Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Gavaging דג הזברה למבוגר

doi: 10.3791/50691 Published: August 11, 2013

Summary

השימוש הגובר של דג הזברה כמודל חיה דורש פיתוח שיטות יעילות לאספקה ​​של כמויות ידועות של תרכובות ופתרונות. ההליך המתואר להלן gavage מאפשר משלוח האוראלי של כמויות מדויקות של פתרון אמין, בטוח ויעיל לדג זברה מבוגר.

Abstract

דג הזברה הפכה חשובה במודל vivo במחקר ביו. שיטות יעילות חייבים להיות מפותחות ומנוצלות כדי לספק תרכובות או סוכנים בפתרונות למחקר מדעי. שיטות קיימים כיום למתן דרך הפה לתרכובות דג הזברה למבוגרים הן לא מדויקות בגלל שונות בצריכה בהתנדבות על ידי הדג. הליך gavage פותח כדי לספק כמויות מדויקות של חומרים מזהמים לדג הזברה למחקר במחקר ביו. דג הזברה מבוגר מעל גיל 6 חודשים היו מורדם עם 150 מ"ג / ליטר של נאגר MS-222 וgavaged עם 5 μl של פתרון באמצעות צינורות השתלת צנתר גמישים המחובר לקצה מחט 22-G לחתוך. הצינור גמיש שהוריד לתוך חלל הפה של דג הזברה עד הקצה של הצינור הוארך בעבר את הזימים (כ 1 ס"מ). הפתרון היה לאחר מכן הזריק לאט לתוך המעי. שיטה זו הייתה יעילה 88% מהזמן, עם דג מחלים ללא אירועים מיוחדים. זההליך הוא גם יעיל כאדם אחד יכול gavage 20-30 דגים בשעה אחת. שיטה זו יכולה לשמש לניהול סוכנים דווקא ללימודי מחלות זיהומיות, או מחקרים של תרכובות אחרות בדג זברה מבוגר.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

שיטות קיימים כיום למתן דרך הפה לדג זברת תרכובות כוללות תרכובות בניהול עליונה מצופות על הזנה, מעורבב לדיאטות ג'לטין 1, bioencapsulated למלח שרימפס 2, מעורבב עם שומני דיאטות כמוס 3, שעוות חרוזים תרסיס 4 ובאמצעות דיאטות המבוססות על גלוטן. 5 מגבלות שיטות של אוראלי אלה כוללות שיעורי שטיפה גבוהים וצריכת מתחם שלמה או בלתי צפויה על ידי דגים בודדים. המשתנים האלה הם בעייתיים, כי במחקרים למחלות זיהומיות, ביודעו את מינון התולעת ניתן לדגים עשוי להיות קריטי להצלחת מחקר. כמו כן, עבודה קודמת הראתה כי תרכובות מסוימות המנוהלות באמבטיות מים לגרום לנגע רעיל לדג הזברה זימים לפני שפעת המעיים שעשויות להיות תחת מחקר להתרחש. 6

Gavage הוא שיטה סטנדרטית המשמשת במינים של בעלי חיים במעבדה אחרים כדי לנהל את הכמויות מדויקות של מוצר עם AKריכוז Nown למחקר במחקר ביו ותרופות. רק לאחרונה יש שיטות לgavaging דג הזברה תואר בספרות. טכניקה אחת היא שיטה שתוארה שני אדם באמצעות נדן קטטר 24-G המחובר לפיפטה μl 2-20 כדי לספק 5 μl של פתרון. 7 השיטה המתוארת היה שיעור תמותה של 8.7% ו -39% ביום הראשון והשני משפט, בהתאמה; ביותר של התמותה יוחס לנשים הרות להולדת. הטכניקה השנייה gavage תאר מזרקים gavage קהה שקצהו המשמש לניהול של 5 μl פתרון לmedakas (latipes Oryzias). 8 מידע על תמותה לא היה קיים ואת התהליך של ביצוע gavage לא תואר מדויק. לדברי המועצה הקנדית בטיפול בבעלי חיים ובמעבדת דג הזברה, עד 1% ממשקל גופו של הדג יכולה להינתן דרך gavage. 9,10 המטרה שלנו הייתה לפתח שיטת הדיר, יעילה ובטוחה של אספקת כמויות מדויקות של comק"ג במתן דרך פה לדג זברה מבוגר משני המינים ובכל השלבים של רבייה. הליך זה יהיה רלוונטי לכל מחקר שבו נדרש מינון אוראלי מדויק של מתחם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. הכנת ההרדמה

