Summary
Den økende bruk av zebrafisk som en dyremodell krever utvikling av effektive metoder for levering av kjente mengder av nevnte forbindelser og oppløsninger. Den gavage prosedyren beskrevet nedenfor gir mulighet for oral levering av presise volumer av løsningen pålitelig, sikkert og effektivt til voksen sebrafisk.
Abstract
Den zebrafisk har blitt en viktig in vivo modell i biomedisinsk forskning. Effektive metoder må utvikles og utnyttes til å levere forbindelser eller agenter på løsninger for vitenskapelig forskning. Gjeldende metoder for administrering av forbindelser oralt til voksne zebrafisk er unøyaktig på grunn av variasjon i frivillige konsum av fisken. En sonde prosedyren ble utviklet for å levere presise mengder av smittestoffer til sebrafisk for studier i biomedisinsk forskning. Voksen zebrafisk over 6 måneders alder ble bedøvd med 150 mg / L av bufret MS-222 og gavaged med 5 pl av løsningen ved hjelp av fleksible kateter implantasjon slange festet til et kutt 22-G nålespissen. Den fleksible slangen ble senket ned i munnhulen av zebrafisk til spissen av produksjonsrøret forlenget forbi gjellene (ca. 1 cm). Løsningen ble deretter sprøytet sakte inn i tarmkanalen. Denne metoden var effektiv på 88% av tiden, med fisk utvinne uneventfully. DetteFremgangsmåten er også effektiv som en person kan magesonde 20-30 fisk i en time. Denne metoden kan benyttes for å administrere midler for smittsomme sykdommer studier, eller forstadier av andre forbindelser i voksen zebrafisk.
Introduction
Aktuelle metoder for administrering av forbindelser muntlig til sebrafisk inkludere administrering av forbindelser topp-belagt på fôr, blandet inn i gelatin dietter 1, bioencapsulated inn saltlake reker 2, blandet med lipid innkapslede dietter tre, voks spray perler fire og via gluten-baserte dietter. 5 Begrensninger disse metodene for oral administrasjon inkluderer høy utvasking priser og ufullstendige eller uforutsigbar sammensatte forbruk av hver enkelt fisk. Disse variablene er problematisk fordi i smittsomme sykdommer studier, vel vitende om infeksiøs dose gis til fisken kan være kritisk for studier suksess. Også har tidligere arbeid vist at visse forbindelser administreres i vannbad forårsake giftig lesjon til sebrafisk gjellene før de påvirker tarmen som kan være under studien oppstå. 6
Gavage er en standard metode som brukes i andre laboratorie dyrearter å administrere nøyaktige mengder av et produkt med aknown konsentrasjon for studier i biomedisinsk og farmasøytisk forskning. Bare nylig har metoder for gavaging sebrafisk blitt beskrevet i litteraturen. En teknikk som er beskrevet er en to-person med anvendelse av et 24-G kateter kappe festet til en 2-20 ul pipette for å levere 5 ul oppløsning. 7. Fremgangsmåten beskrevet hadde en dødelighet på 8,7% og 39% på den første og andre rettssaken, henholdsvis, og mesteparten av dødelighet ble tilskrevet drektige tisper. Den andre gavage teknikken beskrevet brukt stump-tipped tilførsel med sonde sprøyter for å administrere 5 ul oppløsning til medakas (Oryzias latipes). 8 Informasjon om dødeligheten ikke ble levert og nøyaktige prosessen for å utføre gavage ble ikke beskrevet. Ifølge den kanadiske Council on Animal Care og Laboratory Sebrafisk, opp til 1% av fiskens kroppsvekt kan administreres via sonde. 9,10 Vårt mål var å utvikle en repeterbare, sikker og effektiv metode for å levere presise mengder compounds muntlig til voksen sebrafisk av begge kjønn og i alle stadier av reproduksjon. Denne fremgangsmåten vil kunne anvendes for en hvilken som helst studie hvor nøyaktig oral dosering av en forbindelse er nødvendig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Klargjøre Bedøvelse Solution
- Tilbered en oppløsning av 150 mg / L av MS-222 i systemet vann enten fra en stamløsning eller fra pulverisert form.
- Kontroller pH ved hjelp av et pH-meter.
- Buffer med natriumbikarbonat etter behov inntil pH-verdien ligger mellom 7-7,5.
