Summary
동물 모델로 제브라 피쉬의 사용 증가 화합물 및 솔루션의 알려진 양의 전달을위한 효과적인 방법의 개발이 필요합니다. 아래에 설명 된 위관 절차는 성인 zebrafish의를 안전하고 효율적으로, 안정적으로 솔루션 정확한 양의 경구 제공 할 수 있습니다.
Abstract
제브라 피쉬는 생물 의학 연구에서 생체 내 모델에서 중요 해지고있다. 효과적인 방법이 개발 및 과학 연구를위한 솔루션 화합물 또는 대리인을 제공하기 위해 활용해야합니다. 성인 zebrafish의 구두로 화합물을 관리하기위한 현재의 방법은 물고기의 자발적 소비의 변화로 인해 부정확합니다. 위관 절차는 생물 의학 연구에 연구 제브라하는 병원체의 정확한 양을 제공하기 위해 개발되었다. 생후 6 개월 성인 제브라 피쉬는 150 ㎎ / L로 마취 MS-222을 버퍼링 컷 22-G 바늘 팁에 부착 된 유연한 카테터 주입 튜브를 사용하여 용액 5 μL와 gavaged. 튜브의 끝이 아가미 (약 1cm)을지나 연장까지 유연한 튜브는 제브라 피쉬의 구강으로 낮아졌다. 이 솔루션은 천천히 창자에 주입 하였다. 이 방법은 물고기가 평온 무사하게 회복과 함께, 시간의 88 % 효과가 있었다. 이한 사람이 한 시간 20-30 물고기를 투여 수있는 절차도 효율적입니다. 이 방법은 정확하게 성인 zebrafish에있는 전염성 질병 연구, 또는 다른 화합물의 연구에 에이전트를 관리하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
제브라 피쉬에 구두 화합물을 관리하기위한 현재의 방법은 관리 화합물 공급 위에 상단 코팅, 젤라틴 다이어트 1로 혼합, 소금물 새우 2에 bioencapsulated, 지질 캡슐 다이어트 3, 왁스 스프레이 구슬 4에 글루텐 기반의 다이어트를 통해 혼합 (가) 있습니다. 5 제한 경구 투여의 방법들은 높은 침출 속도와 각 물고기에 의해 불완전하거나 예측할 수없는 복합 소비를 이용하실 수 있습니다. 전염성 질병 연구에, 물고기에 투여 감염 복용량 연구의 성공을위한 중요한 수 있습니다 알고 있기 때문에 이러한 변수는 문제가 있습니다. 또한, 전작 수조에 투여 특정 화합물은 연구 중에있을 수 있습니다 창자 효과가 발생하기 전에 아가미를 제브라 피쉬에 독성 병변을 일으킬 것으로 나타났습니다. 6
위관 알래스카와 제품의 정확한 수량을 관리하는 다른 실험실 동물 종에 사용되는 표준 방법입니다생물 의학 및 제약 연구에 연구를위한 nown 농도. 최근에 문헌에 기술 된 제브라 피쉬를 gavaging하는 방법이 있습니다. 설명 하나의 기술 솔루션의 5 μL를 전달하기 위해 2-20 μL 피펫에 부착 된 24 G 카테터 칼집을 사용하여 두 사람 방법입니다. 설명 7 방법은 첫 번째와 두 번째의 사망률 8.7 %의 속도와 39 %를했다 각각 재판, 사망의 대부분은 임신하는 여성에 기인 하였다. 두 번째 투여 기술은 5 medakas에 대한 솔루션의 μL (Oryzias의 latipes). 사망률 8 정보가 제공되지 않았으며 투여 설명되지 않았습니다 수행하는 정확한 과정을 관리하는 데 사용 무딘 팁 투여 주사기를 설명했다. 위로 물고기의 체중의 1 % 동물 관리 및 실험실 제브라 피쉬에 캐나다위원회에 따르면, 위관을 통해 관리 할 수 있습니다. 9,10 우리의 목표는 COM 정확한 양을 전달하는 반복, 안전하고 효율적인 방법을 개발하는 것이 었습니다파운드 구두 남녀 성인 제브라 피쉬에와 재생의 모든 단계합니다. 이 절차는 화합물의 정확한 경구 투여가 요구되는 모든 연구에 적용 할 수있다.