  1. הכן פתרון של 150 מ"ג / ליטר של MS-222 במערכת מים או מפתרון מניות או מצורת האבקה.
  2. בדוק את ה-pH בעזרת מד pH.
  3. חיץ עם סודה לשתייה לפי צורך עד pH הוא בין 7-7.5.
  4. הכן את טנק של מים חופשי ממערכת MS-222 לדגים להתאושש פנימה זמן ההחלמה הוא בדרך כלל פחות מ 1 דקות.

2. מכין את מנגנון Gavage

  1. חותכים את צינורות השתלת 22-G ברורים לקצת יותר מאורך משוער מן הפה אל הנורה המעיים של הדג. בתחילה, אנו מציעים הרדמת דג אחד לכל קבוצה חדשה בשימוש כדי לקבל את האומדן הטוב ביותר של אורך צורך.
  2. דחוף את צינור ההשתלה חד המשמעי על ½ אינץ' 22-G המחט עד שהוא בטוח ואין סכנה של ניתוק. אם מחט ½ 22-C אינה זמינה, לחתוך מחט ארוכה יותר ליישוםroximately שאורכו.
  3. כאשר שלם, צינורות השתלת הצנתר צריכים להרחיב על 1 ס"מ מקצה המחט, או קצר יותר, אם הדגים קטנים יותר.
  4. צרף את רכזת מחט 22-G למזרק luerlok 1-CC.

3. הכנות לקראת Gavage

  1. חורץ לתוך ספוג בלהב סכין מנתחים.
  2. משרים את הספוג במי מערכת החופשי מ-MS-222.
  3. הנח ספוג הלח על משטח שטוח.
  4. צייר את הפתרון המתאים μl 5 לgavage לתוך צינורות צנתר 22-G ומזרק 1-CC.

4. הרדמה וGavage

  1. מהר את הדגים במשך לפחות 24 שעות לפני ההליך.
  2. מניחים את הדגים בפתרון של MS-222 עד שהוא מאבד את רפלקס ליישרה, ואינו מגיב לקמצוץ סנפיר זנב, אבל שומר על תנועת opercular. זה בדרך כלל לוקח בערך 2-3 דקות.
  3. הסר את הדגים מההרדמה ולמקם אותו לתוךהחריץ בספוג עם הראש בולט מעט מהספוג, אבל הזימים מכוסים בספוג.
  4. העבר את הספוג למצב אנכי.
  5. פתח את פיו של דג הזברה באמצעות צינורות צנתר 22-G.
  6. הכנס בעדינות את הצינור עד לקצה הוא בעבר את הזימים (כ 1 ס"מ או לאורכו של הצינור). צינורות ההשתלה לא צריכים שיהיה צורך בכפייה. התנגדות מצביעה על הצינור ניתן להכות את הקשת או לב הזימים.
  7. אם יש התנגדות, בעדינות לסגת, למקם מחדש ונסה שוב.
  8. הזרק את החומר לאט לאט.
  9. בזמן הזרקה, לוודא כי הפתרון לא לצאת דרך הזימים או בפה.
  10. הסר את הדגים מהספוג והמקום למכל ההתאוששות.
  11. התאוששות מתרחשת בדרך כלל בדקות פחות מ 1 והוא הצביע על ידי הדגים שוחים זקוף ושמירה על שיווי משקל.
  12. לעקוב אחר דגים לregurgitation כפי שמוצג על ידי הדמיה הדגים גרשו באופן פעיל מ 'aterial מהפה שלו, או שאין תנועת opercular.
  13. דגים יכולים להיות מוחזרים למכל הרגיל שלהם ברגע שהם התאוששו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

