Summary
Il crescente utilizzo di zebrafish come modello animale richiede lo sviluppo di metodi efficaci per la consegna di quantità note di composti e soluzioni. La procedura descritta di seguito gavage consente la somministrazione orale di volumi precisi di soluzione affidabile, sicuro ed efficiente per zebrafish adulto.
Abstract
Il pesce zebra è diventato un importante modello in vivo nella ricerca biomedica. Devono essere sviluppate e utilizzate per fornire i composti o agenti in soluzioni per la ricerca scientifica metodi efficaci. I metodi attuali per la somministrazione di composti per via orale per zebrafish adulti sono inesatte a causa della variabilità dei consumi volontaria da parte del pesce. Una procedura sonda gastrica è stato sviluppato per fornire quantitativi precisi di agenti infettivi per zebrafish per lo studio nella ricerca biomedica. Zebrafish adulto oltre 6 mesi di età sono stati anestetizzati con 150 mg / L di tampone MS-222 e gavaged con 5 ml di soluzione con flessibile catetere impianto tubo collegato a un taglio di 22-G punta dell'ago. Il tubo flessibile è stato abbassato nella cavità orale del zebrafish finché la punta del tubo prolungato oltre le branchie (circa 1 cm). La soluzione è stata poi iniettato lentamente nel tratto intestinale. Questo metodo è stato efficace 88% del tempo, con il pesce recuperando senza complicazioni. Questoprocedura è anche efficace come una persona può sonda gastrica 20-30 pesci in un'ora. Questo metodo può essere utilizzato per gestire con precisione gli agenti di malattie infettive studi, o studi di altri composti in zebrafish adulto.
Introduction
I metodi attuali per la somministrazione di composti per via orale per zebrafish includono composti somministrazione superiore rivestite su alimentazione, mescolati in diete gelatina 1, bioencapsulated in salamoia gamberetti 2, mescolati con lipidi diete incapsulati 3, cera perline spruzzo 4 e attraverso le diete a base di glutine. 5 Limitazioni di questi metodi di somministrazione orale includono alti tassi di lisciviazione e il consumo di composti incompleta o imprevedibile per singolo esemplare. Queste variabili sono problematici perché in studi di malattie infettive, sapendo la dose infettiva somministrata per il pesce può essere fondamentale per il successo dello studio. Inoltre, il lavoro precedente ha dimostrato che alcuni composti somministrati in bagni di acqua provocano lesione tossica per zebrafish branchie prima che gli effetti intestinali che possono essere oggetto di studio si verificano. 6
Gavage è un metodo standard usato in altre specie animali da laboratorio per amministrare quantità precise di un prodotto con akconcentrazione nown di studio nel campo della ricerca biomedica e farmaceutica. Solo recentemente metodi per gavaging zebrafish stato descritto in letteratura. Una tecnica descritta è un metodo a due persona che utilizza una guaina catetere 24-G collegato a una pipetta 2-20 microlitri di consegnare 5 ml di soluzione. 7 Il metodo descritto avuto un tasso di mortalità del 8,7% e del 39% sulla prima e seconda prova, rispettivamente, la maggior parte della mortalità è stato attribuito a femmine gravide. La seconda tecnica sonda gastrica descritta utilizzate siringhe gavage a punta smussa per amministrare 5 ml di soluzione al medakas (Oryzias latipes). 8 Informazioni sulla mortalità non è stato fornito e il processo esatto di eseguire la sonda gastrica non è stato descritto. Secondo il Consiglio canadese sulla cura degli animali e la Zebrafish laboratorio, fino a 1% del peso corporeo del pesce può essere somministrata tramite sonda gastrica. 9,10 Il nostro obiettivo era quello di sviluppare un metodo ripetibile di erogare volumi precisi di com, sicuro ed efficientelibbre per via orale per zebrafish adulti di entrambi i sessi e in tutte le fasi della riproduzione. Tale procedura sia applicabile per ogni studio in cui è richiesto un dosaggio orale accurata di un composto.
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Protocol
1. Preparazione della soluzione anestetica
- Preparare una soluzione di 150 mg / L di MS-222 in acqua sistema sia da una soluzione madre o dalla forma in polvere.
- Verifica del pH con un pHmetro.
- Tampone con bicarbonato di sodio come necessario fino a quando il pH è compreso tra 7-7.5.
- Preparare un serbatoio di acqua sistema libero da MS-222 per il pesce di recuperare in Il tempo di recupero è in genere meno di 1 min.
2. Preparazione del Apparato Gavage
- Tagliare la chiara 22-G impiantazione tubo per poco più di lunghezza approssimativa dalla bocca al bulbo intestinale del pesce. Inizialmente, suggeriamo anestetizzare un pesce per ogni nuovo gruppo viene utilizzato per ottenere la migliore stima della lunghezza necessaria.
- Spingere il tubo chiaro taglio impiantazione sul ½ pollice 22-G ago finché non è sicuro e non vi è alcun rischio di distacco. Se un ½ 22-C ago non è disponibile, tagliare un ago più lungo per approximately quella lunghezza.
