Summary
Dette papir beskriver procedurerne for taktil stimulation af rotteunger og efterfølgende Golgi-Cox farvning af neuronal morfologi. Taktil stimulation er en positiv oplevelse, der administreres i den perinatale periode ved at kæle hvalpe med en husstand støvekost. Golgi-cox farvning er en pålidelig procedure tillader visualisering af hele neuroner.
Abstract
For at generere mere langsigtede ændringer i adfærd, skal erfaringer producere stabile ændringer i neuronal morfologi og synaptiske forbindelse. Taktil stimulation er en positiv tidlig oplevelse, der efterligner mødres slikke og grooming hos rotter. Udsættes rotteunger for denne positive oplevelse kan være afsluttet let og omkostningseffektivt ved hjælp af let tilgængelige materialer, såsom en husstand støvekost. Ved hjælp af en cross-kuld design, er ungerne enten strøg eller venstre uforstyrret, i 15 min, tre gange om dagen i hele den perinatale periode. For at måle de neuroplastiske ændringer i relation til denne positive tidlig oplevelse er Golgi-Cox farvning af hjernevæv udnyttet. På grund af det faktum, at Golgi-Cox imprægnering pletter et diskret antal af neuroner snarere end alle de celler, farvning af gnaverhjerner med Golgi-Cox løsning tillader visualisering af hele neuronale elementer, herunder cellen kroppen, dendritter axoner og dendritiske Torner. Pletningsproceduren is udført over flere dage, og kræver, at forskeren være meget opmærksom på detaljer. Men når farvning er afsluttet, hele hjernen er blevet imprægneret og kan bevares i det uendelige for den igangværende analyse. Derfor Golgi-Cox farvningen er en værdifuld ressource for at studere erfaring-afhængige plasticitet.
Introduction
Selvom der er mange rapporteret og udnyttede teknikker til undersøgelse af negative tidlige erfaringer på hjernens modning, såsom perinatal stress 1,2, sensorisk deprivation 3 og narkotika toksicitet 4, der er meget få metoder, der anvendes til at undersøge virkningerne af positive erfaringer i denne periode. Bortset fra miljøberigelse, taktil stimulation er en af de få hjerne forbedre behandlinger med påviste effekter 5. Taktil stimulering er en metode til sensorisk stimulation til huden, der efterligner moderens rotte adfærd, slikke og grooming. Dens generel accept som en positiv manipulation opstår fra undersøgelser tyder på, at taktil stimulation forbedrede modning af for tidligt fødte spædbørn og nyfødte rotter 6. Desuden har forskning i Meaney laboratorium 7 viste, at højere niveauer af maternel slikke og grooming er knyttet til positive resultater i afkom. På grund these positive påvirkninger, taktil stimulation hurtigt udviklet sig til en afhjælpende strategi, der sigter på at reducere angst 8, forbedre udfald associeret med hjerneskade 9-11, og formildende medicin overfølsomhed 12. Som sådan, taktil stimulation er en værdifuld teknik til fremme af positive tidlige erfaringer, med en dokumenteret evne til at drastisk reorganisere neuronal morfologi og synaptiske tilslutning af hjernens udvikling.
For at undersøge og kvantificere ændringer i neuronal morfologi, er det nødvendigt at visualisere intakte neuroner. Golgi-Cox farvning procedure er en modifikation af Camillo Golgi teknik offentliggjort i slutningen af 1800, der giver diskret farvning af et lille antal af komplette neuroner 13. Selv om proceduren ser ud til at plette neuroner tilfældigt og reproducerbarhed er almindeligt nævnt som store fejl, den lille imprægnering sats tillader visualisering af hele neuronale element, herunder celle organer, dendritter, dendritiske Torner og axoner. Ligeledes har den nødvendige tid til at imprægnere en given hjerne med Golgi løsning også blevet nævnt som en undergang. Men i betragtning af, at når farvningen er færdig væv kan bevares på ubestemt tid, og tiden mellem perfusion af hjernen og visualisering af neuroner med et mikroskop kan være afsluttet på mindre end 21 dage, er ikke urimeligt tidsperioden. Hertil kommer, med mindre ændringer af protokollen, Golgi-Cox farvning kan bruges effektivt til at imprægnere hjerner af gnavere fra alle aldersgrupper. Da ændringer på det strukturelle niveau har været knyttet til vedvarende ændringer i adfærd og psykologisk funktion, Golgi-Cox farvning teknik giver forskerne et værdifuldt værktøj til at måle neuroplasticitet.
