Summary
تزايد استخدام الزرد كنموذج للحيوانات يتطلب تطوير أساليب فعالة لإيصال كميات من المركبات المعروفة والحلول. الإجراء التغذية الأنبوبية هو موضح أدناه يسمح للتسليم عن طريق الفم كميات دقيقة من حل موثوق، بأمان وكفاءة إلى الزرد الكبار.
Abstract
أصبح الزرد هاما في نموذج الجسم الحي في البحوث الطبية الحيوية. يجب تطوير أساليب فعالة واستخدامها لتسليم المركبات أو وكلاء في حلول للأبحاث العلمية. الأساليب الحالية لإدارة المركبات عن طريق الفم لالزرد الكبار غير دقيقة بسبب التباين في استهلاك التبرعات التي يديرها الأسماك. وقد وضعت إجراء التغذية الأنبوبية لتسليم كميات الدقيق للعوامل المعدية إلى الزرد للدراسة في البحوث الطبية الحيوية. كانت الزرد الكبار أكثر من 6 أشهر من العمر تخدير مع 150 ملغ / لتر من مخزنة MS-222 وgavaged مع 5 ميكرولتر من الحل باستخدام القسطرة أنابيب مرنة غرس تعلق على خفض 22-G طرف الإبرة. تم تخفيض أنابيب مرنة في تجويف الفم من الزرد حتى غيض من أنابيب تمديد الماضية الخياشيم (1 سم تقريبا). ثم تم حقن المحلول ببطء في الأمعاء. وكانت هذه طريقة فعالة 88٪ من الوقت، مع الأسماك تتعافى بشكل هادئ. هذاالإجراء هو أيضا فعالة مثل شخص واحد يمكن تسمين الأسماك 20-30 في ساعة واحدة. هذه الطريقة يمكن استخدامها لإدارة بدقة وكلاء لدراسات الأمراض المعدية، أو دراسات من المركبات الأخرى في الزرد الكبار.
Introduction
الأساليب الحالية لإدارة المركبات عن طريق الفم لالزرد تشمل المركبات بالإدارة أعلى المغلفة على الأعلاف، ومختلطة في الوجبات الغذائية الجيلاتين 1، bioencapsulated في محلول ملحي الروبيان 2، ويخلط مع دهن حمية مغلفة 3، 4 حبات رذاذ الشمع وعبر النظم الغذائية القائمة على الغلوتين. 5 من القيود وتشمل هذه الأساليب من تناوله عن طريق الفم معدلات الرشح عالية وغير مكتملة أو لا يمكن التنبؤ بها استهلاك مركب من قبل الأسماك الفردية. هذه المتغيرات هي إشكالية لأنه في دراسات الأمراض المعدية، ومعرفة الجرعة المعدية تدار على الأسماك قد تكون حاسمة لنجاح الدراسة. أيضا، وقد أظهرت الأعمال السابقة أن بعض المركبات تدار في حمامات المياه تسبب آفة سامة للاسماك الزرد الخياشيم قبل الآثار المعوية التي قد تكون قيد الدراسة تحدث 6.
التغذية الأنبوبية هو أسلوب القياسية المستخدمة في أنواع الحيوانات المختبرية الأخرى لإدارة كميات الدقيق للمنتج مع حزب العدالة والتنميةتركيز nown للدراسة في البحوث الطبية الحيوية والمستحضرات الصيدلانية. في الآونة الأخيرة فقط طرق gavaging الزرد وصفت في الأدب. أسلوب واحد هو موضح هو أسلوب من شخصين باستخدام غمد القسطرة 24 G تعلق على ماصة ميكرولتر 2-20 لتقديم 5 ميكرولتر من الحل. 7 وصف الأسلوب كان معدل الوفيات من 8.7٪ و 39٪ على الأولى والثانية ويعزى معظم الوفيات للإناث حامل؛ المحاكمة، على التوالي. وصف تقنية التغذية الأنبوبية الثانية تستخدم المحاقن أنبوب تغذية حادة ذات الرؤوس لإدارة 5 ميكرولتر من الحل لmedakas (latipes Oryzias). لم يتم توفير 8 معلومات عن وفيات وهذه العملية الدقيقة للأداء بالتزقيم لم يكن وصفها. ويمكن وفقا للالمجلس الكندي للرعاية الحيوان واسماك الزرد مختبر، وتصل إلى 1٪ من وزن جسم السمكة أن تدار من خلال أنبوب تغذية. 9،10 هدفنا هو تطوير طريقة للتكرار، آمنة وفعالة لإيصال كميات دقيقة من COMجنيه شفويا إلى الزرد الكبار من كلا الجنسين وفي جميع مراحل الاستنساخ. سيكون هذا الإجراء تكون قابلة للتطبيق لأية دراسة التي تتطلب جرعات عن طريق الفم دقيقة من مركب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الحل مخدر
- يعد حل من 150 ملغ / لتر من MS-222 في المياه النظام إما من محلول المخزون أو من شكل مسحوق.
