Summary
Un protocole pour la livraison intracanalaire non-invasive de réactifs aqueux de la glande mammaire de la souris est décrite. La méthode prend avantage de l'injection localisée dans les mamelons des glandes mammaires ciblant spécifiquement conduits mammaires. Cette technique est adaptable à une variété de composés comprenant siRNA, les agents chimiothérapeutiques et les petites molécules.
Abstract
Nous décrivons ici un protocole de livrer divers réactifs à la glande mammaire de souris par des injections intra-canalaires. Délivrance de médicament localisée et le knock-down de gènes au sein de l'épithélium mammaire a été difficile à réaliser en raison de l'absence de molécules de ciblage appropriés qui sont indépendantes des étapes de développement, tels que la grossesse et l'allaitement. Nous décrivons ici une technique pour la délivrance localisée de réactifs de la glande mammaire à un stade quelconque à l'âge adulte par injection intracanalaire dans les tétons de souris. Les injections peuvent être effectuées sur les souris vivantes, sous anesthésie, et de permettre une délivrance de médicament non-invasive et localisée à la glande mammaire. En outre, les injections peuvent être répétées sur plusieurs mois sans endommager le mamelon. Colorants vitaux tels que Bleu Evans sont très utiles pour apprendre la technique. Lors de l'injection intra-canalaire du colorant bleu, l'arbre canalaire entier devient visible à l'œil. En outre, des réactifs marqués par fluorescence permettent égalementvisualisation et la distribution au sein de la glande mammaire. Cette technique est adaptable à une variété de composés comprenant siRNA, les agents chimiothérapeutiques, et des petites molécules.
Introduction
La glande mammaire de la souris est composé d'un arbre canalaire-alvéolaire complexe qui converge dans un canal central au niveau du mamelon. Chez la souris, ainsi que les humains, la majorité des tumeurs du sein sont créés dans les cellules epitheliales qui tapissent les conduits de lait. Traitements actuellement disponibles incluent la chimiothérapie par voie intraveineuse, la radiothérapie et la chirurgie. Traitements canalaires localisées ont été explorées 1-3 et offrir des avantages significatifs en termes de toxicité et des effets secondaires réduits. Toutefois, plusieurs défis restent à relever avant ceux-ci peuvent être appliqués plus largement. La possibilité d'effectuer des procédures comparables dans la glande mammaire de la souris facilite la caractérisation des interventions intra-canalaires. Nous présentons ici une méthode non-invasive pour la fourniture de réactifs directement dans le conduit mammaire de la souris.
Intracanalaire livraison d'agents chimiothérapeutiques dans les deux patients atteints de cancer du sein et des modèles de souris a été démontré précédemment pour être très efficace sans aucun signe detoxicité systémique ou histopathologique changements à long terme de 3-6. En outre, l'injection des cellules tumorales et la livraison de vecteur lentiviral d'oncogènes ont été précédemment montré pour être réalisable par injection intracanalaire 7-10.
En plus de l'administration de médicaments, ce procédé est utile pour le silençage de gènes locale de la glande mammaire par injection de siRNA intracanalaire. Injection de petits volumes de solution siRNA est efficace sans modifier l'anatomie et de la physiologie de la glande mammaire. Dans notre laboratoire, nous avons récemment montré inactivation réussie de gènes de médiateurs clés dans des souris transgéniques qui développent spontanément des tumeurs mammaires résultant dans la prévention de la progression de la tumeur (Brock et al., Non publié). Nous avons été en mesure de répéter les injections toutes les deux semaines dans les mêmes mamelons jusqu'à 7 fois à intervalle de 2 semaines sans endommager les tissus visible ou toxicité.
Injections intra-canalaires peuvent être synchronisées dans une souris adulte pour traiter développementévénements opmentally spécifiques relatives au développement de la glande mammaire pendant la grossesse, l'allaitement, et de l'involution ou de cibler les étapes ultérieures au cours du développement et la progression tumorale. Les femelles vierges aussi jeunes que 8 semaines d'âge ont été injectés de façon non invasive dans notre laboratoire.
Protocol
Une. Préparation de la solution d'injection
- Préparer 0,2% colorant bleu Evans dans un tampon phosphate salin (PBS) ou une autre solution aqueuse d'intérêt. Ce colorant vital est utile pour évaluer le succès des injections intra-canalaires et est recommandée comme une aide à la visualisation lors de l'élaboration expertise dans la technique.
