Summary
本論文では、ラットの子の触覚刺激および神経形態のその後ゴルジコックス染色のための手順を説明します。触覚刺激は、家庭用ダスターで子犬をなでることで周産期に投与され、肯定的な経験である。ゴルジCOX染色は全体のニューロンの可視化を可能にする信頼性のある手順です。
Abstract
行動の長期的な変化を生成するには、経験は、神経細胞の形態やシナプス接続で安定な変更を生産しなければならない。触覚刺激は、模倣がなめるとラットでグルーミング母体正初期の経験である。この肯定的な経験にラットの子を公開すると、家庭用ダスターとして非常にアクセスの材料を用いて簡単かつコスト効率よく完了することができます。クロスごみのデザインを使用して、子犬はどちらか15分、周産期を通じて1日3回、なでたり邪魔されずに残されている。この正の初期の経験に関連する神経可塑変化を測定するために、脳組織のゴルジ - コックス染色が利用される。ゴルジ - コックス含浸ではなくセルの全てよりもニューロンの離散的な数を染色するという事実のために、ゴルジコックス溶液で齧歯類の脳の染色は、細胞体、樹状突起、軸索を含む全体の神経要素の可視化を可能にし、そして樹状突起棘。染色手順のISは、数日間にわたって実施し、研究者が細部に細心の注意を払うことが必要です。染色が完了したらしかし、脳全体に含浸されており、継続的な分析のために無期限に保存することができる。したがって、ゴルジコックス染色は経験依存可塑性を研究するための貴重な資源である。
Introduction
このような周産期のストレス1,2、感覚遮断3、および薬物毒性4のような脳の成熟に悪影響を早期に経験の検査のために多く報告され、利用技術がありますが、中にプラスの経験の影響を検討するために採用非常に少ない方法論がありますこの期間。さておき、環境エンリッチメントから、触覚刺激が実証効果5と治療を強化するいくつかの脳の1である。触覚刺激をなめるとグルーミング、母親のラットの行動を模倣した皮膚に感覚刺激する方法である。正操作などの一般的な受け入れは、触覚刺激が未熟児や新生児ラット6の成熟を 改善していることを示す研究から生じる。また、Meaney研究室7での研究は、母親なめやグルーミング、より高いレベルの子孫における肯定的な成果にリンクされていることを実証した。 Tのおかげでヘセ正の影響、触覚刺激は、急速に、不安8の削 減脳損傷9月11日に関連するアウトカムの改善、薬物感12を減衰させることを目的とし、是正戦略へと進化。このように、触覚刺激が劇的に神経細胞の形態や発達中の脳のシナプス接続を再編成する実証済みの能力と正の初期の経験の促進のための貴重な技術である。
神経細胞の形態の変化を調べて定量化するためには、無傷のニューロンを可視化することが必要である。ゴルジコックス染色手順は、完全なニューロン13の少数の離散的な染色を提供し、1800年代後半に出版さカミーロゴルジの技術の変形である。手順は、ランダム性と再現性で神経細胞を染色に見えますが、一般的に大きな欠陥として引用されている、小さな含浸率は、CEを含め、全体の神経要素の可視化を可能にするLL体、樹状突起、樹状突起棘および軸索。同様に、ゴルジ溶液で所与の脳に含浸させるために必要な時間はまた、崩壊として引用されている。しかしながら、染色が完了すると、組織が無期限に保存することができ、顕微鏡でのニューロンの脳と視覚化の灌流の間の時間は21日未満で完了することができ、時間が不合理ではないことが指定されてい。また、プロトコルに若干の変更を加えて、ゴルジコックス染色は効果的に、すべての年齢の範囲からのげっ歯類の脳に含浸させるために使用することができます。構造的なレベルでの変化は、行動や心理的機能に永続的な変更にリンクされているように、ゴルジコックス染色技術は、神経可塑性を測定するための貴重なツールを研究者に提供します。
Protocol
全ての実験は、動物管理のカナダの協議に基づいて行われ、レスブリッジ大学、動物実験委員会によって承認された。
1。繁殖と触覚刺激
- 一般的な動物のサプライヤーからの妊娠ラットを注文したり、標準的な実験室の育種手順を使用して、社内で子犬を飼育。
- 暗周期を、食品および水を自由にアクセスできます。ハウスは温度制御された飼育室（21℃）のすべての動物は、12時12時間の明に維持した。
- 個別に彼らの子孫との子犬が生まれて、家の女性のラット。
- 出産後すぐに処理に関連する追加的なストレスを避けるために、P3で仔の触覚刺激を開始。
- 触覚刺激は、p21に母親から離乳されるべきであるP3-P21と子犬から1日3回（午前9時、午後1時、および午後4時）を実施すべきである。
- クロスリター設計を使用する場合、仔の半分のfrOM各ゴミが残りの半分はコントロールとしてで触覚刺激を受けることになる。ランダムに各グループに男性と女性の仔の等しい番号を割り当てる。触覚刺激とコントロールを受けている子犬を区別するために、彼らの後ろ足と尾に油性マジックで仔の1グループをマーク。マーキングは、一日おきに再適用しなければならない。
