Summary
L'utilisation croissante de poisson zèbre comme modèle animal nécessite le développement de méthodes efficaces pour la livraison de quantités connues de composés et des solutions. La procédure décrite ci-dessous permet de gavage pour l'administration orale de volumes précis de solution fiable, sûre et efficace pour le poisson zèbre adulte.
Abstract
Le poisson zèbre est devenu un important modèle in vivo pour la recherche biomédicale. Des méthodes efficaces doivent être développées et utilisées pour délivrer des composés ou des agents dans les solutions pour la recherche scientifique. Les méthodes actuelles d'administration de composés oralement au poisson zèbre adultes sont inexacts en raison de la variabilité de la consommation volontaire par les poissons. Une procédure gavage a été développé pour fournir des quantités précises d'agents infectieux à poisson-zèbre pour l'étude dans la recherche biomédicale. Poisson zèbre adulte de plus de 6 mois ont été anesthésiés avec 150 mg / L de tampon MS-222 et gavées avec 5 pi de solution en utilisant un tube de l'implantation par cathéter flexible attaché à une coupe de pointe de l'aiguille de 22 G. Le tube flexible a été abaissé dans la cavité buccale du poisson zèbre jusqu'à ce que la pointe du tube étendue au-delà des branchies (environ 1 cm). La solution a ensuite été injecté lentement dans le tractus intestinal. Cette méthode a été efficace 88% du temps, avec des poissons récupération sans incident. Cetteprocédé est également efficace comme une personne peut gavage 20-30 poisson en une heure. Cette méthode peut être utilisée pour administrer précisément agents infectieux pour les études sur les maladies, ou des études d'autres composés chez le poisson zèbre adulte.
Introduction
Les méthodes actuelles d'administration de composés oralement au poisson zèbre comprennent des composés qui administrent top couché sur alimentation, mélangés à la ration de gélatine 1, bioencapsulated dans de la saumure de crevettes 2, mélangés avec lipidiques régimes encapsulées 3, cire perles de pulvérisation 4 et via des régimes à base de gluten. 5 Limites de ces modes d'administration par voie orale comprennent les taux de lessivage élevés et la consommation incomplète ou imprévisible composé de poisson. Ces variables sont problématiques parce que dans les études sur les maladies infectieuses, sachant la dose infectieuse administré au poisson peut être critique pour le succès de l'étude. En outre, des travaux antérieurs ont montré que certains composés administrés dans des bains d'eau causent lésion toxique pour les poisson-zèbre branchies avant que les effets intestinaux qui peuvent être à l'étude se produisent. 6
Gavage est une méthode standard utilisée pour d'autres espèces d'animaux de laboratoire à administrer des quantités précises d'un produit avec akconcentration de nown pour l'étude de la recherche biomédicale et pharmaceutique. C'est seulement récemment que des méthodes de gavage poisson zèbre été décrits dans la littérature. Une technique décrite est une méthode de deux personnes à l'aide d'une gaine de cathéter 24 G attaché à une pipette ul 2-20 de livrer 5 pi de solution. 7 La méthode décrite a eu un taux de mortalité de 8,7% et de 39% sur le premier et le second procès, respectivement, plus de la mortalité a été attribuée à des femelles gravides. La seconde technique gavage décrit les seringues usagées gavage épointées à administrer 5 pi de solution à medakas (Oryzias latipes). 8 Information sur la mortalité n'a pas été fourni et le processus exact d'effectuer le gavage n'a pas été décrite. Selon le Conseil canadien de protection des animaux et le poisson zèbre laboratoire, jusqu'à 1% du poids du corps du poisson peut être administré par gavage. 9,10 Notre objectif était de développer une méthode reproductible, sûre et efficace de livrer des volumes précis de comlivres par voie orale pour le poisson zèbre adulte des deux sexes et à tous les stades de la reproduction. Cette procédure serait applicable pour toute étude dans laquelle l'administration orale d'un composé précis est nécessaire.
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Protocol
1. Préparation de la solution anesthésique
- Préparer une solution de 150 mg / L de MS-222 dans de l'eau du système soit à partir d'une solution mère ou de la forme pulvérulente.
- Vérifier le pH à l'aide d'un pH-mètre.
- Tampon avec du bicarbonate de sodium que nécessaire jusqu'à ce que le pH est compris entre 7-7,5.
- Préparer un réservoir d'eau de système libre de MS-222 pour le poisson à récupérer po Le temps de récupération est généralement inférieur à 1 min.
2. Préparation de l'appareil Gavage
- Couper le 22-G implantation tuyau transparent à un peu plus de longueur approximative de la bouche à l'ampoule intestinal des poissons. Initialement, nous vous suggérons d'anesthésier un poisson pour chaque nouveau groupe étant utilisée pour obtenir la meilleure estimation de la longueur nécessaire.
- Poussez le tuyau d'implantation claire coupée sur la ½ pouces 22-G aiguille jusqu'à ce qu'il soit sûr et il n'ya aucun risque de détachement. Si un 22-C ½ aiguille n'est pas disponible, couper une aiguille plus longue pour appenvi ron cette longueur.
