया zebrafish gavaging के लिए तरीके हैं. वर्णित एक तकनीक समाधान के 5 μl वितरित करने के लिए एक 2-20 μl विंदुक से जुड़ी एक 24 जी कैथेटर म्यान का उपयोग कर एक दो व्यक्ति विधि है. वर्णित 7 विधि पहले और दूसरे पर एक मृत्यु दर 8.7% की दर और 39% था क्रमशः परीक्षण, मृत्यु का सबसे गर्भवती महिलाओं के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था. दूसरी नलिका - पोषण तकनीक 5 medakas के समाधान के μl (Oryzias latipes). मृत्यु दर पर 8 दी गई जानकारी नहीं किया गया था और नलिका - पोषण वर्णित नहीं किया गया था प्रदर्शन की सही प्रक्रिया के प्रशासन के लिए इस्तेमाल किया कुंद इत्तला दे दी नलिका - पोषण सीरिंज का वर्णन किया. ऊपर मछली के शरीर के वजन के 1% से पशु की देखभाल और प्रयोगशाला Zebrafish, पर कनाडा परिषद के अनुसार नलिका - पोषण के माध्यम से प्रशासित किया जा सकता है. 9,10 हमारा लक्ष्य कॉम की सटीक मात्रा में पहुंचाने का एक repeatable, सुरक्षित और कारगर तरीका विकसित किया गया थापाउंड मौखिक रूप से दोनों लिंगों के वयस्क zebrafish करने और प्रजनन के सभी चरणों में. यह प्रक्रिया एक परिसर की सही मौखिक खुराक की आवश्यकता है, जिसमें किसी भी अध्ययन के लिए लागू होगा.
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Protocol
1. संवेदनाहारी समाधान की तैयारी
- एक शेयर समाधान से या पाउडर के रूप में या तो सिस्टम पानी में 150 मिलीग्राम / एमएस 222 के एल का एक समाधान तैयार है.
- एक पीएच मीटर का उपयोग पीएच की जाँच करें.
- पीएच 7-7.5 के बीच है जब तक सोडियम बाइकार्बोनेट साथ बफर के रूप में की जरूरत है.
- वसूली समय के अंदर ठीक करने के लिए मछली आम तौर पर कम से कम 1 मिनट के लिए एमएस -222 से मुक्त प्रणाली पानी की एक टंकी को तैयार है.
2. नलिका - पोषण तंत्र की तैयारी
- मुंह से मछली के पेट के बल्ब के लिए अनुमानित लंबाई की तुलना में थोड़ा और अधिक स्पष्ट करने के लिए 22 जी आरोपण ट्यूबिंग काटें. प्रारंभ में, हम आवश्यक लंबाई का सबसे अच्छा अनुमान प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा प्रत्येक नए समूह के लिए एक मछली anesthetizing सुझाव है.
- यह सुरक्षित है और detaching का कोई खतरा नहीं है जब तक आधा इंच 22 जी सुई पर कटौती स्पष्ट आरोपण ट्यूबिंग पुश. एक साढ़े 22 सी सुई उपलब्ध नहीं है, तो app करने के लिए एक लंबी सुई कटौतीroximately कि लंबाई.
- जब पूरा, कैथेटर आरोपण ट्यूबिंग 1 सुई की नोक से सेमी, या मछली छोटी हैं तो छोटी के बारे में विस्तार करना चाहिए.
- एक 1 सीसी luerlok सिरिंज के लिए 22 जी सुई हब संलग्न.
3. नलिका - पोषण के लिए तैयारी
- एक स्केलपेल ब्लेड के साथ एक स्पंज में एक नाली में कटौती.
- एमएस -222 से मुक्त प्रणाली पानी में स्पंज भिगोएँ.
- एक फ्लैट सतह पर सिक्त स्पंज रखें.
- 22 जी कैथेटर ट्यूबिंग और एक 1 सीसी सिरिंज में नलिका - पोषण के लिए उपयुक्त 5 μl समाधान ड्रा.
4. संज्ञाहरण और gavage
- फास्ट प्रक्रिया से पहले कम से कम 24 घंटे के लिए मछली.
- यह इसके ठीक पलटा खो देता है, और एक पूंछ पंख चुटकी का जवाब नहीं है, लेकिन opercular आंदोलन का कहना है जब तक एमएस-222 समाधान में मछली रखें. यह आमतौर पर के बारे में 2-3 मिनट लगते हैं.