Protocol
Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med den canadiske Rådet for Animal Care og godkendt af University of Lethbridge, Animal Care udvalget.
1.. Avl og Tactile Stimulation
- Bestil gravide rotter fra almindelige dyr leverandører eller avle hvalpe i huset ved hjælp af standard laboratorie avlsmetoder.
- Hus alle dyr i en temperaturstyret avl værelse (21 ° C), opretholdes på en 12:12 timers lys: mørke-cyklus og give adgang til mad og vand ad libitum.
- Når hvalpe bliver født, hus hunrotter individuelt med deres afkom.
- For at undgå yderligere stress i forbindelse med håndtering af umiddelbart efter fødslen påbegynde taktil stimulation af unger på P3.
- Taktil stimulation bør udføres tre gange om dagen (9:00, 1:00, og 4:00) fra P3-P21 og hvalpe bør vænnes fra deres mødre på P21.
- Når du bruger et kors kuld design, halvdelen af hvalpene frabout hvert kuld vil gennemgå taktil stimulation med den anden halvdel fungerer som kontroller. Tilfældigt tildele lige antal mandlige og kvindelige hvalpe til hver gruppe. At differentiere unger gennemgår taktil stimulation og kontroller, markere en gruppe af unger med en permanent markør på bagbenene og hale. Mærkning skal igen anvendes hver anden dag.
Tactile Stimulation
- Fjern dæmninger fra deres hjem bur og placere dem i en midlertidig bur med mad og vand. Hold dæmningen og midlertidig bur i avl / bolig værelse.
- Rotteunger afvejes som en gruppe før morgen taktil stimulation session (9.00). For hver session, transport rotte pups deres bure til et separat test værelse til taktil stimulation. Placer hjembur på en varmepude, der er indstillet til 24 ° C.
- Brug en stiv bord for at opdele hjem bur i to halvdele. Placer rotteunger i taktile stimulation gruppe halvdelen og kontrol unger i den anden halvdel.Sæt en timer til 15 min.
- Ved hjælp af en blød fjer-lignende duster, børste alle hvalpe i taktil stimulation koncernen på samme tid i 15 på hinanden følgende minutter. De unge rotteunger (~ P3-P12) ususally klumper sig tæt sammen og ser ud til at komme i en dyb søvn cyklus gør det meget nemt at få alle unger på en gang. Som unger alder, bliver de mere aktive, med nogle unger går og undersøge under sessionen. Forsøgslederen bør løbende flytte vandrer unger ind i gruppen for at sikre, at hver hvalp får lige stimulering.
- Når de 15 min session er færdig, transportere hvalpene tilbage til avls rum og returnere moderen til bur.
- Gentag denne proces tre gange om dagen i de 19 dage af taktil stimulation. Efter den sidste taktil stimulation session på P21, skal hvalpene vænnes fra deres mødre. Hvalpe bør derefter anbragt i bure med 5 eller 6 andre fravænnede dyr af samme køn.
- Hvis rotter undergår ingen yderligere testning, skal de venstre unforstyrret, på den normale lys: mørke cyklus med adgang til mad og vand ad libitm (bortset fra regelmæssig bur rengøring og håndtering), indtil de når cirka 100 dage gamle. Hvis undergår andre eksperimentelle manipulationer, bør dyrene behandles eller afprøves i overensstemmelse med disse laboratorieprotokoller.
2. Sacrifice og Golgi-Cox Farvning
- Ved ca P100, administrere en overdosis af natriumpentobarbital via IP injektion til rotter og perfundere intrakardial med cirka 100 ml 0,9% saltvand.
- Uddrag hjerner når perfusionen er færdig. Fjern hjerner fra kraniet, opskæring synsnerven nedenunder med forsøg på at holde lillehjernen intakt, forskere kan vælge at beholde eller fjerne de olfaktoriske pærer. Placer udvindes hjerner i en uigennemsigtig Nalgene flaske med 20 ml Golgi-Cox løsning 14.