שני המינים של דגים, כולל נשים הרות להולדת היו gavaged בהצלחה (איור 1). הליך מוצלח לוקח פחות מדקה אחת עם נוזל לא ראה יציאה מהזימים או בפה. הצינור נכנס בקלות, בלי כוח, בלי דם ראה עם הסרת הקטטר. ההליך הוא מהיר, הדורש כ -10 דקות לgavage 3 עד 4 דגים, עם ממוצע של 30-45 שניות לכל דגים.

לא צריך להיות gavaged דג הזברה עם יותר מ 5 μl של כל פתרון. Gavage עם 10 פתרונות μl הביא רק שיעור הצלחה של 50% (איור 2). Gavage של 10 μl היה גם נכשל לחלוטין בנשים הרות להולדת. במחקר זה, הדגים הבוגרים שקלו בממוצע 0.2 גר 'כל אחת. באמצעות ההמלצה של CCAC, פירוש דבר יהיה ש4 μl של פתרון יכול להינתן לכל דגים. השימוש הנוכחי של 5 μl יהיה בקנה אחד עם המלצות אלה. טכניקה זו הייתה כ 10% mortalitשיעור y בעיקר מיוחס לנקבות הרות להולדת שנמצאו מת ביום שלמחרת. בעוד שיעור תמותה זה הוא נמוך באופן משמעותי מאשר טכניקות אחרות gavage מדווח, באופן אידיאלי, לא צריכים להיות גס gavaged נקבות הרות להולדת אלא אם כן זה הכרחי למטרות מחקר.

איור 1
איור 1. השוואת אחוזי ההצלחה בין קבוצות שונות באמצעות רבייה 5 μl של פתרון. אחוזי ההצלחה של כל הקבוצות בשילוב הייתה 88%. אחוזי ההצלחה לנקבות הרות להולדת הייתה 100%; לנשים שאינן הרות להולדת 90% ולגברים 82%.

איור 2
איור 2. השוואה בין אחוזי ההצלחה הכוללת באמצעות 5 μl לעומת 10 μl. אחוזי ההצלחה המוחלטת באמצעות 5 μl הייתה 88%. אחוזי ההצלחה המוחלטת באמצעות 10μl היה 50%.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

משמעות

טכניקה זו היא שיפור ומספקת מספר יתרונות על פני שתי הטכניקות המתוארות בעבר לgavaging דג הזברה מבוגר. ראשית, שימוש בספוג כדי לרסן את הדגים מאפשר לאדם אחד כדי לבצע את ההליך, בניגוד לטכניקה שתוארה לעיל דורשת שני אנשים. 7 שנית, צינורות השתלת צנתר הוא גמישים יותר מאשר צנתרים IV, שיכול לסייע במזעור טראומה משנית בשל לניקוב באופן דומה לשימוש במזרקים שקצהו בוטה. 7,8 שלישית, על ידי שימוש בצינורות ברורים, הפתרון יכול בקלות להיות דמיינו הזנת הדגים. ולבסוף, מנגנון gavage יציב שמאפשר לו לעשות שימוש חוזר במהירות וביעילות, כאשר דגים רבים צריכים להיות gavaged. טכניקת gavage באופן כללי מפחיתה את השונות בצריכה וריכוז ראה בשיטות אחרות של ממשל מתחם אוראלי לדג זברה, ובתור שכזו עשויה גם להפחית את כמות הדגים זקוק לעמerform ניסוי. 1-5