- Quando completo, il tubo di impiantazione catetere deve estendersi circa 1 cm dalla punta dell'ago, o più breve se i pesci sono più piccoli.
- Collegare l'hub ago da 22 G per una 1-cc luerlok siringa.
3. Preparazione per Gavage
- Tagliare un solco in una spugna con una lama di bisturi.
- Immergere la spugna in acqua sistema libero da MS-222.
- Posizionare la spugna inumidita su una superficie piana.
- Elaborare la soluzione appropriata 5 microlitri per sonda gastrica nel catetere tubo 22-G e una siringa da 1 cc.
4. Anestesia e Gavage
- Veloce il pesce per almeno 24 ore prima della procedura.
- Mettere il pesce nella soluzione di MS-222 fino a che non perde il suo riflesso di raddrizzamento, e non risponde ad una pinna pizzico di coda, ma mantiene movimento dell'opercolo. Ciò richiede in genere circa 2-3 min.
- Togliere il pesce dalla soluzione anestetica e metterlo inla scanalatura nella spugna con la testa leggermente sporgente dalla spugna, ma le branchie coperte dalla spugna.
- Spostare la spugna in posizione verticale.
- Aprire la bocca del pesce zebra utilizzando il tubo del catetere 22-G.
- Inserire delicatamente il tubo fino a quando la punta è passato, le branchie (circa 1 cm o la lunghezza del tubo). Il tubo impianto non dovrebbe aver bisogno di essere costretti. Resistenza suggerisce il tubo può essere colpendo l'arco branchiale o cuore.
- Se c'è resistenza, ritirare delicatamente, riposizionare e riprovare.
- Iniettare il materiale lentamente.
- Durante l'iniezione, assicurarsi che la soluzione non esce attraverso le branchie o la bocca.
- Togliere il pesce dalla spugna e posto nel serbatoio di recupero.
- Recupero avviene tipicamente in meno di 1 min ed è indicata dal pesce nuotare eretta e mantenere l'equilibrio.
- Monitorare pesce per rigurgito come mostra la visualizzazione del pesce all'eliminazione attiva materiale dalla sua bocca, o nessun movimento dell'opercolo.
- Il pesce può essere restituito al loro serbatoio normale una volta che hanno recuperato.
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Representative Results
Entrambi i sessi di pesci, tra cui femmine gravide sono state gavaged con successo (Figura 1). Una procedura di successo richiede meno di un minuto senza liquido visto uscire le branchie o la bocca. Il tubo entra facilmente, senza forza, senza sangue visto al momento della rimozione del catetere. La procedura è rapida, che richiede circa 10 minuti per gavage 3 a 4 pesce, con una media di 30-45 sec per pesci.
Zebrafish non deve essere gavaged con più di 5 pl di qualsiasi soluzione. Sonda gastrica con 10 microlitri soluzioni provocato solo un tasso di successo del 50% (Figura 2). Sonda gastrica di 10 microlitri è stato anche completamente senza successo nelle femmine gravide. In questo studio, i pesci adulti pesato una media di 0,2 g ciascuno. Utilizzando la raccomandazione del Ccac, ciò significherebbe che il 4 ml di soluzione potrebbe essere somministrato a ogni pesce. L'uso corrente di 5 microlitri sarebbe coerente con queste raccomandazioni. Questa tecnica ha avuto circa una mortalit 10%tasso y essenzialmente attribuibili a femmine gravide che sono stati trovati morti il giorno successivo. Anche se questo tasso di mortalità è significativamente più basso rispetto ad altre tecniche di gavage segnalati, idealmente, le femmine grossolanamente gravide non dovrebbero essere gavaged meno che non sia necessario per motivi di studio.
Figura 1. Confronto di successo per cento tra i gruppi riproduttivi diversi utilizzando 5 ml di soluzione. Il successo per cento di tutti i gruppi combinati è stata dell'88%. Il successo per cento per le femmine gravide è stata del 100%, per le femmine non gravide 90% per i maschi e 82%.
Figura 2. Confronto di successo complessivo per cento con 5 ml contro 10 microlitri. Il successo totale per cento con 5 ml è stata dell'88%. Il successo complessivo per cento utilizzando 10microlitri è stata del 50%.