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Protocol
1. 마취 용액을 제조
- 원액이나 분말 형태에서 하나의 시스템 물 150 ㎎ / MS-222 L의 용액을 준비합니다.
- 산도 측정기를 사용하여 pH를 확인합니다.
- pH가 7-7.5 사이까지 중탄산 나트륨 버퍼가 필요.
- 복구 시간을 안으로 복구하는 물고기는 일반적으로보다 1 분입니다에 대한 MS-222에서 무료로 시스템 물 탱크를 준비합니다.
2. 투여 장치를 준비
- 입에서 물고기의 장 전구에 대략 길이보다 조금 더에 분명 22-G 주입 튜브를 잘라. 처음에는, 우리는 필요한 길이에 대한 최선의 추정치를 얻을하는 데 사용되는 각 새 그룹에 대해 하나의 물고기를 마취하는 것이 좋습니다.
- 그것은 안전하고 분리의 위험이 없을 때까지 ½ 인치 22-G 바늘 위에 컷 명확한 주입 튜브를 밀어 넣습니다. ½ 22-C 바늘을 사용할 수없는 경우, 응용 프로그램에 더 이상 바늘을 잘라roximately 그 길이입니다.
- 완료되면, 카테터 주입 튜브 1 바늘의 끝에서 cm, 또는 물고기가 작은 경우 짧은 대해 확장해야합니다.
- 1-CC luerlok 주사기에 22 G 바늘 허브를 연결합니다.
3. 위관을위한 준비
- 메스 블레이드와 스폰지로 홈을 잘라.
- MS-222에서 무료로 시스템 물에 스폰지를 적시십시오.
- 평평한 표면에 적신 스폰지를 놓습니다.
- 22 G 카테터 튜브와 1-CC 주사기로 투여에 해당하는 5 μL 솔루션을 그립니다.
4. 마취 투여
- 빠른 절차를하기 전에 적어도 24 시간 동안 물고기.
- 그것의 바로 잡기 반사를 잃고, 그리고 꼬리 지느러미 핀치에 응답하지 않지만, 아가미의 움직임을 유지 할 때까지 MS-222 솔루션에있는 물고기를 놓습니다. 이는 일반적으로 약 2-3 분 걸립니다.
- 마취 용액에서 물고기를 제거하고에 배치머리를 약간 스폰지에서 튀어 나온 스폰지의 홈하지만, 아가미 스폰지에 의해 덮여.
- 수직 위치에 스폰지를 이동합니다.
- 22 G 카테터 튜브를 사용하여 제브라 피쉬의 입을 엽니 다.
- 팁 아가미 (약 cm 또는 튜브의 길이) 과거 때까지 부드럽게 튜브를 삽입합니다. 주입 튜브 강제 할 필요는 없습니다. 저항 튜브 아가미 아치 또는 심장을 타격 할 수 있습니다 제안합니다.
- 저항이있을 경우, 부드럽게, 철회 위치를 변경하고 다시 시도하십시오.
- 천천히 물질을 주입.
- 주입하는 동안 솔루션은 아가미 나 입을 통해 종료되지 않습니다 있는지 확인하십시오.
- 복구 탱크로 스폰지 곳에서 물고기를 제거합니다.
- 복구는 일반적으로 이하 1 분에 발생 똑바로 수영과 균형을 유지 물고기로 표시됩니다.
- 적극적으로 M 추방 물고기를 시각화하여 그림과 같이 역류에 대한 물고기를 모니터링입하거나, 아가미 운동에서 aterial.
- 그들이 회복되면 물고기들은 정기적으로 탱크로 반환 할 수 있습니다.
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Representative Results
임신하는 여성을 포함한 물고기의 남녀가 성공적으로 (그림 1) gavaged 하였다. 성공적인 절차는 아가미 나 구강을 종료 볼 수없는 액체를 분 미만 소요됩니다. 튜브 카테터 제거에 볼 수없는 피, 힘없이 쉽게 들어갑니다. 이 절차는 약 10 분 물고기 당 30 ~ 45 초, 평균 3-4 물고기를 투여 할 필요 빠르다.