שלבים קריטיים

כמו כן, חשוב לצום דגים לפחות 24 שעות מאז עם 12 שעות צום יש כל דג הזברה לא הנורה מעי ריקה. 24 שעות הצום יהיה למנוע regurgitation ואובדן הפתרון דרך הפה וזימים בשל מערכת 13 באופן חלקי מלאה מעיים. הבעיה הנפוצה ביותר היא נוזל יוצא דרך הפה או הזימים, ומציין שהצינורות לא הוכנס מספיק רחוק במורד המעי. ניתן להימנע מיציאת נוזלים דרך הפה או זימים על ידי התבוננות המיקום הנכון של צינורות, כמו גם שימוש בצינורות באורך מספיק כדי לעקוף את הזימים. סיבוכים חמורים יותר עשויים לכלול טראומת זימים, דימום פנימי, ניקוב מעי, regurgitation ומוות פתאומי. סיבוכים אלו עשויים או לא עשויים להיות שנצפו באופן מיידי. בדרך כלל, מוות פתאומי מתרחש שעות לאחר ההליך הושלם, ואילו הדגים לא נראוrmal במהלך התאוששות ראשונית.

את הספוגים היו ספוגים באקונומיקה ולאחר מכן בתמיסת נתרן טטרתיונט לפני לבוא במגע עם הדגים. זה הוסר כל סוכנים או כימיקלים שאולי היו מזיק לדגים. פתרון המניות של MS-222 יש לאחסן במכל חשוך, הרחק מאור ועד 5 ימים במקרר. אם גוון חום הוא ציין אמור להיות מושלך הפתרון, כיעילות מופחתת. 11,12

מגבלות

פרוטוקול זה דורש הרדמה של דג הזברה כדי להבטיח את ההצלחה. זה עשוי להיות נחות בנסיבות מסוימות שבו סוכן ההרדמה עלול להיות השפעה שלילית על תוצאות המחקר הנמדדת. 12 נכון לעכשיו, אין פרוטוקול gavage לדג הזברה שאינו דורש הרדמה. 7,8 אם ההרדמה MS-222 ידועה להשפיע על משתנים שנמדדו, הרדמה אחרות עשויה לשמש, או באחד מקודםשיטות שהוזכרו iously של שיטות הצריכה וולונטריות יכולות להיות מנוצלים. 1-5

טכניקה זו, כמו עם טכניקות שתוארו לעיל היא מאתגרת כאשר היא מבוצעת בנשים הרות להולדת. 7 גורם אפשרי לתמותה גבוהה בקבוצה זו עשויה להיות ניקוב מעיים שהוביל לאלח דם כתוצאה ממערכת העיכול שנעקרה על ידי את הביצים בcoelom. בדומה לכך, אם את הביצים, כמו גם המעי מחוררים, אז coelomitis ביצה הקשורים חריף עלול להתרחש גם. אירועים אלה עשויים להיות ממוזערים על ידי השרצה הנקבות ההרות להולדת לפני gavaging. לחלופין, קטטר מד קטן יותר ניתן להשתמש כדי לבצע את ההליך.

אם דג הזברה של גודל קטן יותר נמצא בשימוש יש להקפיד להתאים את הגודל של צינורות ואת המחט, כך שהקוטר והאורך יתאימו לפה שלהם ומערכת העיכול.

היעילות של ההליך יכולה להיות מוגברת עוד יותר אם individua שני l היה לפקח הרדמה ולהבטיח אספקה ​​קבועה של דגים הרדימו לאדם ביצוע gavage. טכניקה זו היא קלה יחסית לשלוט ואינה דורשת תרגול רב כדי להשיג מיומנות. בנוסף, הנוהל אינו דורש ציוד או מתקנים מיוחדים.

בעיות ירי

אם דג הזברה לא להיות בהרדמה תוך 2-3 דקות, לשנות את ההרדמה או להשתמש בפתרון מניות מוכן טרי. אם הצינור לא להחליק בקלות את מערכת העיכול של דג הזברה, יש להשתמש בצינורות בקוטר קטנים יותר. זה עשוי להיות מועיל כדי לתרגל באמצעות מספר קטן של דגים בגודל דומה על מנת להבטיח את הקוטר הנכון ואורכו של הצינור, כמו גם כדי להעריך אם ההיקף מנוהל מתאים לגודלו של דג הזברה. צינורות עשויים גם להיות מסומנים כדי לציין את עומק החדירה האידיאלי לגודל של דגים מנוצלים.