- संवेदनाहारी समाधान से मछली निकालें और उसमें जगहसिर थोड़ा स्पंज से फैलने के साथ स्पंज में नाली, लेकिन गहरे नाले स्पंज द्वारा कवर किया.
- एक ऊर्ध्वाधर स्थिति में स्पंज ले जाएँ.
- 22 जी कैथेटर टयूबिंग का उपयोग zebrafish के मुंह खोलें.
- टिप गहरे नाले (लगभग 1 सेमी या ट्यूबिंग की लंबाई) अतीत है जब तक धीरे ट्यूबिंग डालें. आरोपण ट्यूबिंग मजबूर करने की आवश्यकता नहीं होनी चाहिए. प्रतिरोध ट्यूब गिल मेहराब या दिल से टकराने जा सकता है.
- प्रतिरोध है, तो धीरे वापस लेने का स्थान बदलने और फिर कोशिश करें.
- धीरे धीरे सामग्री इंजेक्षन.
- इंजेक्शन लगाने जबकि, समाधान गहरे नाले या मुंह के माध्यम से बाहर नहीं करता है सुनिश्चित करें.
- वसूली टैंक में स्पंज और जगह से मछली निकालें.
- वसूली आम तौर पर कम से कम 1 मिनट में होता है और ईमानदार तैराकी और संतुलन बनाए रखने मछली ने संकेत दिया है.
- सक्रिय रूप से मीटर को खदेड़ने मछली visualizing द्वारा के रूप में दिखाया regurgitation के लिए मछली मॉनिटरउसके मुंह, या कोई opercular आंदोलन से aterial.
- वे बरामद किया है एक बार मछली उनके नियमित टैंक को लौट जा सकता है.
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Representative Results
गर्भवती महिलाओं सहित मछली, दोनों लिंगों सफलतापूर्वक (चित्रा 1) gavaged गया. एक सफल प्रक्रिया गहरे नाले या मुंह से बाहर निकलते देखा कोई तरल के साथ कम से कम एक मिनट लगता है. ट्यूबिंग कैथेटर हटाने पर देखा नहीं खून से, बल के बिना, आसानी से प्रवेश करती है. प्रक्रिया लगभग 10 मिनट मछली प्रति 30-45 सेकंड के एक औसत के साथ 3 से 4 मछली नलिका - पोषण करने की आवश्यकता होती है, तेजी से है.
Zebrafish किसी भी समाधान का अधिक से अधिक 5 μl के साथ gavaged नहीं किया जाना चाहिए. 10 μl समाधान के साथ नलिका - पोषण केवल एक 50% सफलता दर (चित्रा 2) में हुई. 10 μl की नलिका - पोषण गर्भवती महिलाओं में भी पूरी तरह से असफल रहा था. इस अध्ययन में, वयस्क मछली 0.2 ग्राम प्रत्येक के एक औसत वजन. CCAC की सिफारिश का उपयोग करना, इस समाधान के 4 μl प्रत्येक मछली को नियंत्रित किया जा सकता है कि इसका मतलब यह होगा. 5 μl के वर्तमान उपयोग इन सिफारिशों के अनुरूप होगा. इस तकनीक को लगभग एक 10% mortalit थाअगले दिन मृत पाए गए जो गर्भवती महिलाओं के लिए ज्यादातर कारण वाई दर. इस मृत्यु दर अन्य सूचना दी नलिका - पोषण तकनीकों की तुलना में काफी कम है जबकि यह अध्ययन उद्देश्यों के लिए आवश्यक है, जब तक कि आदर्श रूप में, मोटे तौर पर गर्भवती महिलाओं gavaged नहीं किया जाना चाहिए.
चित्रा 1. समाधान के 5 μl का उपयोग कर विभिन्न प्रजनन समूहों के बीच प्रतिशत सफलता की तुलना करें. सभी संयुक्त समूह का प्रतिशत सफलता 88% थी. गर्भवती महिलाओं के लिए प्रतिशत सफलता 100% थी, गैर गर्भवती महिलाओं के 90% के लिए और पुरुषों के 82% के लिए.
चित्रा 2. 10 μl बनाम 5 μl का उपयोग करते हुए समग्र प्रतिशत सफलता की तुलना करें. 5 μl का उपयोग कर कुल प्रतिशत सफलता 88% थी. 10 का उपयोग करते हुए कुल प्रतिशत सफलताμl 50% थी.