- التحقق من الرقم الهيدروجيني باستخدام مقياس درجة الحموضة.
- العازلة مع بيكربونات الصوديوم في حاجة، وحتى درجة الحموضة ما بين 7-7.5.
- إعداد خزان المياه نظام حر من MS-222 للأسماك لاسترداد فيها والانتعاش مرة هو عادة أقل من 1 دقيقة.
2. إعداد جهاز بالتزقيم
- خفض واضح 22-G أنابيب غرس إلى ما يزيد قليلا على طول تقريبي من الفم إلى الأمعاء لمبة من الأسماك. في البداية، نقترح التخدير السمك واحد لكل مجموعة جديدة تستخدم للحصول على أفضل تقديرا للمدة اللازمة.
- دفع واضحة المعالم أنابيب زرع على بوصة ½ 22-G الإبرة حتى أنها آمنة وليس هناك خطر من فصل. إذا كان ½ 22-C إبرة غير متوفرة، وقطع إبرة أطول لالتطبيقroximately أن طول.
- عندما كاملة، وينبغي أن الأنبوب زرع القسطرة تمتد حوالي 1 سم من رأس الإبرة، أو أقصر إذا كانت الأسماك هي أصغر.
- تعلق المحور إبرة 22-G إلى 1-CC luerlok حقنة.
3. التحضير لبالتزقيم
- خفض أخدود إلى اسفنجة بشفرة المشرط.
- نقع الاسفنجة في الماء نظام حر من MS-222.
- وضع قطعة إسفنج مبللة على سطح مستو.
- وضع ال 5 ميكرولتر حل مناسب لأنبوب تغذية في أنابيب القسطرة 22-G وحقنة 1-CC.
4. التخدير وبالتزقيم
- سريع السمك لا يقل عن 24 ساعة قبل الإجراء.
- ضع السمك في حل MS-222 حتى أنه يفقد المنعكس المقوم لها، ولا يستجيب لقرصة زعنفة الذيل، ولكن يحافظ على حركة صادي. وهذا يستغرق عادة حوالي 2-3 دقائق.
- إزالة الأسماك من حل مخدر ووضعه فيالأخدود في الاسفنجة مع رئيس جاحظ قليلا من الاسفنج، ولكن الخياشيم تغطيها الاسفنجة.
- تحرك الاسفنجة في وضع رأسي.
- فتح فم الزرد باستخدام أنابيب القسطرة 22-G.
- إدراج بلطف الأنبوب حتى غيض الماضي الخياشيم (حوالي 1 سم أو طول الأنبوب). يجب أن لا تحتاج إلى غرس أنابيب يضطر. يوحي مقاومة الأنبوب قد يكون ضرب قوس الخيشومية أو القلب.
- إذا هناك مقاومة، سحب بلطف، وإعادة المحاولة مرة أخرى.
- حقن المواد ببطء.
- بينما بالحقن، وتأكد من أن الحل لا خروج عن طريق الخياشيم أو الفم.
- إزالة الأسماك من الاسفنج ومكان في خزان الانتعاش.
- انتعاش يحدث عادة في أقل من 1 دقيقة ويتبين من الأسماك السباحة تستقيم والحفاظ على التوازن.