- Une fois terminé, le tube de l'implantation du cathéter doit dépasser environ 1 cm de la pointe de l'aiguille, ou moins si le poisson est plus petit.
- Fixez le moyeu de l'aiguille 22 G pour un luerlok seringue de 1 cc.
3. Préparation pour Gavage
- Coupez une rainure dans une éponge avec une lame de scalpel.
- Tremper l'éponge dans l'eau du système libre de MS-222.
- Placez l'éponge humide sur une surface plane.
- Dresser la solution ul appropriée 5 pour gavage dans le tube de cathéter 22-G et une seringue de 1 cc.
4. Anesthésie et Gavage
- Rapide du poisson pendant au moins 24 heures avant la procédure.
- Placer le poisson dans la solution MS-222 jusqu'à ce qu'il perde son réflexe de redressement, et ne répond pas à une fin pincement de la queue, mais maintient mouvement operculaire. Cela prend habituellement environ 2-3 min.
- Retirer le poisson de la solution anesthésique et le placer dansla rainure dans l'éponge avec la tête légèrement en saillie à partir de l'éponge, mais les ouïes couvertes par l'éponge.
- Déplacer l'éponge dans une position verticale.
- Ouvrir la bouche du poisson zèbre en utilisant le tube de cathéter 22-G.
- Insérez délicatement le tube jusqu'à ce que la pointe est passé des branchies (environ 1 cm ou la longueur de la tubulure). Le tube d'implantation devrait pas avoir besoin d'être forcé. Résistance suggère le tube peut être frapper la voûte maillants ou de coeur.
- En cas de résistance, retirer doucement, repositionner et essayer à nouveau.
- Injecter le matériau lentement.
- Alors que l'injection, assurez-vous que la solution ne se termine pas par les branchies ou la bouche.
- Retirer le poisson de l'éponge et le placer dans le bac de récupération.
- La guérison se fait généralement en moins de 1 min et est indiqué par le poisson qui nage debout et maintenir l'équilibre.
- Surveiller poisson pour régurgitation comme indiqué en visualisant le poisson expulsant activement material de sa bouche, ou pas de mouvement operculaire.
- Les poissons peuvent être renvoyés dans leur réservoir ordinaire une fois qu'ils ont récupéré.
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Representative Results
Les deux sexes de poissons, y compris les femelles gravides ont été gavés avec succès (Figure 1). Une procédure succès prend moins d'une minute sans liquide vu sortant des ouïes ou la bouche. Le tube pénètre facilement, sans force, sans artérielle observée lors du retrait du cathéter. La procédure est rapide, ce qui nécessite environ 10 min de gavage de 3 à 4 poissons, avec une moyenne de 30-45 secondes par poisson.
Le poisson zèbre ne doit pas être par gavage avec plus de 5 pi d'une solution. Gavage avec 10 solutions ul n'a entraîné qu'un taux de réussite de 50% (figure 2). Gavage de 10 ul a été également complètement échoué dans les femelles gravides. Dans cette étude, le poisson adulte pèse en moyenne de 0,2 g chacun. Utilisation de la recommandation de la CCAC, cela signifierait que 4 pi de solution pourrait être administré à chaque poisson. L'utilisation actuelle de 5 pi serait conforme à ces recommandations. Cette technique avait environ une mortalit de 10%taux principalement attribuable à des femelles gravides qui ont été retrouvés morts le lendemain y. Bien que ce taux de mortalité est significativement plus faible que les autres techniques de gavage rapportés, idéalement, les femelles gravides grossièrement ne doivent pas être gavés si cela est nécessaire aux fins de l'étude.
Figure 1. Comparaison de la réussite pour cent entre les différents groupes de la reproduction à l'aide de 5 pi de solution. Le succès de pour cent de tous les groupes confondus, était de 88%. Le succès de pour cent pour les femelles gravides a été de 100%, pour les femelles non gravides 90% pour les hommes et 82%.
Figure 2. Comparaison de succès global de pour cent en utilisant 5 pi par rapport à 10 pl. La réussite totale de pour cent en utilisant 5 pi était de 88%. La réussite totale de 10 pour cent à l'aideul était de 50%.
