Summary
O uso crescente de peixe-zebra como um modelo animal requer o desenvolvimento de métodos eficazes para a entrega de quantidades conhecidas de compostos e soluções. O procedimento de gavagem descrito abaixo permite a distribuição oral de volumes precisos de solução fiável, segura e eficiente de peixe-zebra adultos.
Abstract
O peixe-zebra tornou-se um importante modelo in vivo na pesquisa biomédica. Métodos eficazes devem ser desenvolvidos e utilizados para fornecer compostos ou agentes em soluções para a investigação científica. Os métodos atuais para a administração de compostos oralmente para zebrafish adultos são imprecisos devido à variabilidade no consumo voluntário pelos peixes. Um procedimento de gavagem foi desenvolvido para entregar quantidades precisas de agentes infecciosos para peixe-zebra para o estudo em pesquisa biomédica. Peixe-zebra adultos com mais de 6 meses de idade, foram anestesiados com 150 mg / L de tamponada MS-222 e gavaged com 5 mL de solução usando implantação tubo flexível do cateter ligada a um corte de 22 L da ponta de agulha. O tubo flexível foi baixada para dentro da cavidade oral do peixe-zebra, até a ponta do tubo estendida para além das guelras (aproximadamente 1 cm). A solução foi então injectada lentamente no tracto intestinal. Este método foi eficaz 88% do tempo, com peixe recuperação sem intercorrências. Esteprocedimento também é eficaz como uma pessoa pode gavagem 20-30 peixes em uma hora. Este método pode ser utilizado para administrar agentes precisamente para estudos de doenças infecciosas, ou estudos de outros compostos em peixes-zebra adultos.
Introduction
Os métodos atuais para a administração de compostos oralmente para zebrafish incluem compostos administração top-revestidos para alimentação, misturados em dietas de gelatina 1, bioencapsulated em salmoura camarão 2, misturado com dietas lipídicas encapsuladas 3, cera contas de pulverização 4 e via dietas à base de glúten. 5 Limitações estes métodos de administração oral incluem altas taxas de lixiviação e consumo composto incompleta ou imprevisível por peixes individual. Essas variáveis são problemáticas porque em estudos de doenças infecciosas, sabendo que a dose infecciosa administrado ao peixe pode ser fundamental para o sucesso do estudo. Além disso, o trabalho anterior tenha mostrado que certos compostos administrados em banhos de água causar lesão tóxica para as guelras do peixe-zebra intestinais antes que os efeitos que podem estar sob estudo ocorrem 6.
Gavage é um método padrão usado em outras espécies de animais de laboratório para administrar quantidades precisas de um produto com akconcentração nown para estudo na investigação biomédica e farmacêutica. Só recentemente os métodos para gavaging peixe-zebra foram descritos na literatura. Uma técnica descrita é um método de duas pessoas utilizando uma bainha de cateter 24 G ligada a uma pipeta de 2-20 ul de entregar 5 ul de solução. 7 O método descrito teve uma taxa de mortalidade de 8,7% e 39% no primeiro e segundo ensaio, respectivamente, a maioria da mortalidade foi atribuída a fêmeas grávidas. A segunda técnica gavage descrito seringas gavage atraumáticas usados para administrar 5 ml de solução para medakas (Oryzias latipes). 8 Informações sobre a mortalidade não foi fornecido eo processo exato de realizar a sonda não foi descrita. De acordo com a Canadian Council on Animal Care e do peixe-zebra de Laboratório, até 1% de peso do corpo do peixe, podem ser administrados através de sonda esofágica. 9,10 nosso objectivo foi desenvolver um método repetitivo, segura e eficiente de fornecer volumes precisos de ptlibras por via oral para zebrafish adultos de ambos os sexos e em todas as fases de reprodução. Este procedimento seria aplicável para qualquer estudo em que é necessária a administração oral de um composto precisas.
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Protocol
1. Preparar a solução anestésica
- Prepara-se uma solução de 150 mg / L de MS-222, em água do sistema a partir de uma solução estoque ou a partir da forma em pó.
- Verifique se o pH com um medidor de pH.
- Tampão de bicarbonato de sódio, como necessário, até que o pH está entre 7-7,5.
- Prepare um tanque de água do sistema livre de MS-222 para o peixe para se recuperar dentro O tempo de recuperação é normalmente menos de 1 min.
2. Preparando o aparelho Gavage
- Corte a clara 22-G implantação tubulação para um pouco mais do que o comprimento aproximado da boca para o bulbo intestinal do peixe. Inicialmente, sugerimos anestesiar um peixe para cada novo grupo que está sendo usado para obter a melhor estimativa do comprimento necessário.
- Empurrar o tubo de implante de corte clara para a agulha 22 G ½ polegada até que seja segura e não há risco de separar. Se uma agulha ½ 22-C não estiver disponível, cortar uma agulha mais longa approximately esse comprimento.