- Forbered en tank av system vann gratis fra MS-222 for fisken å komme seg i. utvinning tid er vanligvis mindre enn 1 min.
2. Klargjøre gavage Apparatus
- Skjær den klare 22-G implantasjon slangen til litt mer enn omtrentlig lengde fra munnen til intestinal pære av fisken. I første omgang foreslår vi bedøvelse en fisk for hver ny gruppe som blir brukt til å få det beste estimat av lengden trengs.
- Skyv cut klart implantasjon tubing på ½-tommers 22-G kanyle før det er trygt og det er ingen fare for å løsne. Hvis en ½ 22-C nålen ikke er tilgjengelig, kuttet en lengre nål til approximately den lengden.
- Når prosessen er fullført, bør kateteret implantasjon slangen strekker seg omtrent 1 cm fra spissen av nålen, eller kortere hvis fisken er mindre.
- Fest 22-G kanyle hub til en 1-cc luerlok sprøyte.
3. Forberedelse til gavage
- Fres et spor inn i en svamp med en skalpell blad.
- Bløtlegg svamp i systemet vann gratis fra MS-222.
- Plasser fuktet svamp på et flatt underlag.
- Tegn opp den riktige 5 pl løsning for gavage i 22-G kateter slange og en en-cc sprøyte.
4. Anestesi og gavage
- Fast fisken i minst 24 timer før prosedyren.
- Legg fisken i MS-222-løsning før det mister sin refleks, og reagerer ikke på en halefinnen klemme, men opprettholder opercular bevegelse. Dette tar vanligvis ca 2-3 min.
- Ta fisken av narkosen løsning og plassere den isporet i svampen med hodet litt utstående fra svampen, men gjellene dekket av svampen.
- Beveg svamp i en vertikal stilling.
- Åpne sebrafisk munn ved hjelp av 22-G kateter slangen.
- Forsiktig inn slangen til spissen er forbi gjellene (ca 1 cm eller lengden av slangen). Implantasjon slangen bør ikke trenger å bli tvunget. Motstand antyder røret kan bli trykket gill bue eller hjertet.
- Hvis det er motstand, forsiktig trekke seg, omplassere og prøv igjen.
- Injisere stoffet sakte.
- Mens injisering, sørg for at løsningen ikke kommer ut via gjellene eller munn.
- Fjern fisken fra svampen og sted inn i oppsamlingstanken.
- Recovery forekommer vanligvis hos mindre enn 1 min, og vises som fisken svømmer oppreist og opprettholde likevekt.
- Overvåk fisk for regurgitasjon slik som vist ved å visualisere den fisk aktivt utvise material fra sin munn, eller ingen opercular bevegelse.
- Fisk kan bli returnert til sine vanlige tank når de har kommet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Begge kjønn av fisk, herunder drektige tisper ble vellykket gavaged (figur 1). En vellykket prosedyre tar mindre enn ett minutt uten væske sett spennende gjellene eller munn. Slangen går lett, uten kraft, uten blod sett på kateteret fjernes. Fremgangsmåten er hurtig, som krever omtrent 10 min til gavage 3-4 fisk, med et gjennomsnitt på 30-45 sekunder per fisk.
Zebrafisk bør ikke gavaged med mer enn 5 ul av en hvilken som helst løsning. Gavage med 10 mL løsninger ga bare en 50% treff (figur 2). Gavage av 10 ul var også helt mislykket i drektige hunner. I denne studien, veide den voksne fisken et gjennomsnitt på 0,2 g hver. Bruke CCAC anbefaling, vil dette bety at fire ul oppløsning kan gis til hver fisk. Den nåværende bruk av 5 pl ville være forenlig med disse anbefalingene. Denne teknikken har hatt omtrent en 10% mortality hastighet hovedsakelig knyttet til drektige tisper som ble funnet død neste dag. Selv om denne dødeligheten er betydelig lavere enn andre rapporterte tilførsel med sonde teknikker, ideelt sett bør grovt drektige hunnene ikke gavaged mindre det er nødvendig for utdanning.
Figur 1. Sammenligning av prosent suksess mellom ulike reproduktive grupper ved hjelp av 5 ul oppløsning. Prosenten lykkes med alle gruppene samlet var 88%. Den prosent suksess for drektige tisper var 100%, for ikke-drektige tisper 90% for menn og 82%.