제브라 피쉬는 모든 솔루션의 5 μL로 gavaged 할 수 없습니다. 10 μL 솔루션 위관은 50 %의 성공률 (그림 2)의 결과. 10 μL의 투여가 임신하는 여성도 완전 실패했습니다. 본 연구에서는 성인 물고기 0.2g을 각각의 평균 무게. CCAC의 권고하여,이 솔루션의 4 μL 각 물고기에 투여 할 수 있다는 것을 의미한다. 5 μL의 현재 사용은 이러한 권장 사항에 부합 될 것이다. 이 기술은 약 10 % mortalit했다다음날 시체로 발견 된 임신하는 여성에 주로 기인 Y 속도. 이 사망률 기타보고 된 투여 방법보다 훨씬 낮은하면서 연구 목적으로 필요한 경우가 아니면, 이상적으로, 조잡한 임신하는 여성은 gavaged 할 수 없습니다.
그림 1. 용액 5 μL를 사용하여 다른 생식 그룹 사이의 퍼센트 성공의 비교. 결합 된 모든 그룹 %의 성공은 88 %였다. 임신하는 여성을위한 %의 성공은 100 %이었다; 비 임신하는 여성 90 %를 위해와 남성 82 %합니다.
그림 2. 10 μL 대 5 μL를 사용하여 전체 %의 성공의 비교. 5 μL를 사용하여 총 %의 성공은 88 %였다. 10를 사용하여 총 %의 성공μL 50 %였다.
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Discussion
의미
이 기술은 개선 성인 제브라 피쉬를 gavaging에 대한 두 가지 이전에 설명한 기술에 비해 몇 가지 장점을 제공합니다. 첫째, 물고기를 억제하는 스폰지의 사용은 두 사람이 필요로 설명한 기술을 반대 한 사람이 절차를 수행 할 수 있습니다. 7 둘째, 카테터 주입 튜브 인해 차 외상을 최소화 할 수있는 IV 카테터보다 더 유연 유사 무딘 팁 주사기를 사용하여 천공한다. 7,8 셋째, 명확한 튜브를 사용하여 솔루션을 쉽게 물고기를 입력 시각화 할 수 있습니다. 그리고 마지막으로, 투여 장치는 많은 물고기가 gavaged해야 할 때 신속하고 효율적으로 재사용 할 수 있도록 안정적입니다. 일반적으로 투여 기술은 소비와 제브라 피쉬에 경구 화합물 관리의 다른 방법에서 볼 수 농도 변화를 감소시키고, 같은도 P에 필요한 물고기의 양을 줄일 수 있습니다실험을 erform. 1-5
중요한 단계
그것은 또한 빠른 모든 제브라 피쉬가 빈 장 전구가없는 12 시간으로 이후 최소 24 시간 동안 빠른 물고기 중요합니다. 24 시간 빠른 입으로 역류하고 솔루션의 손실을 방지하고 부분적으로 채워진 장관 13에 의한 아가미 것입니다. 가장 일반적인 문제는 액체가 튜브는 창자 아래까지 충분히 삽입되지 않았 음을 나타내는 입이나 아가미를 통해 종료된다. 입이나 아가미를 통해 나오는 액체가 튜브의 정확한 위치를 관찰뿐만 아니라 아가미를 통과하기에 충분한 길이의 튜브를 사용하여 피할 수 있습니다. 더 심각한 합병증은 아가미 외상, 내부 출혈, 장 천공, 역류와 갑작스런 죽음을 포함 할 수 있습니다. 이러한 합병증 또는 즉시 관찰되지 않을 수도 있습니다. 절차가 완료되면 물고기가 더 보았다 동안 일반적으로, 갑작스런 죽음은, 시간이 발생하지초기 복구 중에 rmal.