- Quando completa, a implantação tubo do cateter deve estender-se a cerca de 1 cm da ponta da agulha, ou mais curtos, se os peixes são menores.
- Conecte o hub agulha 22-G para um luerlok seringa de 1 cc.
3. Preparando-se para Gavage
- Corte um sulco em uma esponja com uma lâmina de bisturi.
- Mergulhe a esponja na água sistema livre de MS-222.
- Coloque a esponja humedecida sobre uma superfície plana.
- Desenha-se a 5 mL de solução adequada para a administração por sonda para o tubo do cateter 22-G e uma seringa de 1 cc.
4. Anestesia e Gavage
- Rápido o peixe, pelo menos, 24 horas antes do procedimento.
- Coloque o peixe na solução de MS-222 até perder a sua reflexo de endireitamento, e não responde a uma aleta de aperto da cauda, mas mantém a circulação opérculo. Isso normalmente leva cerca de 2-3 min.
- Retire o peixe da solução anestésica e colocá-lo ema ranhura na esponja com a cabeça ligeiramente saliente a partir da esponja, mas as guelras cobertos por esponja.
- Mover a esponja para uma posição vertical.
- Abra a boca do peixe-zebra com o tubo do cateter 22-G.
- Inserir o tubo suavemente até que a ponta é passado as guelras (cerca de 1 cm ou o comprimento do tubo). O tubo de implantação não precisa ser forçado. Resistência sugere o tubo pode ser batendo o arco ou coração branquial.
- Se houver resistência, retirar delicadamente, reposicionar e tente novamente.
- Injectar o material lentamente.
- Enquanto está a injectar, certifique-se de que a solução não sair através das guelras ou a boca.
- Retire o peixe da esponja e colocar no tanque de recuperação.
- A recuperação ocorre tipicamente em menos de 1 min, e é indicado pelos peixes nadando na vertical e manter o equilíbrio.
- Monitorar peixe para regurgitação, como mostrado, visualizando o peixe expulsar ativamente material de sua boca, ou nenhum movimento opercular.
- Os peixes podem ser devolvidos ao seu tanque regularmente, uma vez que eles se recuperaram.
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Representative Results
Ambos os sexos, de peixe, incluindo fêmeas grávidas foram gavaged com sucesso (Figura 1). Um procedimento bem sucedido, leva menos de um minuto com o líquido não visto saindo as brânquias ou a boca. A tubulação entra facilmente, sem força, sem sangue visto após a remoção do cateter. O procedimento é rápido, necessitando de aproximadamente 10 min, a administração por sonda 3-4 peixes, com uma média de 30-45 seg por peixe.
Peixe-zebra não deve ser gavaged com mais de 5 ul de uma solução. Gavage com 10 ul de soluções resultou em apenas uma taxa de sucesso de 50% (Figura 2). Gavage de 10 ml também foi completamente mal sucedido em mulheres grávidas. Neste estudo, os peixes adultos pesavam uma média de 0,2 g cada. Usando a recomendação do CCAC, isto significaria que 4 ul de uma solução pode ser administrada para cada peixe. O uso atual de 5 mL seria consistente com estas recomendações. Esta técnica tinha aproximadamente 10% de um mortality taxa atribuído principalmente às mulheres grávidas que foram encontrados mortos no dia seguinte. Embora esta taxa de mortalidade é significativamente mais baixa do que outras técnicas gavage relatados, idealmente, as fêmeas grosseiramente grávidas não devem ser gavaged menos que seja necessário para fins de estudo.
Figura 1. Comparação de sucesso entre os dois grupos por cento reprodutivas diferentes, utilizando 5 mL de solução. O sucesso por cento de todos os grupos combinados foi de 88%. O sucesso por cento para as mulheres grávidas foi de 100%, para as mulheres não-grávidas 90% e para os homens 82%.
Figura 2. Comparação de sucesso global por cento utilizando 5 ul versus 10 ul. Sucesso A percentagem total utilizando 5 ul foi de 88%. O total sucesso usando 10 por centoul foi de 50%.
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Discussion
Significado
Esta técnica é um aperfeiçoamento e oferece várias vantagens em relação a ambas as técnicas descritas anteriormente para o peixe-zebra gavaging adulto. Em primeiro lugar, o uso de uma esponja para restringir os peixes permite que uma pessoa para realizar o procedimento, em oposição a uma técnica previamente descrita exige duas pessoas. Segunda 7, o cateter de implante de tubagem é mais flexível do cateter IV, que pode ajudar a minimizar o trauma secundário devido a perfuração de forma semelhante ao uso de seringas de ponta romba. 7,8 Terceira, utilizando um tubo transparente, a solução pode ser facilmente visualizada de entrar no peixe. E, finalmente, o aparelho de sonda é estável que lhe permite ser reutilizada de forma rápida e eficientemente, quando muitos peixes necessitam ser gavaged. A técnica de entubação em geral reduz a variação na concentração de consumo e visto em outros métodos de administração do composto por via oral para o peixe-zebra, e como tal, podem também reduzir a quantidade de peixe necessária para perform um experimento 1-5.