触覚刺激
- ホームケージからダムを削除し、食料と水との一時的なケージに配置します。繁殖/住宅室内のダムと一時ケージを保つ。
- 朝の触覚刺激セッション（午前9時）前に、グループとしての仔ラットを計量。セッションごとに、トランスポート·ラットは、触覚刺激のための独立した試験室にホームケージ子犬。 24℃に設定されている加熱パッド上にホームケージを置きます
- 半分にホームケージに分割する硬いボードを使用しています。他の半分に半分とコントロールの仔触覚刺激群ではラットの子を配置します。15分までのタイマーを設定します。
- 柔らかな羽毛に似たダスターを使用して、連続15分間、同時に触覚刺激グループ内のすべての子犬を磨く。若い仔ラット（〜P3〜P12）はususally一緒に群がり、一度にすべての子犬を刺激することが非常に容易になり、深い睡眠サイクルに入るようである。子犬年齢として、彼らはいくつかの子犬が歩いて、セッション中に調査するとともに、より積極的になる。実験者は、継続的に各子犬が等しい刺激を受けて確実にするためにグループにさまよう子犬を移動する必要があります。
- 15分のセッションが完了すると、バック飼育室へ子犬を輸送し、ケージに母親を返す。
- 触覚刺激の19日間、このプロセスを一日三回を繰り返します。 P21での最終触覚刺激セッションの後、子犬は母親から離乳する必要があります。子犬はその後、同性の5または6他の離乳動物とのケージに収容しなければならない。
- ラットは、追加の検査を受けていない場合は、国連のままにしておく必要が食品や（脇定期的なケージの掃除や取り扱いから）彼らは生後約100日に達するまで、 水を自由libitmへのアクセス権を持つ明暗サイクル：通常の光で、邪魔。他の実験操作を受けた場合、動物は、それらの実験室プロトコールに従って処置またはテストされるべきである。
2。犠牲とゴルジコックス染色
- およそP100、ラットへのIP注射によってペントバルビタールナトリウムの過剰摂取を管理し、約100ミリリットルの0.9％生理食塩水で心臓内灌流。
- 潅流が完了したときの脳を抽出します。そのまま小脳を維持するための努力を下に視神経を切断し、頭蓋骨から脳を削除し、研究者が嗅球を保持するか、削除することもできます。ゴルジコックス液14 20mlで不透明なナルゲンボトルに抽出された脳を置きます。
- 14日間、ゴルジコックス溶液中で脳を保つ。 14日後、ゴルジ-Cを置き換える30％スクロース溶液と牛溶液。切片の前に2-5日間、ショ糖溶液中で脳を保つ。
注：脳はショ糖溶液への転送14日以内に区分けすることができない場合、研究者は、30％スクロースの新しいストックとショ糖を交換する必要があります。研究者は、染色に対する悪影響はないとの4ヶ月毎に2週間のスクロースを置き換えることができる。
- セクションの脳にするために、脳は吸い取り乾燥されるべきであり、cyanocacrylic接着剤でセクショニングステージに固定。引き裂きや凹凸切片を防ぐために、研究者は注意が必要と脳全体がステージにしっかりと固定されていることを確認する必要があります。
- ビブラトームリザーバはセクショニングブレードをカバーレベルから6％ショ糖溶液で満たされている必要があります。 5速と振幅、（両方のスケールの中間点）にビブラトームパラメータを設定します。 200以下のセクションに脳をスライスし、2％ゼラチン化マイクロにセクションを配置スコープスライド。切片の過程で濡れた部分を保つようにしてください。
- 関心のあるセクションの全てが収集されたときに、湿らせた吸収性紙でスライドに圧力を加えることによりスライド上に切片を押してください。彼らは染色できるようになるまで湿度室内のスライドラックにスライドを保管してください。彼らは4日以上、少なくとも12時間、湿度室に残りますが、べきではありません。スライドはしっとりである必要があり、完全に乾くことを許可すべきではありません。
- 染色プロセスを開始する前に染色連隊を準備します。次のようにして12ガラス染色皿（10.7 X 8.5 X 6.8センチメートル）、処理をレーベル：
- 蒸留水 - 1分
- 水酸化アンモニウム - （暗所で）30分
- 蒸留水 - 1分
- （暗所で）30分 - コダックはフィルムの修正
- 蒸留水 - 1分
- 50％のアルコール - 1分
- 70％アルコール - 1分
- 95％のアルコール - 1分
- 100パーセントAlcohOL - 5分
- 100％アルコール - 5分
- 溶液（1/3クロロホルム、1/3 HemoDe、1/3、100％アルコール） - 15分
- HemoDe - 15分
*キシレンHemoDeのReplaceで使用することができます。一貫性のある染色の品質を確保するために、新鮮な溶液は、処理された各スライドラックに使用されるべきである。
- HemoDeの最後の15分の出現に続いて、パーマウントでスライドをカバースリップ。
- スライドを顕微鏡で調べる前に、空気乾燥することができます。
Representative Results