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Discussion
Significato
Questa tecnica è un miglioramento e fornisce diversi vantaggi rispetto le due tecniche descritte in precedenza per gavaging zebrafish adulto. Prima, l'uso di una spugna per trattenere il pesce permette una persona per effettuare la procedura, al contrario di una tecnica precedentemente descritta richiede due persone. 7 Secondo, tubi impianto del catetere è più flessibile di cateteri, che può aiutare a minimizzare il trauma secondario dovuto di perforazione in modo simile a usando siringhe punta smussa. 7,8 terzo luogo, utilizzando un tubo trasparente, la soluzione può facilmente essere visualizzato inserendo il pesce. E, infine, l'apparato sonda gastrica è stabile permettendo così di essere riutilizzato in modo rapido ed efficiente quando molti pesci hanno bisogno di essere gavaged. La tecnica sonda gastrica in generale riduce la variazione dei consumi e concentrazione visto in altri metodi di somministrazione orale composto a zebrafish, e come tale può anche ridurre la quantità di pesce necessaria per perfo rm un esperimento. 1-5
Fasi critiche
E 'anche importante digiunare il pesce per almeno 24 ore dal momento che con un 12 hr veloce non tutti zebrafish hanno un bulbo intestinale vuoto. Il hr veloce 24 impedirà rigurgito e perdita della soluzione attraverso la bocca e branchie causa di un tratto intestinale parzialmente pieno 13. Il problema più comune è liquido in uscita attraverso la bocca o le branchie, indicando che il tubo non era inserito abbastanza lontano lungo il tratto intestinale. Liquido in uscita attraverso la bocca o branchie può essere evitata osservando il corretto posizionamento del tubo così come usando un tubo di lunghezza sufficiente per bypassare le branchie. Complicazioni più gravi possono includere un trauma branchia, emorragia interna, perforazione intestinale, rigurgito e morte improvvisa. Queste complicazioni possono o non possono essere osservate immediatamente. Tipicamente, la morte improvvisa si verifica ore dopo la procedura è completata, mentre il pesce non sembravaRmal durante il recupero iniziale.
Le spugne sono stati immersi in candeggina e poi in soluzione di tiosolfato di sodio prima di venire in contatto con il pesce. Questo rimosso eventuali agenti o sostanze chimiche che possono essere state dannose per i pesci. Il MS-222 magazzino soluzione deve essere conservata in un contenitore scuro, lontano dalla luce e per 5 giorni in frigorifero. Se si osserva una tonalità marroncina, la soluzione deve essere eliminata, in quanto l'efficacia è ridotta. 11,12
Limitazioni
Questo protocollo non richiede anestesia del pesce zebra per garantire il successo. Questo può essere svantaggioso in determinate circostanze in cui l'agente anestetico può avere un effetto negativo sui risultati di ricerca di essere misurati 12. Attualmente, non esiste un protocollo di sonda gastrica per zebrafish che non richiede anestesia. 7,8 Se MS-222 è conosciuto per l'anestesia influenzare variabili misurate, altri anestetici possono essere usati, o uno dei prevpossono essere utilizzati metodi iously citati metodi di consumo volontario. 1-5
Questa tecnica, come con le tecniche descritte in precedenza è difficile quando eseguita su femmine gravide. 7 Una possibile causa di alta mortalità in questo gruppo può essere perforazione intestinale porta a sepsi dovuta al tratto intestinale stato destituito da le uova nel celoma. Analogamente, se le uova così come intestino sono perforate, allora può verificarsi anche un acuto uovo-associata coelomitis. Tali eventi possono essere minimizzati con la deposizione delle uova delle femmine gravide prima gavaging. Alternativamente, un catetere di calibro più piccolo può essere utilizzato per eseguire la procedura.
Se sono utilizzati zebrafish di una dimensione inferiore si deve prestare attenzione per regolare la dimensione del tubo e l'ago in modo che il diametro e la lunghezza si inserisce in bocca e del tratto intestinale.
L'efficienza della procedura può essere ulteriormente aumentata se una seconda individual sono stati per monitorare l'anestesia e garantire un approvvigionamento costante di pesce anestetizzato alla persona che svolge la sonda gastrica. Questa tecnica è relativamente facile da dominare e non richiede una pratica per acquisire competenze. Inoltre, la procedura non richiede attrezzature specializzate o strutture.
Risoluzione dei problemi
Se il pesce zebra non diventano anestetizzati entro 2-3 minuti, cambiare la soluzione di anestetico o utilizzare una soluzione madre preparata. Se il tubo non scivola facilmente lungo il tratto intestinale del pesce zebra, tubi del diametro più piccolo dovrebbe essere usato. Può essere utile fare pratica utilizzando un piccolo numero di pesci di dimensioni simili al fine di garantire il corretto diametro e lunghezza del tubo e per valutare se il volume somministrato è appropriato per la dimensione del zebrafish. Il tubo può anche essere contrassegnato da notare la profondità di penetrazione ideale per le dimensioni del pesce sia utilizzato.
Una volta che questa tecnica è dominata, esso può essere usato per fornire una quantità precisa di vari composti o agenti infettivi di zebrafish adulto efficiente e coerente, rendendolo utile per vari protocolli di ricerca. Questa tecnica può anche ridurre al minimo il numero di pesci necessari per eseguire esperimenti, e consentire misure di tempo precise degli effetti di vari composti sul pesce.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
La Rockefeller University Comparative Centro Bioscience fornito il supporto per questo progetto. Ringraziamo Janelle Monnas per l'assistenza tecnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| A sponge | |||
| 1-cc luer lock syringe | Becton Dickinson Co | ||
| 22-G Micro-Renathane Implantation tubing (cut) | Braintree Scientific, Inc. | ||
| 1 22-G needle (cut, if needed) | Becton Dickinson Co | ||
| pH meter | Hanna probe | ||
| 1 scalpel blade | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| MS-222 (Finquel) | Argent Laboratories | ||
References
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