- Hold hjerner i Golgi-Cox løsning i 14 dage. Efter 14 dage erstatte Golgi-Cox opløsning med en 30% sucrose-opløsning. Hold hjernen i rørsukkeropløsningen i 2-5 dage før skæring.
Bemærk: Hvis hjerner ikke kan sektioneret senest 14 dage efter overførsel til rørsukkeropløsningen forskeren nødt til at erstatte saccharose med en ny bestand på 30% saccharose. Forskeren kan erstatte saccharose hver anden uge i 4 måneder uden nogen bivirkninger på farvning.
- For at afsnittet hjernen bør hjernen duppes tørre og fastgjort til sektionering scenen med cyanocacrylic lim. For at forhindre rivning eller ujævn sektionering må forskeren være forsigtige og sikre, at hele hjernen er solidt fastgjort til scenen.
- Den vibratome reservoir skal fyldes med 6% sucrose løsning på et niveau, der dækker sektionering bladet. Indstil vibratome parametrene til en hastighed og amplitude til 5, (midtpunktet på begge skalaer). Skær hjernen til 200 um snit og placere afsnittene om en 2% gelatinerede microomfang dias. Vær sikker på at holde sektionerne våd i løbet af sektionering.
- Når alle afsnittene af interesse er blevet indsamlet, skal du trykke sektioner på dias ved at anvende pres på dias med fugtede sugende papir. Opbevar objektglassene i en slide rack i fugtighedskammeret, indtil de er klar til at blive plettet. De skal forblive i fugtighed kammer i mindst 12 timer, men ikke længere end 4 dage. De dias skal være fugtig, og bør ikke være tilladt at tørre ud.
- Forbered farvning regiment inden du begynder på farvning proces. Label tolv glas farvningsprocedurer retter (10,7 x 8,5 x 6,8 cm) og proces på følgende måde:
- Destilleret vand - 1 min
- Ammoniumhydroxid - 30 min (i mørke)
- Destilleret vand - 1 min
- Kodak Fix for Film - 30 min (i mørke)
- Destilleret vand - 1 min
- 50% alkohol - 1 min
- 70% alkohol - 1 min
- 95% alkohol - 1 min
- 100% Alcohol - 5 min
- 100% Alkohol - 5 min
- Løsning (1/3 Chloroform, 1/3 HemoDe, 1/3 100% alkohol) - 15 min
- HemoDe - 15 min
* Xylen kan anvendes i erstatte af HemoDe. For at sikre en ensartet farvning kvalitet, skal der anvendes nye løsninger for hver slide rack behandles.
- Efter den sidste 15 min emersion i HemoDe, dækglas dias med Permount.
- Lad objektglassene lufttørre før undersøgelsen af med et mikroskop.
Representative Results
Når denne farvning procedure er blevet fulgt korrekt, er konsekvent og ensartet farvning af dendritter og pigge genereres. Se figur 1 for en repræsentation af Golgi-Cox neuronal farvning. Denne procedure frembringer farvning, der er sammenlignelig med den nyudviklede in vitro-metoder og kan tillade visualisering af dendritiske felter, der er uninterruptable følgende væv indlejring. Den vibratome baseret teknik til Golgi-Cox farvning har vist sig at frembringe en mere udbredt farvning af terminale grene og pyramideneuroner end farvning med enten celloidin-embedded og kryostat-snit væv 15. Endvidere, da denne metode til farvning imprægnerer hele hjernen, alle sektioner kan analyseres enten umiddelbart eller i fremtiden. Da placeringen af morfologisk ændring er det ikke altid er indlysende, når du genererer en original hypotese, denne proces giver mulighed for udforskning af yderligere områder af hjernen end forhindrer bortskaffelse af væv, der kan være anvendelige i fremtiden.