この染色手順が適切に守られている場合には、樹状突起と棘の一貫性のある均一な染色が生成されます。ゴルジコックス神経細胞染色の表現については、図1を参照してください。この手順では、新たにインビトロ法で開発され、無停電以下の組織の埋め込 みである樹状のフィールドの可視化を可能にすることができると同程度である染色を生成します。ゴルジコックス染色にビブラトームベースの技法は、セロイジン包埋し、クリオスタット切片化組織、15のどちらかでの染色よりも、端末の支店と錐体細胞のより広範囲な染色を生成することが見出されている。染色のこの方法は、脳全体に含浸するのでさらに、すべてのセクションは、直ちにまたは将来的に分析することができる。形態学的変化の位置が元の仮説を生成する際には常に明らかではないように、このプロセスは、追加の脳領域の探査を可能にするDは将来的に有用であろう組織の廃棄を防ぐことができます。
この染色法は、任意の熟成ラット脳（P0-老齢）の信頼性のある染色のために使用することができる。若い脳（<1グラム）を染色する際にしかし、脳はわずか6日間ではなく、成人の脳には推奨14日間ゴルジコックス溶液中に残っているはずです。他のすべての手順が一定に保たれる。このゴルジ - コックス染色プロセス中に遭遇し得る主な困難は、視床を含む中枢脳領域の高品質な染色を生じさせることができないことである。脳全体が同時に含浸されているように、中央の領域は、汚れの理想的な濃度を受信できない場合があります。この知見にもかかわらず、ゴルジコックス技術は、海馬および線条体などの皮質下領域を例外的な染色を生成します。手続きの最終的な制限は、灌流プロセス中脳からの血液の不完全な除去に起因する。血液は、脳組織内のアーティファクトを生成することができるそれは、それが困難なニューロンを撮影し、追跡することができる。
ゴルジコックス染色技術は、神経細胞レベルでの変化を調べるためにデザインされた研究の広範な範囲に有効です樹枝状形態や神経解剖学の信頼性の高い測定を提供する。早期出生後の期間において、触覚刺激後に前頭前野の神経構造を調べる際に、ゴルジコックス染色は、樹状複雑さの劇的な増加を明らかにした。初期の触覚刺激に関連する解剖学的変化（ 図1参照）触覚刺激を受けたラットの神経細胞をピラミッドする対照ラットからの錐体ニューロンのスパイン密度を比較することによって視覚的に実証することができる。また、このような樹状樹枝状、樹状長さ、および脊椎密度などのパラメータは、動物間で比較することができる連続データを生成するために計算し、統計的に分析することができる。信頼性のある結果を生成するために、分析が午前に行われるべきである処置群あたり3匹の動物と半球あたり約5ニューロンのinimumをランダムに分析下にある各脳領域のために選択する必要があります。 図2は、樹状の複雑さ（樹状突起の棘/ミクロンXμm）を示していなかった触覚刺激や動物を受けた動物の。のmPFC（CG3）から分析ニューロンの両方の先端および脳底の分野では、触覚刺激は、神経パラメータの増殖をもたらした。
図1。ゴルジコックスのA.代表写真は開発中に触覚刺激を受けたラットでエリアCG3のIII層から錐体ニューロンを染色した。CG3の脳底分野におけるターミナル樹状突起上の樹状突起棘の拡大B.代表（1,000 X）の写真を;左の明るいイメージは、対照群のラットおよびRi上の暗い画像用ですGHTは、触覚刺激を受けたラットからのものである。
図2。開発中に触覚刺激を受けたか、しなかったのどちらかという成体ラットからCG3エリア内の神経細胞の平均先端および脳底樹状突起の複雑さ（突起棘/ミクロンXミクロン）の例示表現（* P <0.01）。
Discussion
発達中の脳の明白な可塑性のために、それは初期の経験を含む実験手順は徹底的に見直され、試みは、すべての介入の変数をコントロールするために行われることが重要です。このため、クロス同腹仔設計は、開発の他のすべてのドメインに類似した経験を受けていることを保証するために触覚刺激手順の間に使用される。また、複数の同腹仔からの複数の効果が、単一の子犬またはリターの偏りに起因する可能性を避けるために、分析のために選択されていることも重要である。
触覚刺激をなめるおよび子孫開発に有益であると考えられている、毛づくろい、天然に存在する母性行動を模倣すると考えられている。先行研究は、人生の最初の週（P0〜P7）は16を舐めやグルーミングのための重要な時期であると強調しているが、変化の膨大な大きさは、TAの18日後に識別ctile刺激に敏感な時代が存在するが、より長い露出が優れていることを意味するものであります。それが故に、触覚刺激が母親に投与した正常な刺激に加えている、この実験的なパラダイムに触覚刺激を受けた子犬もなめるとその母親でグルーミング体験ことに注意することも重要である。最終的に、人はまた、この地域に依存した変化を認識しなければなりません。開発中に触覚刺激が前頭前皮質の樹枝状の複雑さを増加したが、これはこの種の構造変化は、すべての脳領域で明らかになることを保証するものではありません。それは、頭頂葉皮質のような他の脳領域におけるニューロンの形態は、同じ経験に著しく異なる様式で応答することが可能である。触覚刺激手順が容易に投与され、子孫又はダムへの危険性がされていないので、それは、開発の向上を目的とした多くの調査研究のための貴重なツールとして役立つ可能性を秘めているらは成果。