Le volume requis dépendra du nombre et de l'emplacement des glandes à injecter. Tous les 10 glandes mammaires de souris femelles peuvent être injectés mais en raison de la taille plus petite des glandes, des paires de glandes 1 et 5 sont typiquement injectés avec 10 ul de solution. Tous les autres paires mammaires sont injectés avec 20 pl. Ces volumes sont suffisants pour remplir la totalité de l'arbre canalaire.
2. Préparation préopératoire
- Noter le poids corporel de chaque souris. Comme avec toutes les études précliniques, les poids des animaux doivent être surveillés régulièrement (deux fois par semaine ou plus) pour évaluer la toxicité potentielle.
- Anesthésier la mouse utilisant une chambre isoflurane et appliquer du lubrifiant de l'oeil. Au cours de la procédure de souris continuera d'être anesthésiés par inhalation en utilisant la concentration d'isoflurane dans de l'oxygène de 2 à 4% par l'intermédiaire d'un cône de nez. Surveiller attentivement la souris pour les modifications de la fréquence respiratoire, le réglage du niveau de l'isoflurane en conséquence.
- Injecter le méloxicam (5-10 mg / kg) par voie sous cutanée avant la procédure comme l'analgésie.
- Appliquer une crème dépilatoire sur-the-counter cheveux pour la région du mamelon. Attendez 5 min et retirez délicatement les cheveux en vrac avec un applicateur coton-tige en utilisant un mouvement circulaire. Retirer la crème à l'aide de serviettes en papier humides en contact avec l'eau tiède. Rasage n'est pas recommandée en raison du risque d'endommager les mamelons.
- Fixez la souris sous le stéréoscope en collant doucement les extrémités.
- Sites d'injection propres avec des tampons d'alcool.
3. Injection intra-canalaire
- Localiser mamelons appropriées pour être injecté sous le stéréoscope. Utilisez amende micro-dissection tweenisateurs pour éliminer les peaux mortes qui couvre l'ouverture du mamelon.
- Charge: 10 à 20 ul de solution d'injection dans une seringue de 50 ul avec une aiguille 33 G de moyeu métallique apposée. Parfois, après l'injection, de petites quantités (1 pi) ou moins peuvent s'échapper de la tétine sur tirant l'aiguille. Par conséquent, il est recommandé d'injecter 11 ou 21 ul, respectivement, pour tenir compte de la perte potentielle.
- Maintenez le mamelon doucement avec les fines pinces et soulever légèrement pour positionner pour injection. Il n'est pas nécessaire de couper le mamelon.
- Injecter lentement la solution pour minimiser les dommages potentiels causés par le déplacement rapide de fluide dans les lumières canalaires. Le débit d'injection doit être maintenu à environ 40 pl / min.
4. Soins post-opératoires
- Observer le site d'injection. Il devrait y avoir aucun signe de traumatisme à la région du mamelon ou du tissu environnant. Enflure dans la région qui entoure le mamelon indique probablement un coussinet adipeux mammaire rathe d'injectionr d'une injection intra-canalaire réussie.
- Sortir l'animal du cône de nez et se déplacer dans une cage séparée pour la récupération. Placez la cage sous une lampe chauffante pour éviter l'hypothermie et d'aider à la récupération. Les souris sont logés individuellement et seront étroitement surveillés jusqu'à ce qu'ils reprennent conscience et la mobilité.
5. Analyse de la glande mammaire tissus
- A la fin de l'étude, les souris sont euthanasiées par dislocation cervicale suivant CO 2 du gaz comprimé dans une chambre d'isolation. Les glandes mammaires sont excisés et peuvent être utilisés pour l'ensemble de la préparation de montage 11, l'histologie, ou de l'ARN et l'isolement de la protéine.
Representative Results
Les tétons peuvent être facilement localisées à l'aide d'un stéréomicroscope, une fois les cheveux a été supprimée dans la zone qui l'entoure (figure 1A). Pour maîtriser la technique d'injection, il est recommandé d'injecter colorant bleu Evans et surveiller l'intégrité de la glande (figures 1B et C). Cette approche permet aussi la détermination des volumes appropriés pour être injecté dans chaque glande comme on peut visuellement déterminer si le colorant atteint le système canalaire entier (figures 1C et 2A). Une image de l'image de bleu Evans injecté peut alors être comparé à l'ensemble monté sur la glande mammaire, dans lequel l'arbre canalaire entier est coloré avec du colorant carmin alun (Figure 2B).