- رصد الأسماك لقلس كما هو مبين من خلال وضع تصور الأسماك طرد بنشاط مaterial من فمه، أو أي حركة صادي.
- يمكن إرجاع السمك إلى دبابتهم العادية بعد أن يكونوا قد تعافى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم gavaged كلا الجنسين من الأسماك، بما في ذلك الإناث حامل بنجاح (الشكل 1). إجراء ناجحة يستغرق أقل من دقيقة واحدة مع عدم وجود السائل ينظر تخرج من الخياشيم أو الفم. الأنبوب يدخل بسهولة، دون استخدام القوة، مع عدم وجود الدم ينظر على إزالة القسطرة. هذا الإجراء هو السريع، والتي تتطلب حوالي 10 دقيقة للتسمين 3-4 الأسماك، بمتوسط 30-45 ثانية لكل الأسماك.
الزرد لا ينبغي أن gavaged مع أكثر من 5 ميكرولتر من أي حل. أدت التغذية الأنبوبية مع 10 ميكرولتر الحلول إلا في نسبة النجاح 50٪ (الشكل 2). كان التزقيم من 10 ميكرولتر أيضا غير ناجحة تماما في الإناث حامل. في هذه الدراسة، وزن الأسماك البالغة في المتوسط 0.2 غرام لكل منهما. باستخدام توصية CCAC، وهذا من شأنه أن يعني أن 4 ميكرولتر من الحل يمكن أن تدار على كل سمكة. إن الاستخدام الحالي لل5 ميكرولتر تكون متسقة مع هذه التوصيات. وكان هذا الأسلوب ما يقرب من 10٪ mortalitمعدل تعزى في معظمها إلى الإناث حامل التي تم العثور عليه مقتولا في اليوم التالي ذ. بينما معدل وفيات هذا هو أقل بكثير من غيرها من تقنيات التغذية الأنبوبية وذكرت، من الناحية المثالية، ينبغي ألا gavaged الإناث بشكل صارخ حامل إلا عند الضرورة لأغراض الدراسة.
الشكل 1. وكان النجاح في المئة من جميع الفئات مجتمعة مقارنة للنجاح في المئة بين الجماعات الإنجابية المختلفة باستخدام 5 ميكرولتر من محلول 88٪. كان النجاح في المئة للإناث حامل 100٪؛ للإناث غير حامل 90٪ للذكور و 82٪.
الشكل 2. وبلغ مجموع النجاح في المئة باستخدام 5 ميكرولتر مقارنة النجاح الشامل في المئة باستخدام 5 ميكرولتر مقابل 10 ميكرولتر 88٪. مجموع النجاح في المئة باستخدام 10كان ميكرولتر 50٪.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أهمية
هذه التقنية هو تحسين ويوفر مزايا عديدة أكثر من الأساليب المذكورة سابقا لgavaging الزرد الكبار. أولا، استخدام اسفنجة لكبح الأسماك يسمح شخص واحد لتنفيذ الإجراء، بدلا من تقنية هو موضح سابقا تتطلب شخصين. 7 الثانية، القسطرة أنابيب الزرع هو أكثر مرونة من القسطرة الرابع، والتي يمكن أن تساعد في تقليل الصدمات الثانوية بسبب لانثقاب بالمثل لاستخدام الحقن غير حادة ذات الرؤوس. 7،8 الثالث، باستخدام أنابيب واضحة، يمكن أن يكون الحل بسهولة تصور دخول الأسماك. وأخيرا، وجهاز التغذية الأنبوبية مستقرة والسماح لها لإعادة استخدامها بسرعة وكفاءة عندما تحتاج العديد من الأسماك إلى أن gavaged. تقنية التغذية الأنبوبية بشكل عام يقلل من التباين في استهلاك وتركيز ينظر في أساليب أخرى لإدارة المجمع عن طريق الفم لالزرد، وعلى هذا النحو يمكن أيضا تقليل كمية من الأسماك اللازمة لPerform تجربة. 1-5
الخطوات الحاسمة
من المهم أن تصوم الأسماك لمدة 24 ساعة على الأقل منذ 12 ساعة مع بسرعة ليس كل الزرد ديك لمبة الأمعاء الفارغة أيضا. سوف HR بسرعة 24 منع قلس وخسارة من الحل عن طريق الفم والخياشيم بسبب الأمعاء كامل جزئيا 13. المشكلة الأكثر شيوعا هو السائل الخروج عن طريق الفم أو الخياشيم، مشيرا إلى أن الأنبوب لم يتم إدراج بعيدا بما فيه الكفاية لأسفل الأمعاء. السائل الخروج عن طريق الفم أو الخياشيم يمكن تجنبها من خلال مراقبة موضع الصحيح من الأنبوب وكذلك باستخدام أنابيب من طول كافية لتجاوز الخياشيم. قد تشمل المضاعفات أكثر شدة الصدمة الخيشومية، ونزيف داخلي، انثقاب الأمعاء، قلس والموت المفاجئ. قد أو قد لا تراعى هذه المضاعفات فورا. عادة، والموت المفاجئ يحدث ساعة بعد الانتهاء من الإجراء، في حين بدا الأسماك لاrmal خلال الانتعاش الأولي.