스폰지 표백제하고 사전에 생선과 접촉에 티오 황산나트륨 용액에 담가 하였다. 이 물고기에 유해한되었을 수있는 대리인 또는 화학 물질을 제거했습니다. MS-222 원액이 멀리 빛으로부터 이상 냉장고에 5 일을 위해, 어두운 용기에 보관해야합니다. 갈색 색조가 관찰되면 효과가 감소되는 솔루션은 폐기해야합니다. 11,12가
제한
이 프로토콜은 성공을 위해 제브라 피쉬의 마취가 필요 없습니다. 마취 에이전트가 측정되는 연구 결과에 부정적인 영향을 미칠 수있는 곳 특정 상황에서 불리 할 수 있습니다. 12 현재, 마취가 필요하지 않습니다 제브라 피쉬에 대한 투여 프로토콜이 없습니다. 7,8 MS-222 마취로 알려진 경우 측정 변수에 영향을 미치는 다른 마취제를 사용하거나 이전 중 하나가 될 수 있습니다자발적인 소비 방법 iously 언급 한 방법을 활용할 수 있습니다. 1-5
임신하는 여성을 수행 할 때이 기술은 이전에 설명한 기법으로 도전이다. 7이 그룹에서 높은 사망률의 원인은 체강에 계란 전치 장관에 의한 패혈증으로 이어지는 장 천공 수 있습니다. 계란뿐만 아니라 소장 천공하는 경우 마찬가지로, 다음, 급성 달걀 연관된 coelomitis가 발생할 수 있습니다. 이러한 이벤트는 gavaging 전에 산란 임신하는 여성을 최소화 할 수 있습니다. 또한, 작은 게이지 카테터 절차를 수행하는 데 사용할 수 있습니다.
작은 크기의 제브라 피쉬를 사용하는 경우주의가 직경 및 길이가 자신의 입과 창자에 맞지 않도록 튜브와 바늘의 크기를 조정하기 위해주의해야한다.
절차의 효율성은 더욱 증가 될 수있는 경우 두 번째 individua난 마취를 모니터링하고 위관을 수행하는 개인에게 마취 물고기의 지속적인 공급을 보장했다. 이 기술은 마스터 비교적 간단하고 능력을 얻기 위해 광범위한 연습을 필요로하지 않습니다. 또한, 절차는 전문 장비 또는 설비가 필요하지 않습니다.
문제 해결
제브라 피쉬의 2 ~ 3 분 내에 마취가되지 않는 경우, 마취 용액을 변경하거나 갓 준비된 재고 솔루션을 사용합니다. 튜브는 제브라 피쉬의 창자 아래로 쉽게 미끄러하지 않는 경우, 작은 직경의 튜브를 사용하여야한다. 그것은 정확한 직경 및 길이 튜브뿐만 아니라 관리 볼륨 제브라 피쉬의 크기에 적합한 지 여부를 평가하는을 보장하기 위해 비슷한 크기의 물고기의 작은 번호를 사용하여 연습에 도움이 될 수 있습니다. 튜브는 물고기가 활용되는 크기에 최적의 침투 깊이를 참고하도록 표시 할 수 있습니다.
이 기술을 마스터하면, 그것은 다양한 연구 프로토콜에 대한 유용하고, 효율적이고 지속적으로 성인 zebrafish의 다양한 화합물 또는 전염성 요원의 정확한 양을 제공 할 수 있습니다. 이 기술은 또한 실험을 수행하는 데 필요한 물고기의 수를 최소화하고, 물고기에 대한 다양한 화합물의 효과를 정확한 시간 측정을 허용 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
록펠러 대학 비교 생명 과학 센터는이 프로젝트에 대한 지원을 제공했습니다. 우리는 기술 지원을 쟈넬 Monnas 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| A sponge | |||
| 1-cc luer lock syringe | Becton Dickinson Co | ||
| 22-G Micro-Renathane Implantation tubing (cut) | Braintree Scientific, Inc. | ||
| 1 22-G needle (cut, if needed) | Becton Dickinson Co | ||
| pH meter | Hanna probe | ||
| 1 scalpel blade | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| MS-222 (Finquel) | Argent Laboratories | ||
References
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