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Discussion
Importance
Cette technique est une amélioration et offre plusieurs avantages par rapport aux deux techniques décrites précédemment pour gavage poisson zèbre adulte. Tout d'abord, l'utilisation d'une éponge pour retenir le poisson permet à une personne d'effectuer la procédure, par opposition à une technique décrite précédemment nécessitant deux personnes. 7 Deuxièmement, les tubes de l'implantation par cathéter est plus souple que cathéters intraveineux, ce qui peut aider à minimiser le traumatisme secondaire dû à la perforation de manière similaire à l'aide de seringues à bout mousse. 7,8 Troisièmement, en utilisant un tuyau transparent, la solution peut facilement être visualisé entrer dans le poisson. Et enfin, l'appareil gavage est stable lui permettant d'être réutilisé rapidement et efficacement lorsque de nombreux poissons ont besoin d'être gavées. La technique de gavage en général réduit la variation de la consommation et de la concentration observé dans d'autres modes d'administration composé oral de poisson zèbre, et en tant que telle peut également réduire la quantité de poisson nécessaire pour perform une expérience. 1-5
Étapes critiques
Il est également important de jeûner le poisson pendant au moins 24 heures depuis 12 heures avec un rapide pas tout poisson zèbre ont une ampoule intestinal vide. Le jeûne de 24 heures permettra d'éviter les régurgitations et la perte de la solution par la bouche et les branchies en raison d'un tractus intestinal partiellement complète 13. Le problème le plus fréquent est liquide sortant par la bouche ou les branchies, ce qui indique que le tube n'a pas été inséré assez loin dans le tractus intestinal. Le liquide sortant par la bouche ou les branchies peut être évité en observant le positionnement correct du tube ainsi que l'aide d'un tuyau d'une longueur suffisante pour contourner les branchies. Des complications plus graves peuvent inclure des branchies traumatismes, hémorragies internes, perforation intestinale, la régurgitation et de mort subite. Ces complications peuvent ou ne peuvent pas être observées directement. Typiquement, la mort subite survient heures après la procédure est terminée, tandis que les poissons ne semblait pasrmal lors de la récupération initiale.
Les éponges ont été trempées dans l'eau de Javel, puis dans une solution de thiosulfate de sodium avant d'entrer en contact avec le poisson. Cette enlevé tous les agents ou de produits chimiques qui peuvent avoir été néfaste pour les poissons. La solution mère MS-222 doit être stocké dans un récipient sombre, à l'abri de la lumière et pour un maximum de 5 jours dans le réfrigérateur. Si une teinte brunâtre on observe la solution doit être jeté, car l'efficacité est réduite. 11,12
Limitations
Ce protocole ne nécessite l'anesthésie du poisson-zèbre pour assurer le succès. Cela peut être un inconvénient dans certaines circonstances où l'agent anesthésique peut avoir un effet négatif sur les résultats de la recherche sont mesurées. 12 Actuellement, il n'existe pas de protocole gavage pour le poisson zèbre qui ne nécessite pas d'anesthésie. 7,8 Si MS-222 anesthésie est connu pour affecter des variables mesurées, d'autres anesthésiques peuvent être utilisés, ou l'un des prevméthodes de modes de consommation volontaires iously mentionnés peuvent être utilisés. 1-5
Cette technique, comme avec les techniques décrites précédemment est difficile lorsqu'il est effectué sur les femelles gravides. 7 Une cause possible de mortalité élevée dans ce groupe peut être une perforation intestinale conduisant à une septicémie due à l'intestin étant déplacés par les oeufs dans le coelome. De même, si les oeufs ainsi que les intestins sont perforés, puis un coelomitis associée aux œufs aiguë peut également se produire. De tels événements peuvent être minimisés par la ponte des femelles gravides avant de gavage. En variante, un cathéter de calibre inférieur peut être utilisée pour effectuer la procédure.
Si le poisson zèbre de plus petite taille sont utilisés précautions doivent être prises pour régler la taille du tube et l'aiguille de sorte que le diamètre et la longueur s'intégrera dans leur bouche et du tractus intestinal.
L'efficacité de la procédure peut encore être augmentée si un second individual était de surveiller l'anesthésie et d'assurer un approvisionnement constant de poisson anesthésié à la personne effectuant le gavage. Cette technique est relativement facile à maîtriser et ne nécessite pas une pratique à acquérir la maîtrise. En outre, la procédure ne nécessite pas d'équipement spécialisé ou installations.
Dépannage
Si le poisson zèbre ne deviennent pas anesthésiés à l'intérieur 2-3 min, changer la solution anesthésique ou utiliser une solution mère fraîchement préparée. Si le tube ne glisse pas facilement vers le bas du tube digestif du poisson-zèbre, un tube de diamètre plus petit doit être utilisé. Il peut être avantageux de pratiquer l'aide d'un petit nombre de poissons de taille similaire afin d'assurer le bon diamètre et la longueur de la tubulure ainsi que d'évaluer si le volume administré est approprié pour la taille du poisson zèbre. Le tube peut aussi être marqué de noter la profondeur de pénétration idéal pour la taille des poissons étant utilisé.
Une fois que cette technique est maîtrisée, elle peut être utilisée pour délivrer une quantité précise de divers composés ou des agents infectieux de poisson zèbre adulte efficace et cohérente, ce qui est utile pour divers protocoles de recherche. Cette technique peut également réduire le nombre de poissons nécessaire pour réaliser des expériences, et de permettre des mesures de temps précises des effets de divers composés sur le poisson.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Le Centre universitaire de Bioscience comparatif Rockefeller apporté son soutien à ce projet. Nous remercions Monnas Janelle pour l'assistance technique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| A sponge | |||
| 1-cc luer lock syringe | Becton Dickinson Co | ||
| 22-G Micro-Renathane Implantation tubing (cut) | Braintree Scientific, Inc. | ||
| 1 22-G needle (cut, if needed) | Becton Dickinson Co | ||
| pH meter | Hanna probe | ||
| 1 scalpel blade | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| MS-222 (Finquel) | Argent Laboratories | ||
References
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