Denne farvning metode kan anvendes til pålidelig farvning af eventuelle alderen rottehjerner (P0 alderdom). Men når farvning unge hjerner (<1 gram), hjernen bør kun forblive i Golgi-Cox opløsning i 6 dage, snarere end 14 dage anbefales til voksne hjerner, alle andre procedurer holdes konstant. Den største vanskelighed, der kan opstå i løbet af denne Golgi-Cox farvning proces er den manglende evne til at producere høj kvalitet farvning af centrale områder af hjernen, herunder thalamus. Da hele hjernen imprægneres på samme tid, kan de centrale områder, som ikke modtager ideel koncentrationer af pletten. På trods af denne konstatering, Golgi-Cox teknik giver exceptionel farvning af subkortikale regioner såsom hippocampus og striatum. En endelig begrænsning af procedure skyldes ufuldstændig fjernelse af blod fra hjernen under perfusion processen. Blod kan producere artefakter i hjernevævetder gør det vanskeligt at fotografere og spore neuroner.
Golgi-Cox farvningsteknikker giver en pålidelig målestok for dendritiske morfologi og neuroanatomi der er nyttige for en lang række undersøgelser for at undersøge ændringer på det neuronale niveau. Ved behandlingen af neuronal struktur i den præfrontale cortex efter taktil stimulation i den tidlige postnatale periode, Golgi-Cox farvning afslørede dramatiske stigninger i dendritiske kompleksitet. Anatomiske ændringer i forbindelse med tidlig taktil stimulation kan påvises visuelt ved at sammenligne spidsdensitet af pyramideneuroner fra en kontrol rotte at pyramideneuroner fra en rotte, der undergik taktil stimulation (se figur 1). Desuden kan parametre såsom dendritiske arborization, dendritiske længde og spidsdensitet beregnes og analyseres statistisk for at generere kontinuerlig data, der kan sammenlignes på tværs af dyr. For at generere pålidelige resultater, skal analysen foretages på amMinimumspris tre dyr pr behandlingsgruppe og cirka fem neuroner pr halvkugle bør der tilfældigt valgt for hvert område af hjernen under analysen. Figur 2 viser den dendritiske kompleksitet (spines / mM x um dendritceller) af dyr, der har modtaget taktil stimulation og dyr, der ikke . I både den apikale og basilaris områder af neuroner analyserede fra mPFC (CG3), taktil stimulation resulterede i spredning af neuronale parametre.
Figur 1. A. repræsentant fotografi af en Golgi-Cox farves pyramideformet neuron fra lag III i området CG3 i en rotte, der har modtaget taktil stimulation under udvikling. B. Repræsentant forstørres (1000 X) fotografi af dendritiske Torner på terminalen dendritter i basilar område CG3 ; det lysere billede til venstre er en rotte i kontrolgruppen og mørkere billedet på RIGHT er fra en rotte, der fik taktil stimulation.
Figur 2. Illustrative repræsentation af den gennemsnitlige apikale og basilar dendritiske kompleksitet (pigge / um x um) for neuroner i CG3 området fra voksne rotter, der enten modtog taktil stimulering under udvikling, eller som ikke (* p <0,01).
Discussion
På grund af den åbenlyse plasticitet hjernens udvikling, er det vigtigt, at eksperimentelle procedurer, der involverer tidlige erfaringer grundigt revideret og der gøres forsøg på at kontrollere for alle mellemliggende variabler. Af denne grund er et kors kuld design ansat under den taktile stimulation procedure for at sikre, at hvalpe får lignende oplevelser i alle andre områder inden for udvikling. Derudover er det også vigtigt, at flere unger fra flere kuld udvalgt til analyse for at undgå muligheden for, at virkninger skyldes en skævhed i en enkelt pup eller strøelse.
Berøringsstimuleringen menes at efterligne naturligt forekommende moderens adfærd, slikke og grooming, hvilket menes at være gavnlig for afkom udvikling. Selvom tidligere forskning har understreget den første leveuge (P0-P7) for at være en kritisk periode for at slikke og grooming 16, selve omfanget af forandringer identificeres 18 dages tactile stimulation kan betyde, at selv om følsomme tider eksisterer, længere eksponering er overlegen. Det er også vigtigt at bemærke, at hvalpe, der modtager taktil stimulation i denne eksperimentelle paradigme også opleve slikke og grooming af deres mødre, dermed taktil stimulation er i tillæg til normal stimulation administreres af moderen. Endelig må man også være bevidste om regionsafhængige ændringer. Selv taktil stimulation under udvikling øget dendritiske kompleksitet i den præfrontale cortex, er dette ikke garantere, at strukturelle ændringer af denne art vil være tydelig i alle områder af hjernen. Det er muligt, at neuronal morfologi i andre områder af hjernen, såsom parietalcortex ville reagere på en markant anderledes måde til den samme oplevelse. , Fordi den taktile stimulation procedure nemt administreres og udgør ingen risiko for afkommet eller dæmninger Men det har potentiale til at fungere som et værdifuldt redskab for mange videnskabelige undersøgelser, der tager sigte på at forbedre udviklingal resultater.