Figur 2. Sammenligning av den samlede prosent suksess ved bruk av 5 mL versus 10 ul. Total prosent suksess ved anvendelse av 5 ul var 88%. Den totale prosent suksess ved hjelp av 10ul var 50%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Betydning
Denne teknikken er en forbedring, og gir flere fordeler over de to tidligere beskrevne teknikker for gavaging voksen sebrafisk. Først tillater bruk av en svamp for å holde fisken en person til å utføre prosedyren, i motsetning til en tidligere beskrevet teknikk krever to personer. Syv andre er kateter implantasjon slange mer fleksibel enn IV kateter, noe som kan bidra til å redusere sekundære trauma på grunn til perforeringen på samme måte som med butte spisser sprøyter. 7,8 tredje, ved å bruke en klar slange kan løsningen lett bli visualisert inn i fisken. Og til slutt, er det gavage apparat stabilt slik at den kan gjenbrukes raskt og effektivt når mange fisk må gavaged. Den gavage teknikk generelt reduserer variasjoner i forbruk og konsentrasjonen man ser i andre metoder for oral administrering til forbindelsen zebrafisk, og kan derfor også redusere mengden av fisk som trengs for å perform et eksperiment. 1-5
Kritiske trinn
Det er også viktig å raskt fisken i minst 24 timer siden med en 12 timers rask ikke alle sebrafisk har en tom tarm pære. Den 24-timers hurtig vil forhindre oppgulping og tap av løsningen gjennom munnen og gjeller på grunn av en delvis full tarmkanalen 13.. Det mest vanlige problemet er væske går ut gjennom munnen eller gjellene, noe som indikerer at slangen ikke blitt lagt langt nok ned i tarmkanalen. Væske kommer ut via munn eller gjeller kan unngås ved å observere den korrekte plassering av slangen så vel som ved hjelp av et rør av tilstrekkelig lengde til å omgå gjellene. Mer alvorlige komplikasjoner kan inkludere gill traumer, intern blødning, intestinal perforasjon, oppstøt og plutselig død. Disse komplikasjonene kan eller ikke kan observeres øyeblikkelig. Typisk skjer plutselig død timer etter at fremgangsmåten er fullført, mens fisken så ut normal under innledende utvinning.
Svampene ble neddykket i blekemiddel og deretter i natriumtiosulfatoppløsning forut for å komme i kontakt med fisken. Dette fjernet noen agenter eller kjemikalier som kan ha vært skadelig for fisken. Den MS-222 stamløsning bør lagres i en mørk beholder, fra lys og i opp til 5 dager i kjøleskapet. Hvis en brunaktig farge er observert løsningen skal kastes, da effekten reduseres. 11,12
Begrensninger
Denne protokollen krever anestesi av sebrafisk for å sikre suksess. Dette kan være ufordelaktig i visse tilfeller hvor det anestetiske middel kan ha en negativ effekt på forskningsresultater utfall som måles. 12. For tiden er det ingen gavage protokoll for zebrafisk som ikke krever anestesi. 7,8 Hvis MS-222 anestesi er kjent for å påvirke målte variabler, kan andre anestetika brukes, eller ett av de forrigeiously nevnte metoder for frivillige konsum metoder kan benyttes. 1-5
Denne teknikken, som med de tidligere beskrevne teknikker er utfordrende når utført på drektige tisper. 7. En mulig årsak til høy dødelighet i denne gruppen kan være intestinal perforasjon som fører til sepsis grunn av tarmkanalen fortrenges av eggene i coelom. Tilsvarende, hvis egg samt tarmen er perforert, så skrå egg-assosiert coelomitis kan også forekomme. Slike hendelser kan reduseres ved gyting de drektige hunnene før gavaging. Alternativt kan en mindre måle kateter bli brukt til å utføre prosedyren.
Hvis zebrafisk av en mindre størrelse blir brukt forsiktighet bør utvises for å justere størrelsen av slangen og nålen slik at diameter og lengde vil passe inn i munnen og tarmkanalen.
Effektiviteten av fremgangsmåten kan økes ytterligere hvis et andre individual var å overvåke anestesi og sikre en konstant tilførsel av bedøvet fisk til den enkelte utfører gavage. Denne teknikken er relativt lett å mestre og krever ikke omfattende praksis for å få ferdigheter. I tillegg gjør prosedyren ikke krever spesialisert utstyr eller anlegg.