次のように脳組織のゴルジコックス染色に関しては、神経細胞の正常な可視化のための重要なステップは次のとおりです。1）生理食塩水で脳の十分な灌流がなければならない。また、染色されたニューロンを撮影する能力を複雑にするが、それは実際には困難な血管の迷路を通って神経細胞を可視化すること、血管アーチファクトの脳組織の結果の不適切または不十分な潅流。 2）灌流脳はゴルジコックスソリューション、暗所でのショ糖溶液中に保存されるべきである。暗闇の中で脳組織を格納すると、再び正常品質神経細胞を可視化する機会を増加させる、組織のバックグラウンド染色を減少させる。 3）脳組織ゴルジコックス溶液中で14日間保存後のショ糖溶液中に保存されている。組織は2-5日間、30％ショ糖溶液中に浸漬されると、脳はより柔軟である場合切片を粉砕および引き裂きを防止するカッティング。スクロース中の長期保管は、染色の質を低下させるので（スクロース溶液を連続的に新鮮な溶液と交換されていない場合）増大した期間のスクロース溶液中に残存するから脳組織を防止することが重要である。スライドが染色されており、カバーが滑ったら4）最後に、彼らは顕微鏡で可視化前に乾燥するのに十分な時間を与えられるべきである。スライドを十分に乾燥した空気に許可されていない場合、組織は、皮質ニューロンの正常な可視化を低減する、暗くすることができる。
経験に応答して生じる心理的機能および行動応答の安定した変化は、ニューロンの形態とシナプス接続17の再編成によって促進されると考えられている。これらの構造変化は、経験依存可塑性の測定可能なリソースを提供するように、信頼性の高い染色手順を使用することは重要です。このビブラベースゴルジコックス染色手順は、信頼性の汚れを提供このようなセロイジン埋め込みなどの他のプロトコルとの明らかでないかもしれない細かい枝や樹状突起棘のING。ゴルジコックス手順の特殊性は、長距離用の単一ニューロンの追跡を可能にする神経細胞要素（1-10％）のわずかな部分を染色する能力に由来する。ニューロンのごく一部のみが染色が含浸されているという事実にもかかわらず、可視化された細胞は、細胞体、樹状突起、樹状突起および軸索を含むすべての機能を維持する。染色手順が正しく実行されたときに、他の皮質構造が染色されていない透明なままのでまた、染色された細胞は、透明な背景に対して明確かつ明確に際立っている。外側に機能の持続的な変化は、神経系の可塑性に関連していなければならないという認識のために、ゴルジコックス染色手順は、と研究者を提供し、その構造との接続性を修正するために神経細胞の機能、すなわちこの可塑性を可視化し、定量化するための信頼性の高い技術である。
Disclosures
著者は、我々は競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、BKとRGにNSERCの補助金によって賄われている。また、作者は彼らのゴルジコックス染色の専門知識のためにKehe謝とラッセルHosainに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium Dichromate | Fisher | P188 | |
| Mercuric Chloride | Fisher | M1561 | |
| Potassium Chromate | Fisher | P220 | |
| Ammonium Hydroxide | Fisher | A669-500 | |
| Kodak Rapid Fix | Vistek | Kodak 146 4016 | |
| EtOH-95 & Anhydrous | Commercial Alcohols | No Cat Numbers | All other Et-OH are dilutions |
| Swiffers- Soft Feather-Like dusters | Safeway | Can be found at most grocery stores | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-9378 | |
| HemoDe | Electron Microscopy Sciences | 23410 | |
| Permount | Fisher | Sp15 | |
| Slides | VWR | 160004-365 | |
| Coverslips | VWR | 062011-9 |
References
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