Med hensyn til Golgi-Cox farvning af hjernevæv, de kritiske trin for succesfuld visualisering af neuronale celler er som følger: 1) der skal være tilstrækkelig perfusion af hjernen med saltopløsning. Ukorrekt eller utilstrækkelig perfusion af hjernen væv resulterer i blodkarrenes artefakter, der gør det vanskeligt at faktisk visualisere neuronale celler gennem labyrinten af blodkar, mens komplicerer også evnen til at fotografere farvede neuroner. 2) perfuseret hjerner skal opbevares i Golgi-Cox-opløsning og sucroseopløsning i mørke. Lagring af hjernevæv i mørke reducerer baggrundsfarvning af vævet igen øger chancen for succes visualisere kvalitet neuronale celler. 3) Hjernevæv lagres i rørsukkeropløsning efter opbevaring i Golgi-Cox løsning 14 dage. Når vævet er nedsænket i 30% saccharose løsning for 2-5 dage, hjerner er mere smidigt som forhindrer rystende og rive af sektioner, nårskæring. Det er vigtigt at forhindre hjernevæv forbliver i rørsukkeropløsningen for øgede tidsperioder (medmindre rørsukkeropløsningen kontinuerligt erstattet med frisk opløsning), fordi langvarig opbevaring i sucrose reducerer farvning kvalitet. 4) Endelig, når dias er blevet farvet og dække smuttede, de skal have tilstrækkelig tid til at tørre, før visualisering med et mikroskop. Hvis objektglassene ikke er tilladt i tilstrækkelig lufttørre, kan vævet mørkere, reducere vellykket visualisering af kortikale neuroner.
Stabile ændringer i psykisk funktion og adfærdsmæssige reaktioner, der opstår som reaktion på oplevelser menes at blive lettet ved reorganisering af neuronal morfologi og synaptisk forbindelse 17. Da disse strukturændringer giver en målelig ressource for erfaring-afhængige plasticitet, er det vigtigt at anvende en pålidelig farvningsprocedure. Denne vibratome baserede Golgi-Cox farvning procedure giver pålidelig pleting af fine grene og dendritiske pigge, der måske ikke er tydeligt med andre protokoller, såsom celloidin-embedding. Særpræg Golgi-Cox procedure stammer fra dens evne til at kun plette en lille brøkdel af neuronale elementer (1-10%), der tillader sporing af enkelte neuroner til lange afstande. Trods det faktum, at kun en lille brøkdel af neuroner er imprægneret med den plet, celler, der er synliggjort, bevare alle funktioner, herunder celle krop, dendritter, dendritiske Torner og axoner. Desuden, når farvningsproceduren udføres korrekt, de farvede celler fremstå klart og tydeligt mod en gennemsigtig baggrund, fordi andre kortikale strukturer forbliver ufarvede og gennemsigtig. På grund af den erkendelse, at vedvarende forandringer i udadgående funktion skal være relateret til den plasticitet af nervesystemet, dvs evnen til neuroner til at ændre deres struktur og tilslutningsmuligheder, Golgi-Cox farvning procedure giver forskere med enpålidelig teknik til at visualisere og kvantificere denne plasticitet.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at vi har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde er finansieret af NSERC tilskud til BK og RG. Forfatterne vil også gerne takke Kehe Xie og Russell Hosain for deres Golgi-Cox farvning ekspertise.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium Dichromate | Fisher | P188 | |
| Mercuric Chloride | Fisher | M1561 | |
| Potassium Chromate | Fisher | P220 | |
| Ammonium Hydroxide | Fisher | A669-500 | |
| Kodak Rapid Fix | Vistek | Kodak 146 4016 | |
| EtOH-95 & Anhydrous | Commercial Alcohols | No Cat Numbers | All other Et-OH are dilutions |
| Swiffers- Soft Feather-Like dusters | Safeway | Can be found at most grocery stores | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-9378 | |
| HemoDe | Electron Microscopy Sciences | 23410 | |
| Permount | Fisher | Sp15 | |
| Slides | VWR | 160004-365 | |
| Coverslips | VWR | 062011-9 |
References
- Mychasiuk, R., Ilnystkyy, S., Kovalchuk, O., Kolb, B., Gibb, R. Intensity matters: Brain, behaviour, and the epigenome of prenatally stressed rats. Neuroscience. 180, 105-110 (2011).