كانت غارقة الإسفنج في التبييض ومن ثم في محلول ثيوكبريتات الصوديوم قبل ملامسة الأسماك. هذا إزالة أي وكلاء أو المواد الكيميائية التي قد تكون ضارة للأسماك. ينبغي تخزين MS-222 محلول المخزون في وعاء مظلم، بعيدا عن الضوء ولمدة تصل إلى 5 أيام في الثلاجة. إذا لوحظ صبغة اللون البني ويجب التخلص من الحل، كما يتم تقليل فعالية. 11،12
القيود
هذا البروتوكول لا يتطلب التخدير من الزرد لضمان النجاح. قد يكون هذا غير ملائم في ظروف معينة حيث قد يكون عامل مخدر له أثر سلبي على نتائج البحوث التي يجري قياسها 12 حاليا، لا يوجد أي بروتوكول التغذية الأنبوبية لمدة الزرد التي لا تتطلب التخدير. 7،8 إذا كان من المعروف MS-222 التخدير إلى تؤثر المتغيرات المقاسة، يمكن استخدام التخدير الأخرى، أو واحد من السابقويمكن استخدام الأساليب المذكورة iously من طرق الاستهلاك الطوعي. 1-5
هذه التقنية، كما هو الحال مع الأساليب الموصوفة سابقا هي صعبة عندما أجريت على إناث حامل 7 قد يكون السبب المحتمل لارتفاع معدل الوفيات في هذه المجموعة انثقاب الأمعاء مما يؤدي إلى تعفن الدم ويرجع ذلك إلى الأمعاء يتم شردهم البيض في الجوف العام. وبالمثل، إذا كان البيض وكذلك الأمعاء هي مثقوبة، ثم قد تحدث أيضا الحاد coelomitis البيض المرتبطة بها. ويمكن التقليل من مثل هذه الأحداث من قبل وضع البيض للإناث حامل قبل gavaging. بدلا من ذلك، يمكن استخدام القسطرة قياس أصغر لتنفيذ الإجراء.
إذا تم استخدام الزرد من حجم أصغر وينبغي الحرص على ضبط حجم الأنبوب والإبرة بحيث وطول قطرها سوف تدخل في أفواههم والأمعاء.
كفاءة الإجراء يمكن زاد إذا كان individua الثاني كانت ل لرصد التخدير وضمان امدادات ثابتة من الأسماك تخدير للفرد أداء أنبوب تغذية. هذا الأسلوب هو السهل نسبيا لإتقان و لا يتطلب ممارسة واسعة النطاق لاكتساب الكفاءة. بالإضافة إلى ذلك، فإن الإجراء لا يتطلب معدات أو مرافق متخصصة.
حل المشاكل
إذا كان الزرد لا تصبح تخدير في غضون 2-3 دقائق، تغيير الحل مخدر أو استخدام محلول المخزون الطازجة. إذا الأنبوب لا ينزلق بسهولة إلى أسفل الأمعاء من الزرد، يجب استخدام أنابيب قطرها أصغر. قد يكون من المفيد لممارسة باستخدام عدد قليل من الأسماك ذات الحجم المماثل من أجل ضمان القطر الصحيح وطول الأنبوب وكذلك لتقييم ما إذا كان حجم تدار من المناسب لحجم الزرد ل. ويمكن أيضا أن تكون وضعت أنابيب لاحظ عمق الاختراق مثالية لحجم الأسماك التي يجري استخدامها.