Etapas críticas
É também importante a velocidade com que o peixe durante pelo menos 24 horas uma vez que com um jejum de 12 horas nem todos os peixes-zebra possuem uma lâmpada intestinal vazio. O jejum de 24 horas irá impedir regurgitação e perda da solução através da boca e brânquias devido a um trato intestinal parcialmente cheio 13. O problema mais comum é o líquido que sai através da boca ou das guelras, indicando que o tubo não foi inserida suficientemente longe para baixo no tracto intestinal. Líquido que sai através da boca ou guelras pode ser evitado através da observação da correcta colocação do tubo, bem como a utilização de uma tubagem de um comprimento suficiente para ultrapassar as guelras. Complicações mais graves podem incluir Gill trauma, hemorragia interna, perfuração intestinal, regurgitação e morte súbita. Estas complicações podem ou não ser observada imediatamente. Tipicamente, a morte súbita ocorre horas após o procedimento é concluído, quando o peixe não pareciarmal durante a recuperação inicial.
As esponjas foram embebidas em água sanitária e, em seguida, uma solução de tiossulfato de sódio antes de entrar em contacto com o peixe. Isto removeu todos os agentes ou produtos químicos que podem ter sido prejudicial para o peixe. A solução estoque de MS-222 deve ser armazenado num recipiente escuro, longe da luz e por até 5 dias no frigorífico. Se um tom acastanhado é observada a solução deve ser rejeitada, dado que a eficácia é reduzida 11,12.
Limitações
Este protocolo não requer anestesia do peixe-zebra para garantir o sucesso. Isto pode ser desvantajoso em certas circunstâncias, em que o agente anestésico podem ter um efeito adverso nos resultados da investigação que está sendo medido. 12 Actualmente, não há nenhum protocolo para a sonda do peixe-zebra que não requer anestesia. 7,8 Se o MS-222 é conhecida a anestesia afectar grandezas de medição, podem ser utilizados outros tipos de anestésicos, ou um dos antmétodos de métodos consumo voluntário iously mencionados podem ser utilizados. 1-5
Esta técnica, como acontece com as técnicas descritas anteriormente é um desafio quando realizado em mulheres grávidas. 7 A possível causa da alta taxa de mortalidade neste grupo pode ser perfuração intestinal levando à sepse devido ao trato intestinal sendo deslocadas por os ovos na coelom. Do mesmo modo, se os ovos, bem como do intestino são perfuradas, então também pode ocorrer uma situação aguda coelomitis ovo-associado. Tais eventos podem ser minimizados através de desova as fêmeas grávidas antes gavaging. Alternativamente, um cateter de calibre pequeno pode ser utilizado para realizar o procedimento.
Se o peixe-zebra de um tamanho menor são utilizados deve ser tomado cuidado para ajustar o tamanho da tubagem e da agulha de modo que o diâmetro eo comprimento vai encaixar-se a sua boca e no tracto intestinal.
A eficiência do processo pode ser ainda mais aumentada se uma segunda individual foram anestesia para monitorar e assegurar um fornecimento constante de peixes anestesiados para o indivíduo realizando a gavagem. Esta técnica é relativamente fácil de dominar e não exige prática extensa para obter proficiência. Além disso, o procedimento não requer equipamento especializado ou instalações.
Resolução de problemas
Se o peixe-zebra não se anestesiado dentro de 2-3 min, mudar a solução anestésica ou usar uma solução estoque preparada na hora. Se o tubo não deslizar facilmente para baixo do tracto intestinal de o peixe-zebra, tubos de menor diâmetro deverão ser utilizados. Pode ser vantajoso para praticar o uso de um pequeno número de peixes de tamanho semelhante, a fim de garantir a correcta diâmetro e comprimento do tubo, bem como para avaliar se o volume administrado é adequado para o tamanho do peixe-zebra. O tubo pode também ser marcado observar a profundidade de penetração ideal para o tamanho do peixe a ser utilizado.
Uma vez que esta técnica é dominada, ele pode ser usado para administrar uma quantidade exacta de vários compostos ou agentes infecciosos para peixe-zebra adultos de forma eficiente e consistente, tornando-o útil para vários protocolos de investigação. Esta técnica também pode minimizar o número de peixes necessários para efectuar experiências, e permitir que as medições dos efeitos de vários compostos sobre o peixe de tempo precisos.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
A Universidade comparativa Centro de Biociências Rockefeller deu apoio para este projeto. Agradecemos Janelle Monnas para assistência técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| A sponge | |||
| 1-cc luer lock syringe | Becton Dickinson Co | ||
| 22-G Micro-Renathane Implantation tubing (cut) | Braintree Scientific, Inc. | ||
| 1 22-G needle (cut, if needed) | Becton Dickinson Co | ||
| pH meter | Hanna probe | ||
| 1 scalpel blade | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| MS-222 (Finquel) | Argent Laboratories | ||
References
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