- Muhammad, A., Carroll, C., Kolb, B. Stress during development alters dendritic morphology in the nucleus accumbens and prefrontal cortex. Neuroscience. 216, 103-109 (2012).
- Wiesel, T., Hubel, D. Effects of visual deprivation on morphology and physiology of cells in the cat's lateral geniculate body. Journal of Neurophysiology. 26 (978), 6 (1963).
- Dwyer, J., McQuown, S., Leslie, F. The dynamic effects of nicotine on the developing brain. Pharmacology & Therapeutics. 122, 125-139 (2009).
- Richards, S., Mychasiuk, R., Kolb, B., Gibb, R. Tactile stimulation during development alters behaviour and neuroanatomical organization of normal rats. Behavioural Brain Research. 231, 86-91 (2012).
- Schanberg, S., Field, T. Sensory deprivation stress and supplemental stimulation in the rat pup and preterm neonate. Child Development. 58 (6), 1431-1447 (1987).
- Caldji, C., Tannenbaum, J., Sharma, S., Francis, D., Plotsky, P., Meaney, M. Maternal care during infancy regulates the development of neural systems mediating the expression of fearfulness in the rat. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (9), 5335-5340 (1998).
- Imanaka, A., Morinobu, S., Toki, S., Yamamoto, S., Matsuki, A., Kozuru, T., et al. Neonatal tactile stimulation reverses the effect of neonatal isolation on open-field and anxiety-like behavior, and pain sensitivity in male and female adult Sprague-Dawley rats. Behavioural Brain Research. 186, 91-97 (2008).
- Gibb, R., Gonzalez, C., Wegenast, W., Kolb, B. Tactile stimulation promotes motor recovery following cortical injury in adult rats. Behavioural Brain Research. 214 (1), 102-107 (2010).
- Rodrigues, A., Artneni, N., Abel, C., Zylbersztejn, D., Chazan, R., Viola, G., et al. Tactile stimulation and maternal separation prevent hippocampal damage in rats submitted to neonatal hypoxia-ischemia. Brain Research. 1002, 94-99 (2004).
- Kolb, B., Gibb, R. Tactile stimulation after frontal or parietal cortical injury in infant rats facilitates functional recovery and produces synaptic changes in adjacent cortex. Behavioural Brain Research. 214, 115-120 (2010).
- Muhammad, A., Hossain, S., Pellis, S., Kolb, B. Tactile stimulation during development attenuates amphetamine sensitization and structurally reorganizes prefrontal cortex and striatum in a sex-dependent manner. Behavioral Neuroscience. 125 (2), 161-174 (2011).
- Golgi, C. Sulla struttura della sostanza grigia dell cervello. Gaz Med Lomb. 33, 244-246 Forthcoming.
- Glaser, E. M., van der Loos, H. Analysis of thick brain sections by obverse-reverse computer microscopy: Application of a new, high clarity Golgi-Nissl stain. Journal of Neuroscience Methods. 4, 117-125 (1981).
- Gibb, R., Kolb, B. A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain. Journal of Neuroscience Methods. 79, 1-4 (1998).
- Meaney, M. Maternal care, gene expression, and the transmission of individual differences in stress reactivity across generations. Annual Review of Neuroscience. 24, 1161-1192 (2001).
- Robinson, T. E., Kolb, B. Structural plasticity associated with exposure to drugs of abuse. Neuropharmacology. 47, Suppl 1. 33-46 (2004).