> الخاتمة
بمجرد يتقن هذه التقنية، ويمكن استخدامه لتقديم كمية محددة من المركبات المختلفة أو العوامل المعدية إلى الزرد الكبار بكفاءة وباستمرار، مما يجعلها مفيدة لبروتوكولات البحوث المختلفة. قد يكون هذا الأسلوب أيضا تقليل عدد الأسماك اللازمة لإجراء تجارب، وتسمح قياسات زمنية دقيقة لآثار مركبات مختلفة على الأسماك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
قدمت جامعة المقارن مركز روكفلر العلوم البيولوجية الدعم لهذا المشروع. نشكر Monnas جانيل للحصول على المساعدة الفنية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| A sponge | |||
| 1-cc luer lock syringe | Becton Dickinson Co | ||
| 22-G Micro-Renathane Implantation tubing (cut) | Braintree Scientific, Inc. | ||
| 1 22-G needle (cut, if needed) | Becton Dickinson Co | ||
| pH meter | Hanna probe | ||
| 1 scalpel blade | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| MS-222 (Finquel) | Argent Laboratories | ||
References
- Royes, J. -A. B., Chapman, F. Preparing Your Own Fish Feeds. , Department of Fisheries and Aquatic Sciences, Florida Cooperative Extension Service, Insitute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida. (2009).
- Gomez-Gil, B., Cabanillas-Ramos, J., Paez-Brambila, A., Roque, A. Standardization of the bioencapsulation of enrofloxacin and oxytetracycline in Artemia fransciscana Kellogg. Aquaculture. 196, 1-12 (1906).
- Langdon, C. Microparticle types for delivering nutrients to marine fish larvae. Aquaculture. 227, 259-275 (2003).
- Langdon, C., Nordgreen, A., Hawkyard, M., Hamre, K. Evaluation of wax spray beads for delivery of low-molecular weight, water soluble nutrients and antibiotics to Artemia. Aquaculture. 284, 151-158 (2008).
- Zang, L., Morikane, D., Shimada, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. A Novel Protocol for the Oral Administration of Test Chemicals to Adult Zebrafish. Zebrafish. 8, 203-210 (2011).
- Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think Small: Zebrafish as a Model System of Human pathology. Journal of Biomedicine and Biotechnology. , (2012).
- Tysnes, K. R., Jorgensen, A., Poppe, T., Midtlyng, P. J., Robertson, L. J. Preliminary expermients on use of zebrafish as a laboratory model for Giardia duodenalis infection. Acta Parasitologica. 57, 1-6 (2012).
- Marie, B., Huet, H., et al. Effects of a toxic cyanobacterial bloom (Planktothris agardhii) on fish: Insights from histopathological and quantitative proteomic assessments following the oral exposure of medaka fish (Oryzias latipes). Aquatic Toxicology. 114-115, 39-48 (2012).
- Canadian Council on Animal Care. CCAC guidelines on: the care and use of fish in research, teaching and testing. , CCAC. Ottawa, Ontario, Canada. (2005).
- Harper, C., Lawrence, C. The Laboratory Zebrafish. , CRC Press. Boca Raton, Florida, USA. (2011).
- De Tolla, L. J., Srinivas, S., et al. Guidelines for the Care and Use of Fish in Research. ILAR Journal. 37 (4), (1995).
- Topic Popovic, N., Strunjak-Perovic, I., et al. Tricaine methane-sulfonate (MS-222) application in fish anaesthesia. Journal of Applied Ichthyology. 28, 553-564 (2012).
- Field, H. A., Kelley, K. A., Martell, L., Goldstein, A. M., Serluca, F. C. Analysis of gastrointestinal physiology using a novel intestinal transit assay in zebrafish. Neurogastroenterology & Motility. 21, 304-312 (2009).