S'il vous plaît noter que la robustesse de ce procédé d'injection est très dépendante de l'opérateur. Par exemple, la perforation de la gaine va se traduire par une injection de coussinet adipeux mammaire et en injectant la solution trop rapide peut endommager la cel épithéliale canalairels et provoquer une réaction inflammatoire. Injection intra-canalaire réussie permet la délivrance de médicament localisé à la glande mammaire et de réduire les effets secondaires non spécifiques, souvent observées autrement.
Un exemple d'image d'une glande injecté avec étiqueté par fluorescence siRNA ciblant la cyclophiline (un gène non essentiel) est représenté sur la figure 3.
Figure 1. Une glande mammaire inguinale injecté par le mamelon avec colorant bleu Evans. A) Apparence du mamelon avant l'injection et B) après l'injection de 20 ul colorant bleu Evans. Pas de gonflement ou des dommages aux tissus est observée. C) Lors de l'ouverture de la peau, le colorant permet la visualisation de l'ensemble de l'arbre canalaire mammaire.
Figure 2. Analyse de bleu Evans dans son ensemble-monterglande projetée. A) l'image représentative d'une glande disséqué excisé de l'animal et l'étaler sur une lame de verre immédiatement après l'injection. B) Le total coloration montagne de la même glande avec carmin après graisse avait été autorisé. Comparaison avec A) confirme que la solution injectée remplit l'arbre canalaire et la glande mammaire est anatomiquement intact.
Figure 3. Livraison Intracanalaire de siRNA fluorescent. Représentant l'image de l'échantillon de tissu frais, 48 heures après l'injection excisée.
Discussion
souris transgéniques knockout et sont des outils précieux pour étudier le rôle in vivo de gènes individuels dans le cancer du sein. Cependant, il est coûteux et prend du temps pour créer ces animaux et l'inactivation génique est généralement omniprésente qui nous empêche parfois de reconnaître les effets spécifiques de ce gène sur la glande mammaire. Par conséquent, un effet de choc ciblée permettrait d'atténuer les problèmes d'effets secondaires et la toxicité non spécifique dans d'autres organes.
L'injection intra-canalaire de siRNA présenté ici permet à l'inactivation génique localisée dans la glande mammaire de la souris. Il s'agit d'une méthode rapide pour une administration de médicament ciblée et localisée à la glande mammaire ne se limite pas à la délivrance d'ARNi. Une telle délivrance de médicament spécifique à la glande mammaire d'éviter les effets secondaires et la toxicité non spécifique à d'autres organes, et permet l'étude des altérations des gènes à des moments spécifiques au cours du développement de la glande mammaire et la formation de tumeurs du sein. Il n'existe aucune preuve de siparticules d'ARN dans les glandes non-injectés, le foie ou d'autres organes qui fournissent des preuves supplémentaires que ce procédé présente un moyen pratique pour inactivation génique localisée dans la glande mammaire. En outre, les injections intra-canalaires peuvent être répétées toutes les semaines ou toutes les deux semaines pendant plusieurs mois pour permettre un suivi à long terme des agents thérapeutiques.
Cette technique offre la possibilité de dosage de la livraison intracanalaire de divers réactifs aux conduits mammaires de souris. Les progrès de la délivrance localisée dans des modèles murins bien caractérisés doivent accélérer l'application du non-invasive, ciblée stratégies thérapeutiques chez l'homme.
Disclosures
Les auteurs n'ont aucun lien financier.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Michael Goldberg pour préparer la solution de siRNA stabilisé et Heather Tobin pour son aide avec les animaux. Cette étude a été financée par le DOD Innovator Award W81XWH-08-1-0659 de DEI. La formation postdoctorale de SK a été soutenu par la fondation Susan G Komen (KG101329). Les auteurs tiennent à remercier Kristin Johnson pour la préparation du schéma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| isoflurane | 2-4% | ||
| meloxicam | 5-10 mg/ml | ||
| Evans blue dye | Sigma-Aldrich | E2129-10G | 0.2% in PBS |
| hair removing cream | Veet | Choose sensitive option | |
| stereoscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| micro-dissecting tweezers | Roboz | rs-4976 | With a 0.10 x 0.06 mm tip made of dumostar |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7637-01 | |
| 33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 4, 12 degree bevel (standard) |
| siGLO cyclophilin B control siRNA | Dharmacon | D-001610-01-05 |
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