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Biology

Gavagingアダルトゼブラフィッシュ

doi: 10.3791/50691 Published: August 11, 2013

Summary

動物モデルとしてゼブラフィッシュの使用の増加は、化合物および溶液の既知量を送達するための効果的な方法の開発が必要である。後述の強制経口投与手順は成人ゼブラフィッシュに安全かつ効率的に、確実に、溶液の正確なボリュームの経口送達を可能にします。

Abstract

ゼブラフィッシュは、生物医学研究におけるin vivoモデルにおいて重要になってきている。効果的な方法が開発され、科学研究のため溶液中の化合物または薬剤を送達するために利用されなければならない。成体ゼブラフィッシュに経口化合物を投与するための現在の方法は、魚によって自発的消費の変動に起因する不正確である。強制経口投与手順は生物医学研究における研究のためにゼブラフィッシュに感染性病原体の正確な量を提供するために開発されました。生後6ヶ月以上の大人のゼブラフィッシュは、MS-222のバッファとカット22-G針先端に取り付け柔軟なカテーテル注入チューブを使用して溶液5μlと強制経口投与の150 mg / Lでで麻酔した。チューブの先端が鰓(約1cm)を越えて延長されるまで、可撓性チューブは、ゼブラフィッシュの口腔内に低下した。溶液をゆっくり腸管に注入した。この方法では、魚は無事回復と、時間の88%に有効であった。この一人が1時間で20〜30魚を強制経口投与することができますように手順も効率的です。この方法は、正確に成体ゼブラフィッシュにおける感染症研究、又は他の化合物の研究のための薬剤を投与するために使用することができる。

Introduction

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ゼブラフィッシュに経口化合物を投与するための現在の方法は、塩水エビ2、脂質カプセルダイエット3と混合し、ワックススプレービーズ4へとグルテンベースの食事経由bioencapsulatedゼラチンダイエット1に混入飼料、、上にトップコートした管理の化合物が挙げられる。5制限経口投与したこれらの方法は、個々の魚によって高い浸出率と不完全または予測不可能な化合物の消費量が含まれています。感染症研究で、魚に投与感染量は研究の成功のために重要かもしれない知っているので、これらの変数は、問題がある。また、前作では水浴で投与特定の化合物が研究下にあってもよい腸の効果が発生する前にエラをゼブラフィッシュに有毒な病変を引き起こすことが示されている。6

胃管栄養法は、AKを生成物の正確な量を投与するために他の実験動物種で使用される標準的な方法である医学と薬学研究における研究のためノウン濃度。ごく最近の文献に記載されてgavagingゼブラフィッシュのためのメソッドを持っています。記載の技術は、一つの溶液5μlを提供するために2-20μlのピペットに取り付けられた24-Gカテーテルシースを使用して二人方法である。7方法は、上記の第一及び第二の上の8.7%と39%の死亡率であったそれぞれ裁判;死亡のほとんどは妊娠女性に起因するものであった。第二強制飼養技術はメダカ( メダカ )の溶液5μlを管理する鈍い先端が強制経口注射器を使って説明した。死亡で8情報が提供されなかったし、強制経口投与を行うの厳密なプロセスが記載されていません。アニマルケアカナダ評議会と研究所ゼブラフィッシュによると、魚の体重の1%までは、胃管を介して投与することができる。9,10私たちの目標は、COMの正確なボリュームを提供するの再現、安全かつ効率的な方法を開発することでしたポンド経口両性の成体ゼブラフィッシュへと再生のすべての段階である。この手順は、化合物の正確な経口投与が必要とされる任意の研究のために適用可能である。

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Protocol

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1。麻酔溶液を調製

  1. 原液から、または粉末状のいずれかから、システムの水の中にMS-222の150 mg / Lでの解決策を準備します。
  2. pHメーターを用いてpHを確認します。
  3. pHが7〜7.5の間になるまで、必要に応じて炭酸水素ナトリウム緩衝液。
  4. 回復時間は通常1分未満ですインチ回復する魚のためのMS-222からフリーシステム水のタンクを準備します。

2。強制経口装置を製造する

  1. 口から魚の腸の電球に近似した長さよりも少し多くに明らか22-G注入チューブをカットします。当初、我々は必要な長さの最善の見積りを取得するために使用されている各々の新しいグループに1つの魚を麻酔を示唆している。
  2. それが安全であると脱着の危険がなくなるまで½インチ22-Gの針の上にカットの明確な注入チューブを押し込みます。 ½22-C針が使用できない場合は、アプリに長い針をカットroximatelyその長さ。
  3. 魚が小さい場合完了すると、カテーテル注入チューブは、約1針の先端からセンチ、またはより短いを拡張する必要があります。
  4. 1-CC luerlokシリンジに22-G針ハブを取り付けます。

3。強制経口の準備

  1. 手術用メスの刃でスポンジに溝を切った。
  2. MS-222から空きシステム水中でスポンジを浸す。
  3. 平らな面の上に湿らせたスポンジを置きます。
  4. 22-Gカテーテルチューブと1 ccのシリンジへの強制経口投与に適した5μlの解決策を策定する。

4。麻酔と強制経口

  1. 手続き前に少なくとも24時間の高速魚。
  2. それは、その立ち直り反射を失い、テールフィンのピンチに反応しませんが、鰓蓋の動きを維持するまで、MS-222溶液中で魚を置きます。これは通常、約2〜3分かかります。
  3. 麻酔液から魚を取り出し、それを中に配置少しスポンジから突出ヘッド付きスポンジの溝が、スポンジで覆われてエラ。
  4. 垂直位置にスポンジを動かします。
  5. 22-Gカテーテルチューブを使用してゼブラフィッシュの口を開きます。
  6. 先端が鰓(約1cmまたはチューブの長さ)は、過去になるまでゆっくりとチューブを挿入します。注入管は、強制する必要はありません。抵抗は、チューブが鰓弓や心臓を打つことが可能性を示唆している。
  7. 抵抗がある場合は、優しく、撤回し再配置して、もう一度試してください。
  8. ゆっくり材料を注入します。
  9. 注入しながら、解決策は鰓や口を経由して終了しないことを確認してください。
  10. 回収タンクにスポンジと場所から魚を外します。
  11. 回復は、通常1分未満で発生し、均衡を直立水泳や維持魚によって示されます。
  12. 積極的にMを追放魚を視覚化することによって示されるように逆流のために魚を監視その口、あるいは全く鰓蓋の動きからaterial。
  13. 彼らが回復した後に魚は、通常のタンクに戻すことができます。

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Representative Results

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妊娠女性を含む魚の男女が正常( 図1)を強制経口投与した。成功した手順は、鰓や口を出見ない液体で1分未満をとります。チューブはカテーテル抜去により見ない血で、力がなくても、簡単に入ります。の手順では、約10分で魚あたり30から45秒の平均は、3か​​ら4の魚を強制給餌する必要、迅速である。

ゼブラフィッシュは、任意のソリューション以上の5μlの強制経口投与すべきではありません。 10μlのソリューションを強制経口投与では、わずか50%の成功率( 図2)となりました。 10μlに強制経口投与は、妊娠女性でも完全に失敗しました。本研究では、成魚は0.2グラム、それぞれの平均の重量を量った。 CCACの勧告を使用し、これは解決策4μlのがそれぞれの魚に投与することができることを意味します。 5μLの現在の使用は、これらの勧告に一致するであろう。この手法は、約10%であったmortalit翌日死んで発見された妊娠女性に主に起因するyの速度。この死亡率は他の報告された強制飼養技術よりも大幅に低いですが、それは研究の目的のために必要な場合を除き、理想的には、肉眼で妊娠女性を強制経口投与すべきではありません。

図1
図1。溶液5μlを使用して、異なるグループ間の生殖%の成功の比較。結合されたすべてのグループのパーセントの成功率は88%であった。妊娠女性のためのパーセントの成功率は100%であった、非妊娠女性90%、男性82%のために。

図2
図2。 5μlの対10μlのを使用して全体的なパーセントの成功の比較。5μlのを使用して合計%の成功率は88%であった。 10を使用して合計%の成功μlのは50%であった。

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Discussion

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意義

この手法は改善で大人ゼブラフィッシュをgavagingするための2つの前述の技術上のいくつかの利点を提供する。まず、魚を抑制するためにスポンジを使用すると、2人を必要とする前に説明した手法とは対照的に、一人が、手順を実行することができます。7番目は、カテーテル注入チューブが原因で二次的な外傷を最小限に抑えることができ、IVカテーテルよりも柔軟性があり鈍先端の注射器を使用して同様に穿孔。7,8第三に、明確なチューブを使用することによって、解決策は簡単に魚を入力可視化することができます。そして最後に、強制経口投与装置は、多くの魚を強制摂取する必要がある場合、それが迅速かつ効率的に再利用することを可能に安定である。一般に、胃管栄養法の技術は、消費およびゼブラフィッシュに経口投与化合物の他の方法に見られる濃度のばらつきを低減し、そのようにも電話するために必要な魚の量を減少させることができる実験erform。1-5

重要なステップ

また、高速のすべてのゼブラフィッシュが空腸の電球を持っていない12時間で以来、少なくとも24時間、速い魚にとって重要である。 24時間高速は口から逆流、溶液の損失を防止し、部分的に完全腸管13によるえられます。最も一般的な問題は、チューブが腸管ダウン十分挿入されなかったことを示す、口またはえらを通って出る液体である。口や鰓を介して出る液体がチューブの正しい配置を観察するだけでなく、鰓をバイパスするように十分な長さのチューブを使用することによって回避することができる。その他の重篤な合併症は、鰓外傷、内出血、腸穿孔、逆流や突然死を含むことができる。これらの合併症は、または直ちに観察されない場合があります。手続きが完了した後に魚がないに見えながら、一般的には、突然の死は、時間も発生しません初期リカバリ中rmal。

スポンジは、漂白剤で、次いで従来の魚に接触することにチオ硫酸ナトリウム溶液中に浸漬した。これは、魚に有害であった可能性のある薬剤や薬品を​​削除しました。 MS-222原液を離れて光から、冷蔵庫で最大5日間、暗いコンテナに格納する必要があります。茶色がかった色合いは、有効性が減少するように溶液は、破棄されるべきであるが観察された場合。11,12は

制限事項

このプロトコルは、成功を確実にするためにゼブラフィッシュの麻酔を必要としません。これは、麻酔剤が測定される研究成果に悪影響を与える可能性があり、特定の状況では不利になるかもしれない。現在12、麻酔を必要としないゼブラフィッシュについての強制経口投与プロトコルが存在しない。7,8は、MS-222麻酔に知られている場合測定された変数に影響を与え、他の麻酔薬が使用され、または前のいずれかになります自発的な摂取方法のiously上述の方法を利用することができる。1-5

妊娠女性で実行すると、この技術は、以前に説明された技術と同様に困難である。7このグループの高い死亡率の原因は、体腔内の卵によって変位する腸管に起因する敗血症につながる腸穿孔かもしれません。卵だけでなく、腸に穴がある場合も、その後急性卵関連coelomitisも発生することがあります。このようなイベントはgavaging前に産卵で妊娠女性を最小限に抑えることができる。あるいは、より小さいゲージカテーテル手順を実行するために使用することができる。

小さいサイズのゼブラフィッシュが使用される場合ケアは、直径と長さが口や腸管内に収まるように管および針の大きさを調整するために取られるべきである。

第individuaの場合は、手順の効率をさらに高めることができるlは麻酔監視し、胃管栄養法を行う個体に麻酔をかけ、魚の一定の供給を確保していた。この技術は、習得することが比較的容易であり、習熟を得るために大規模な練習を必要としない。さらに、プロシージャは特殊な装置や施設を必要としません。

トラブルシューティング

ゼブラフィッシュは2-3分以内に麻酔になっていない場合は、麻酔薬のソリューションを変更したり、新たに調製した原液を使用しています。チューブはゼブラフィッシュの腸管ダウン簡単にスライドできない場合は、小さい直径の管を使用すべきである。それはチューブの正確な直径および長さを確実にするだけでなく、投与量はゼブラフィッシュのサイズに適しているかどうかを評価するために、同じサイズの魚の数が少ないを使用して実施することが有益であり得る。チューブは、また利用されている魚のサイズの理想的な侵入深さに注意することがマークされるかもしれません。

この技術が習得されると、様々な研究プロトコルにも有用であるなり、効率的かつ一貫して成人ゼブラフィッシュに種々の化合物又は感染性病原体の正確な量を送達するために使用することができる。また、この手法は、実験を行うために必要な魚の数を最小限に抑え、魚種々の化合物の効果の正確な時間測定を可能にすることができる。

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Disclosures

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

Acknowledgments

ロックフェラー大学比較バイオサイエンスセンターでは、このプロジェクトのためのサポートを提供した。我々は技術支援のためのジャのMonnasに感謝。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
A sponge
1-cc luer lock syringe Becton Dickinson Co
22-G Micro-Renathane Implantation tubing (cut) Braintree Scientific, Inc.
1 22-G needle (cut, if needed) Becton Dickinson Co
pH meter Hanna probe
1 scalpel blade
Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
MS-222 (Finquel) Argent Laboratories

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References

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Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. Gavaging Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (78), e50691, doi:10.3791/50691 (2013).More

Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. Gavaging Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (78), e50691, doi:10.3791/50691 (2013).

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