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Discussion
महत्व
इस तकनीक में एक सुधार है और वयस्क zebrafish gavaging के लिए दो पहले से वर्णित तकनीकों पर कई लाभ प्रदान करता है. सबसे पहले, मछली को नियंत्रित करने के लिए एक स्पंज का उपयोग दो लोगों की आवश्यकता होती है एक पहले से वर्णित तकनीक को विरोध के रूप में एक व्यक्ति, प्रक्रिया का प्रदर्शन करने की अनुमति देता है. 7 दूसरा, कैथेटर आरोपण ट्यूबिंग कारण माध्यमिक आघात को कम करने में मदद कर सकते हैं, चतुर्थ कैथेटर से अधिक लचीला है इसी तरह कुंद इत्तला दे दी सीरिंज का उपयोग करने के छिद्र को. 7,8 तीसरा, एक स्पष्ट ट्यूबिंग का उपयोग करके, समाधान आसानी से मछली में प्रवेश देखे जा सकते हैं. और अंत में, नलिका - पोषण तंत्र में कई मछली gavaged करने की आवश्यकता है जब यह जल्दी से और कुशलता से पुन: उपयोग करने की अनुमति स्थिर है. सामान्य में नलिका - पोषण तकनीक खपत और zebrafish को मौखिक परिसर प्रशासन के अन्य तरीकों में देखा एकाग्रता में भिन्नता को कम कर देता है, और इस तरह के रूप में भी पी करने के लिए आवश्यक मछली की मात्रा को कम कर सकते हैंएक प्रयोग erform. 1-5
गंभीर कदम
यह भी तेजी से सभी zebrafish के एक खाली पेट के बल्ब नहीं एक 12 घंटे के बाद से कम से कम 24 घंटे के लिए तेजी से मछली के लिए महत्वपूर्ण है. 24 घंटा तेज मुंह के माध्यम से ऊर्ध्वनिक्षेप और समाधान के नुकसान को रोकने और एक आंशिक रूप से भरा आंत्र पथ 13 के कारण नाले जाएगा. सबसे आम समस्या तरल ट्यूबिंग आंत्र पथ नीचे काफी दूर तक नहीं डाला गया था, यह दर्शाता है कि, मुंह या गहरे नाले के माध्यम से बाहर निकल रहा है. मुंह या गहरे नाले के माध्यम से बाहर निकलने तरल ट्यूबिंग का सही स्थान का अवलोकन करने के साथ ही गहरे नाले बायपास करने के लिए पर्याप्त लंबाई की एक ट्यूबिंग का उपयोग करके बचा जा सकता है. अधिक गंभीर जटिलताओं गिल आघात, आंतरिक रक्तस्राव, आंतों वेध, ऊर्ध्वनिक्षेप और अचानक मौत शामिल हो सकते हैं. इन जटिलताओं या तुरंत देखा जा सकता है और नहीं. प्रक्रिया पूर्ण होने के बाद मछली नहीं देखा है, जबकि आमतौर पर, अचानक मौत, घंटों होता हैप्रारंभिक वसूली के दौरान rmal.
स्पंज ब्लीच में और फिर पहले मछली के साथ संपर्क में आने के लिए सोडियम thiosulfate समाधान में लथपथ थे. इस मछली के लिए हानिकारक हो सकता है किसी भी एजेंट या रसायनों को हटा दिया. एमएस-222 स्टॉक समाधान प्रकाश से दूर और ऊपर फ्रिज में 5 दिनों के लिए, एक अंधेरे कंटेनर में संग्रहित किया जाना चाहिए. एक भूरे रंग मनाया जाता है प्रभावकारिता कम हो जाता है के रूप में समाधान, त्याग किया जाना चाहिए. 11,12
सीमाएं
इस प्रोटोकॉल की सफलता सुनिश्चित करने के लिए zebrafish के संज्ञाहरण की आवश्यकता होती है. संवेदनाहारी एजेंट मापा जा रहा है अनुसंधान के परिणामों पर एक प्रतिकूल प्रभाव हो सकता है, जहां यह कुछ निश्चित परिस्थितियों में हानिकर हो सकती है. 12 वर्तमान में, संज्ञाहरण की आवश्यकता नहीं है कि zebrafish के लिए कोई नलिका - पोषण प्रोटोकॉल है. 7,8 एमएस-222 संज्ञाहरण के लिए जाना जाता है मापा चर को प्रभावित, अन्य anesthetics इस्तेमाल किया, या आखिरी में से एक हो सकता हैस्वैच्छिक खपत के तरीकों की iously उल्लेख तरीकों का उपयोग किया जा सकता है. 1-5
गर्भवती महिलाओं पर प्रदर्शन किया जब यह तकनीक पहले से वर्णित तकनीकों के साथ के रूप में चुनौती दे रहा है. 7 इस समूह में उच्च मृत्यु दर का एक संभावित कारण शरीर की गुहा में अंडे से विस्थापित किया जा रहा आंत्र पथ के कारण पूति के लिए अग्रणी आंतों वेध हो सकता है. अंडे के साथ ही आंत छिद्रित हैं इसी प्रकार, यदि है, तो एक गंभीर अंडा जुड़े coelomitis भी हो सकती है. इस तरह की घटनाओं gavaging पहले स्पॉन गर्भवती महिलाओं द्वारा कम किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, एक छोटे गेज कैथेटर कार्यविधि को पूरा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
एक छोटे आकार की zebrafish का इस्तेमाल कर रहे हैं तो ध्यान व्यास और लंबाई उनके मुंह और आंत्र पथ में फिट होगा कि इतना ट्यूबिंग और सुई के आकार को समायोजित करने के लिए लिया जाना चाहिए.
प्रक्रिया की दक्षता में आगे बढ़ा जा सकता है अगर एक दूसरे individuaएल संज्ञाहरण की निगरानी और नलिका - पोषण व्यक्तिगत प्रदर्शन के लिए संवेदनाहृत मछली की एक निरंतर आपूर्ति सुनिश्चित करने के लिए थे. इस तकनीक में महारत हासिल करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है और दक्षता हासिल करने के लिए व्यापक अभ्यास की आवश्यकता नहीं है. इसके अतिरिक्त, प्रक्रिया विशेष उपकरण या सुविधाओं की आवश्यकता नहीं है.
मुसीबत शूटिंग
Zebrafish के 2-3 मिनट के भीतर संवेदनाहृत नहीं हो जाते हैं, संवेदनाहारी समाधान बदलने के लिए या एक नया तैयार स्टॉक समाधान का उपयोग करें. ट्यूबिंग zebrafish के आंत्र पथ नीचे आसानी से स्लाइड नहीं करता है, छोटे व्यास ट्यूबिंग इस्तेमाल किया जाना चाहिए. यह सही व्यास और लंबाई ट्यूबिंग के रूप में भी दिलाई मात्रा zebrafish के आकार के लिए उपयुक्त है कि क्या मूल्यांकन करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए इसी तरह के आकार की मछलियों की एक छोटी संख्या का उपयोग अभ्यास के लिए फायदेमंद हो सकता है. ट्यूबिंग भी मछली का उपयोग किया जा रहा है के आकार के लिए आदर्श प्रवेश गहराई नोट करने के लिए चिह्नित किया जा सकता है.
इस तकनीक में महारत हासिल हो जाने के बाद, यह विभिन्न अनुसंधान प्रोटोकॉल के लिए यह उपयोगी बनाने, कुशलता और लगातार वयस्क zebrafish के लिए विभिन्न यौगिकों या संक्रामक एजेंटों की एक सटीक राशि देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस तकनीक को भी प्रयोगों प्रदर्शन करने की जरूरत मछली की संख्या कम से कम, और मछली पर विभिन्न यौगिकों के प्रभाव के सटीक समय मापन अनुमति दे सकता है.
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Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.
Acknowledgments
रॉकफेलर विश्वविद्यालय के तुलनात्मक बायोसाइंस केंद्र इस परियोजना के लिए सहायता प्रदान की. हम तकनीकी सहायता के लिए Janelle Monnas धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| A sponge | |||
| 1-cc luer lock syringe | Becton Dickinson Co | ||
| 22-G Micro-Renathane Implantation tubing (cut) | Braintree Scientific, Inc. | ||
| 1 22-G needle (cut, if needed) | Becton Dickinson Co | ||
| pH meter | Hanna probe | ||
| 1 scalpel blade | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| MS-222 (Finquel) | Argent Laboratories | ||
References
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