> סיכום

ברגע שטכניקה זו היא שולטת, זה יכול לשמש כדי לספק כמות מדויקת של תרכובות שונות או חומרים מזהמים לדג זברה מבוגר ביעילות ובאופן עקבי, מה שהופך אותו לשימושי עבור פרוטוקולי מחקר שונים. טכניקה זו יכולה גם לצמצם את מספר הדגים הנדרשים לביצוע ניסויים, ולאפשר מדידות בזמן מדויק של ההשפעות של תרכובות שונות על הדגים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

המרכז השוואתי באוניברסיטת רוקפלר Bioscience סיפק תמיכה לפרויקט זה. אנו מודים Monnas janelle לקבלת סיוע טכני.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
A sponge
1-cc luer lock syringe Becton Dickinson Co
22-G Micro-Renathane Implantation tubing (cut) Braintree Scientific, Inc.
1 22-G needle (cut, if needed) Becton Dickinson Co
pH meter Hanna probe
1 scalpel blade
Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
MS-222 (Finquel) Argent Laboratories

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Royes, J. -A. B., Chapman, F. Preparing Your Own Fish Feeds. Department of Fisheries and Aquatic Sciences, Florida Cooperative Extension Service, Insitute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida. (2009).
  2. Gomez-Gil, B., Cabanillas-Ramos, J., Paez-Brambila, A., Roque, A. Standardization of the bioencapsulation of enrofloxacin and oxytetracycline in Artemia fransciscana Kellogg. Aquaculture. 196, 1-12 (1906).
  3. Langdon, C. Microparticle types for delivering nutrients to marine fish larvae. Aquaculture. 227, 259-275 (2003).
  4. Langdon, C., Nordgreen, A., Hawkyard, M., Hamre, K. Evaluation of wax spray beads for delivery of low-molecular weight, water soluble nutrients and antibiotics to Artemia. Aquaculture. 284, 151-158 (2008).
  5. Zang, L., Morikane, D., Shimada, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. A Novel Protocol for the Oral Administration of Test Chemicals to Adult Zebrafish. Zebrafish. 8, 203-210 (2011).
  6. Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think Small: Zebrafish as a Model System of Human pathology. Journal of Biomedicine and Biotechnology. (2012).
  7. Tysnes, K. R., Jorgensen, A., Poppe, T., Midtlyng, P. J., Robertson, L. J. Preliminary expermients on use of zebrafish as a laboratory model for Giardia duodenalis infection. Acta Parasitologica. 57, 1-6 (2012).
  8. Marie, B., Huet, H., et al. Effects of a toxic cyanobacterial bloom (Planktothris agardhii) on fish: Insights from histopathological and quantitative proteomic assessments following the oral exposure of medaka fish (Oryzias latipes). Aquatic Toxicology. 114-115, 39-48 (2012).
  9. Canadian Council on Animal Care. CCAC guidelines on: the care and use of fish in research, teaching and testing. CCAC. Ottawa, Ontario, Canada. (2005).
  10. Harper, C., Lawrence, C. The Laboratory Zebrafish. CRC Press. Boca Raton, Florida, USA. (2011).
  11. De Tolla, L. J., Srinivas, S., et al. Guidelines for the Care and Use of Fish in Research. ILAR Journal. 37, (4), (1995).
  12. Topic Popovic, N., Strunjak-Perovic, I., et al. Tricaine methane-sulfonate (MS-222) application in fish anaesthesia. Journal of Applied Ichthyology. 28, 553-564 (2012).
  13. Field, H. A., Kelley, K. A., Martell, L., Goldstein, A. M., Serluca, F. C. Analysis of gastrointestinal physiology using a novel intestinal transit assay in zebrafish. Neurogastroenterology & Motility. 21, 304-312 (2009).
Gavaging דג הזברה למבוגר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. Gavaging Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (78), e50691, doi:10.3791/50691 (2013).More

Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. Gavaging Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (78), e50691, doi:10.3791/50691 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter