Summary
Все более широкое использование данио в качестве животной модели требует разработки эффективных методов для доставки известных количеств соединений и решений. Желудочный зонд описанной ниже процедуры позволяет пероральной доставки точной объемы раствора надежно, безопасно и эффективно для взрослых данио.
Abstract
Данио стала важной в естественных условиях модель в биомедицинских исследованиях. Эффективные методы должны быть разработаны и использованы для доставки соединений или агентов в растворах для научных исследований. Современные методы введения соединений устно взрослых данио являются неточными из-за изменчивости добровольное потребление рыбы. Зонда была разработана процедура обеспечивает точное количество инфекционных агентов данио для исследования в биомедицинских исследованиях. Взрослых данио в течение 6-месячного возраста анестезировали 150 мг / л буфера MS-222 и которым вводили 5 мкл раствора с использованием гибких труб имплантации катетера прикреплен к сокращению 22-G иглы. Гибкий шланг был опущен в полости рта данио до кончика трубки продлил мимо жабры (около 1 см). Затем раствор медленно вводят в желудочно-кишечном тракте. Этот метод был эффективным 88% времени, с рыбой восстановления без осложнений. ЭтоПроцедура также эффективна, как один человек может зондовым 20-30 рыб в течение одного часа. Этот метод может использоваться, чтобы точно управлять средств по поводу инфекционных заболеваний исследования или исследования других соединений в взрослых данио.
Introduction
Современные методы введения соединений устно данио включают введение соединений верхним покрытием на корм, смешанный в желатиновые диеты 1, bioencapsulated в артемии 2, смешанные с липидной инкапсулированные диет 3, воск спрей бисера 4 и через клейковины на основе диеты. 5 Ограничения этих методов перорального введения включают высокие темпы выщелачивания и неполным или непредсказуемые соединения потребления отдельных рыб. Эти переменные являются проблематичным, поскольку в исследованиях инфекционных болезней, зная, инфекционная доза вводится рыба может иметь решающее значение для успеха исследования. Кроме того, предыдущие исследования показали, что некоторые соединения вводят в воду ванны вызывают токсическое поражение для рыбок данио жабры перед кишечных эффектов, которые могут находиться под исследование произойти. 6
Зонд является стандартным методом, используемым в других видах лабораторных животных для администрирования точное количество продукта с АКNown концентрации для исследования в биомедицинских и фармацевтических исследований. Лишь недавно методы gavaging данио были описаны в литературе. Один из методов, описанных в двух человек методом с использованием 24-G оболочка катетера прикреплен к 2-20 мкл пипеткой доставить 5 мкл раствора. 7 Метод, описанный была смертность от 8,7% и 39% на первом и втором судебного разбирательства, соответственно, большая часть смертности объясняется беременных самок. Второй зонд использовали методику, описанную тупым наконечником зонда шприцы для введения 5 мкл решение medakas (Oryzias latipes). 8 Информация на смертность не была предоставлена и точный процесс выполнения зонд не был описан. По данным Канадского совета по уходу за животными и данио рерио лаборатории, до 1% от массы тела рыбы можно вводить через зонд. 9,10 Нашей целью была разработка повторяемой, безопасным и эффективным способом доставки точные объемы COMфунтов устно взрослых данио обоих полов и на всех стадиях воспроизводства. Эта процедура будет применяться для любого исследование, в котором точные перорального введения соединения не требуется.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка раствора анестетика
- Готовят раствор 150 мг / л MS-222 в системе вода либо из исходного раствора, или из порошкообразной форме.
- Убедитесь, что рН с использованием рН-метра.
- Буфер с бикарбонатом натрия мере необходимости, пока значение рН не находится в пределах 7-7,5.
- Подготовьте бачок системы воды, не содержащей MS-222 для рыбы, чтобы восстановить дюйма время восстановления, как правило, менее 1 мин.
2. Подготовка зонда аппарата
- Вырезать ясно 22-G имплантации трубки к немного больше, чем приблизительная длина от устья до кишечной лампы рыбы. Первоначально, мы предлагаем обезболивающим одна рыба для каждой новой группы используются, чтобы получить лучшие оценки необходимой длины.
- Нажмите разреза прозрачной трубки имплантации на ½-дюймовой 22-G иглы, пока она не является безопасной и нет риска отсоединения. Если ½ 22-C иглы не доступна, вырезать больше иглы приложенияroximately, что длины.
- После завершения трубки катетера имплантации должна распространяться около 1 см от кончика иглы, или короче, если рыба меньше.
- Прикрепите 22-G иглы в 1-мл шприц luerlok.
3. Подготовка к зонд
- Вырезать канавку в губку с лезвием скальпеля.
- Замочите губки в системе вода свободна от MS-222.
- Поместите увлажненной губкой на плоской поверхности.
- Разработать соответствующие 5 мкл раствора для затравки в 22-G трубки катетера и 1-мл шприц.
4. Анестезия и зонд
- Быстрый рыбу по крайней мере 24 часа до процедуры.
- Поместите рыбу в MS-222 решение, пока она не теряет свой рефлекс, и не реагирует на щепотку хвостовым плавником, но сохраняет оперкулярной движения. Обычно на это уходит около 2-3 мин.
- Снимите рыбу из раствора анестетика и поместите его вканавка в губке с головой слегка выступающие из губки, но жабры покрыты губкой.
- Перемещение губку в вертикальном положении.
- Откройте рот рыбок данио, используя 22-G трубки катетера.
- Аккуратно вставьте трубку, пока наконечник не пройдет за жабры (примерно 1 см или длины трубки). Имплантации трубки не нужно быть принудительным. Сопротивление предлагает трубка может быть удар жаберных арки или сердце.
- Если есть сопротивление, аккуратно снять, переместить и повторите попытку.
- Введите материала медленно.
- В то время как инъекционных, убедитесь, что решение не выходить через жабры или рот.
- Снимите рыбу из губки и место в бак утилизации.
- Восстановление обычно происходит менее чем за 1 мин и указывает, что рыба плавала в вертикальном положении и поддержания равновесия.
- Монитор для рыбы срыгивание, как показано посредством визуализации рыбы активно изгнания мaterial от ее устья, или вообще не оперкулярной движения.
- Рыба может быть возвращен к своей обычной бак, как только они восстановлены.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Оба пола рыб, в том числе беременные самки были успешно через желудочный зонд (рис. 1). Успешная процедура занимает менее одной минуты, не видел выхода жидкости жабры или рот. Трубка входит легко, без силы, без крови видели на удалении катетера. Процедура быстрого, требующий примерно 10 мин с зондовым от 3 до 4 рыбы, в среднем 30-45 сек на рыбу.
Данио рерио не должны через желудочный зонд с более чем 5 мкл любое решение. Через зонд 10 мкл решений привел лишь 50% успеха (рис. 2). Желудочный зонд 10 мкл Также был полностью неудачным в беременных самок. В этом исследовании, взрослых рыб весили в среднем на 0,2 г каждая. Использование рекомендация CCAC, это будет означать, что 4 мкл раствора можно вводить в каждой рыбы. Текущее использование 5 мкл будет соответствовать этим рекомендациям. Эта техника была примерно в 10% mortalitY Скорость основном связано с беременной самки, найден мертвым на следующий день. Хотя это и смертность значительно ниже, чем других известных методов зонд, в идеале, грубо беременных самок не должны через желудочный зонд, если это не является необходимым для целей исследования.
Рисунок 1. Сравнение процентов успеха различных групп репродуктивного с использованием 5 мкл раствора. Процент успеха в совокупности все группы составила 88%. Процентов успеха для беременных самок составила 100%, для не-беременных самок и 90% для мужчин 82%.
Рисунок 2. Сравнение общего успеха процентов, используя 5 мкл по сравнению с 10 мкл. Полным успехом процентов с использованием 5 мкл 88%. Всего процентов, используя успех 10мкл 50%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Значение
Этот метод улучшения и обеспечивает несколько преимуществ по сравнению с двумя ранее описанных методов gavaging взрослых данио. Во-первых, использование губки сдерживать рыбы позволяет одному человеку для выполнения процедуры, в отличие от описанных ранее метод, требующий двух человек. 7 Во-вторых, трубки катетера имплантации является более гибким, чем катетеры, которые могут помочь минимизировать вторичные травмы из-за перфорации по аналогии с использованием тупым наконечником шприца. 7,8 В-третьих, с использованием прозрачной трубки, раствор может легко быть визуализированы ввода рыбы. И, наконец, через желудочный зонд аппарат стабильна что позволяет повторно использовать быстро и эффективно, когда многие рыбы необходимо через желудочный зонд. Желудочный зонд техники в целом уменьшает изменение расхода и концентрации видели в других методов перорального введения соединения данио, и как таковой может также уменьшить количество рыбы, необходимые для рerform эксперимента. 1-5
Критические шаги
Кроме того, важно, чтобы быстрые рыбы, по крайней мере 24 часа в сутки, так как при 12-часовом быстро не все данио есть пустой кишечного лампочки. 24 быстрый час позволит предотвратить обратный ток крови и потери раствора через рот и жабры из-за частичного полный кишечного тракта 13. Наиболее распространенной проблемой является жидкость, выходящая через рот или жабры, указывая, что трубка не была вставлена достаточно далеко вниз кишечного тракта. Жидкость, выходящая через рот или жабры можно избежать, соблюдая правильное размещение труб, а также использовать трубки достаточной длины, чтобы обойти жабры. Более серьезные осложнения могут включать жаберных травма, внутреннее кровотечение, перфорация кишечника, отрыжка и внезапной смерти. Эти осложнения могут или не могут сразу наблюдать. Как правило, внезапной смерти не происходит часов после завершения процедуры, в то время как рыба выглядели неRmal во время первоначального восстановления.
Губки вымачивали в отбеливатель, а затем в раствор тиосульфата натрия до контакта с рыбой. Это позволило удалить любые агенты или химические вещества, которые, возможно, были вредны для рыб. MS-222 раствор следует хранить в темном контейнере, вдали от света и на срок до 5 дней в холодильнике. Если коричневатый оттенок наблюдается раствор должен быть отброшен, так как эффективность снижается. 11,12
Недостатки
Этот протокол требует анестезии данио для обеспечения успеха. Это может быть невыгодным в определенных обстоятельствах, когда анестетика может оказать неблагоприятное воздействие на результаты исследований измеряется. 12 В настоящее время не существует зонд протокол для данио, который не требует анестезии. 7,8 Если MS-222 анестезию, как известно влиять на измеряемые параметры, другие анестетики могут быть использованы, или один из предыдущейiously упомянутых методов добровольного потребления методы могут быть использованы. 1-5
Эта методика, как и в ранее описанных методов является сложной задачей, когда выполняются на беременных самок. 7 Возможной причиной высокой смертности в данной группе может быть перфорация кишечника приводит к сепсису из-за желудочно-кишечном тракте вытесняется яйца в полости тела. Аналогичным образом, если яиц, а также кишки являются перфорированными, то острый яйцо связанного coelomitis могут также произойти. Такие события могут быть минимизированы путем нереста беременных самок перед gavaging. Кроме того, меньшего калибра катетер может быть использован для выполнения процедуры.
Если данио меньшего размера, которые используются следует соблюдать осторожность, чтобы регулировать размер трубки и иглы так, что диаметр и длина будет соответствовать в рот и желудочно-кишечном тракте.
Эффективность процедуры может быть дополнительно увеличена, если второе индивидовL включают в себя мониторинг анестезии и обеспечить постоянный приток наркозом рыбу к индивидуальным выполнением зонд. Этот метод относительно прост в освоении и не требует обширной практики, чтобы получить знания. Кроме того, процедура не требует специализированного оборудования или производственных объектов.
Поиск и устранение неисправностей
Если у рыбок данио не становятся наркозом в течение 2-3 мин, измените раствора анестетика или использовать свежеприготовленный раствор. Если трубка не скользит легко по кишечного тракта у рыбок данио, меньшим диаметром трубки должны быть использованы. Это может быть полезно на практике с помощью небольшого количества аналогичного размера рыбы для того, чтобы обеспечить правильное диаметра и длины трубопровода, а также для оценки того, вводимый объем подходит для размера данио в. Трубки могут быть также помечены отметить Идеальная глубина проникновения для размера рыбы используются.
Как только этот метод освоен, он может быть использован для доставки точного количества различных соединений или инфекционных агентов в взрослых данио эффективно и последовательно, что делает его полезным для различных протоколов исследований. Этот метод также может свести к минимуму количество рыбы, необходимые для выполнения экспериментов и обеспечивают точное измерение времени воздействия различных соединений на рыбу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Университет Рокфеллера Сравнительный Bioscience Центр оказал поддержку этому проекту. Мы благодарим Janelle Monnas за техническую помощь.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| A sponge | |||
| 1-cc luer lock syringe | Becton Dickinson Co | ||
| 22-G Micro-Renathane Implantation tubing (cut) | Braintree Scientific, Inc. | ||
| 1 22-G needle (cut, if needed) | Becton Dickinson Co | ||
| pH meter | Hanna probe | ||
| 1 scalpel blade | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| MS-222 (Finquel) | Argent Laboratories | ||
References
- Royes, J. -A. B., Chapman, F. Preparing Your Own Fish Feeds. , Department of Fisheries and Aquatic Sciences, Florida Cooperative Extension Service, Insitute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida. (2009).
- Gomez-Gil, B., Cabanillas-Ramos, J., Paez-Brambila, A., Roque, A. Standardization of the bioencapsulation of enrofloxacin and oxytetracycline in Artemia fransciscana Kellogg. Aquaculture. 196, 1-12 (1906).
- Langdon, C. Microparticle types for delivering nutrients to marine fish larvae. Aquaculture. 227, 259-275 (2003).
- Langdon, C., Nordgreen, A., Hawkyard, M., Hamre, K. Evaluation of wax spray beads for delivery of low-molecular weight, water soluble nutrients and antibiotics to Artemia. Aquaculture. 284, 151-158 (2008).
- Zang, L., Morikane, D., Shimada, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. A Novel Protocol for the Oral Administration of Test Chemicals to Adult Zebrafish. Zebrafish. 8, 203-210 (2011).
- Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think Small: Zebrafish as a Model System of Human pathology. Journal of Biomedicine and Biotechnology. , (2012).
- Tysnes, K. R., Jorgensen, A., Poppe, T., Midtlyng, P. J., Robertson, L. J. Preliminary expermients on use of zebrafish as a laboratory model for Giardia duodenalis infection. Acta Parasitologica. 57, 1-6 (2012).
- Marie, B., Huet, H., et al. Effects of a toxic cyanobacterial bloom (Planktothris agardhii) on fish: Insights from histopathological and quantitative proteomic assessments following the oral exposure of medaka fish (Oryzias latipes). Aquatic Toxicology. 114-115, 39-48 (2012).
- Canadian Council on Animal Care. CCAC guidelines on: the care and use of fish in research, teaching and testing. , CCAC. Ottawa, Ontario, Canada. (2005).
- Harper, C., Lawrence, C. The Laboratory Zebrafish. , CRC Press. Boca Raton, Florida, USA. (2011).
- De Tolla, L. J., Srinivas, S., et al. Guidelines for the Care and Use of Fish in Research. ILAR Journal. 37 (4), (1995).
- Topic Popovic, N., Strunjak-Perovic, I., et al. Tricaine methane-sulfonate (MS-222) application in fish anaesthesia. Journal of Applied Ichthyology. 28, 553-564 (2012).
- Field, H. A., Kelley, K. A., Martell, L., Goldstein, A. M., Serluca, F. C. Analysis of gastrointestinal physiology using a novel intestinal transit assay in zebrafish. Neurogastroenterology & Motility. 21, 304-312 (2009).