Feilsøking
Hvis sebrafisk ikke blir bedøvet innen 2-3 min, endre bedøvelse løsning eller bruke en nylaget stamløsning. Hvis slangen ikke glir lett ned i tarmkanalen av zebrafisk, bør mindre diameter rør benyttes. Det kan være fordelaktig å øve på å bruke et lite antall fisk av samme størrelse, for å sikre riktig diameter og lengde av slangen så vel som for å evaluere hvorvidt volum som er gitt er aktuelle for zebrafisk størrelse. Slangen kan også merkes å merke den ideelle stikkedybden for størrelsen på fisken blir utnyttet.
Når denne teknikken beherskes, kan den brukes til å tilføre en nøyaktig mengde av forskjellige forbindelser eller smittestoffer til voksen zebrafisk effektivt og konsekvent, som gjør det nyttig for ulike forskningsprotokoller. Denne teknikken kan også minimere antallet fisk som trengs for å utføre eksperimenter, og tillate presis tid målinger av effekten av forskjellige forbindelser på fisken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
The Rockefeller University Comparative Biovitenskap Senter gitt støtte til dette prosjektet. Vi takker Janelle Monnas for teknisk assistanse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| A sponge | |||
| 1-cc luer lock syringe | Becton Dickinson Co | ||
| 22-G Micro-Renathane Implantation tubing (cut) | Braintree Scientific, Inc. | ||
| 1 22-G needle (cut, if needed) | Becton Dickinson Co | ||
| pH meter | Hanna probe | ||
| 1 scalpel blade | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| MS-222 (Finquel) | Argent Laboratories | ||
References
- Royes, J. -A. B., Chapman, F. Preparing Your Own Fish Feeds. , Department of Fisheries and Aquatic Sciences, Florida Cooperative Extension Service, Insitute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida. (2009).
- Gomez-Gil, B., Cabanillas-Ramos, J., Paez-Brambila, A., Roque, A. Standardization of the bioencapsulation of enrofloxacin and oxytetracycline in Artemia fransciscana Kellogg. Aquaculture. 196, 1-12 (1906).
- Langdon, C. Microparticle types for delivering nutrients to marine fish larvae. Aquaculture. 227, 259-275 (2003).
- Langdon, C., Nordgreen, A., Hawkyard, M., Hamre, K. Evaluation of wax spray beads for delivery of low-molecular weight, water soluble nutrients and antibiotics to Artemia. Aquaculture. 284, 151-158 (2008).
- Zang, L., Morikane, D., Shimada, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. A Novel Protocol for the Oral Administration of Test Chemicals to Adult Zebrafish. Zebrafish. 8, 203-210 (2011).
- Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think Small: Zebrafish as a Model System of Human pathology. Journal of Biomedicine and Biotechnology. , (2012).
- Tysnes, K. R., Jorgensen, A., Poppe, T., Midtlyng, P. J., Robertson, L. J. Preliminary expermients on use of zebrafish as a laboratory model for Giardia duodenalis infection. Acta Parasitologica. 57, 1-6 (2012).
- Marie, B., Huet, H., et al. Effects of a toxic cyanobacterial bloom (Planktothris agardhii) on fish: Insights from histopathological and quantitative proteomic assessments following the oral exposure of medaka fish (Oryzias latipes). Aquatic Toxicology. 114-115, 39-48 (2012).
- Canadian Council on Animal Care. CCAC guidelines on: the care and use of fish in research, teaching and testing. , CCAC. Ottawa, Ontario, Canada. (2005).
- Harper, C., Lawrence, C. The Laboratory Zebrafish. , CRC Press. Boca Raton, Florida, USA. (2011).
- De Tolla, L. J., Srinivas, S., et al. Guidelines for the Care and Use of Fish in Research. ILAR Journal. 37 (4), (1995).
- Topic Popovic, N., Strunjak-Perovic, I., et al. Tricaine methane-sulfonate (MS-222) application in fish anaesthesia. Journal of Applied Ichthyology. 28, 553-564 (2012).
- Field, H. A., Kelley, K. A., Martell, L., Goldstein, A. M., Serluca, F. C. Analysis of gastrointestinal physiology using a novel intestinal transit assay in zebrafish. Neurogastroenterology & Motility. 21, 304-312 (2009).
