Summary
Dette notatet beskriver prosedyrene for taktil stimulering av rotteunger og påfølgende Golgi-Cox farging av neuronal morfologi. Tactile stimulering er en positiv opplevelse som administreres i perinatalperioden ved å stryke unger med en husholdning duster. Golgi-cox farging er en pålitelig prosedyre tillater visualisering av hele nerveceller.
Abstract
For å generere mer langsiktige endringer i atferd, må opplevelsene være produsere stabile endringer i neuronal morfologi og synaptiske tilkobling. Tactile stimulering er en positiv tidlig erfaring som etterligner mors slikker og stell i rotte. Utsette rotteunger til denne positive opplevelsen kan gjennomføres enkelt og kostnadseffektivt ved hjelp av svært tilgjengelig materialer som en husholdning duster. Ved hjelp av en cross-kullet design, er valpene enten strøk eller venstre uforstyrret, for 15 minutter, tre ganger per dag gjennom hele perinatalperioden. For å måle de neuroplastic endringer knyttet til denne positive tidlig erfaring, er Golgi-Cox farging av hjernevev utnyttet. På grunn av det faktum at Golgi-Cox impregnering flekker et diskret antall nerveceller i stedet for alle cellene, farging av gnagerhjerne med Golgi-Cox løsningen tillater visualisering av hele neuronale elementer, inkludert cellekroppen, dendritter, aksoner og dendrittutløperne. Den fargingsprosedyre is gjennomført over flere dager, og krever at forskeren være oppmerksom på detaljer. Men når fargingen er fullført, hele hjernen har blitt impregnert og kan bevares på ubestemt tid for løpende analyse. Derfor er Golgi-Cox flekker en verdifull ressurs for å studere erfaring avhengig plastisitet.
Introduction
Selv om det er mange rapporterte og benyttes teknikker for undersøkelse av negative tidlige erfaringer på hjernens modning, for eksempel perinatal stresset 1,2, sensorisk deprivasjon tre, og narkotika toksisitet 4, er det svært få metoder som benyttes for å undersøke effekten av positive opplevelser i denne tidsperioden. Bortsett fra miljøberikelse, er taktil stimulering en av få hjernen styrke behandlinger med demonstrert effekter fem. Tactile stimulering er en metode for sensorisk stimulering til huden som etterligner mors rotte atferd, slikker og grooming. Sin generelle aksept som en positiv manipulasjon oppstår fra studier som indikerer at taktil stimulering forbedret modning av premature barn og nyfødte rotter seks. I tillegg har forskning i Meaney laboratoriet 7 viste at høyere nivåer av mors slikker og grooming er knyttet til positive resultater i avkom. På grunn av these positive påvirkninger, taktil stimulering raskt utviklet seg til et avbøtende strategi som tar sikte på å redusere angst 8, bedre utfall assosiert med hjerneskade 9-11, og dempe narkotika allergi 12. Som sådan, er taktil stimulering en verdifull teknikk for å fremme positive tidlige erfaringer, med en bevist evne til dramatisk reorganisere neuronal morfologi og synaptiske tilkobling av utviklingen av hjernen.
For å undersøke og kvantifisere endringer i neuronal morfologi, er det nødvendig for å visualisere intakte neuroner. Golgi-Cox farging prosedyre er en modifikasjon av Camillo Golgi teknikk publisert i slutten av 1800-tallet som gir diskret farging av et lite antall av komplette nevroner 13. Selv om fremgangsmåten synes å flekke nevroner tilfeldig og reproduserbarhet blir vanligvis omtalt som store feil, den lille impregnerings sats tillatelser visualisering av hele neuronal element, inklusive cell organer, dendritter, dendrittutløperne og aksoner. Tilsvarende har den tiden som kreves for å impregnere et gitt hjernen med Golgi løsning også vært nevnt som en undergang. Imidlertid, gitt at når fargingen er fullført vev kan bevares på ubestemt tid, og tiden mellom perfusjon av hjernen og visualisering av neuroner med et mikroskop kan fullføres på mindre enn 21 dager er ikke urimelig tidsperioden. I tillegg, med mindre modifikasjoner i protokollen, Golgi-Cox flekker kan være effektivt brukes til å impregnere hjernen hos gnagere fra alle aldersgrupper. Som endringer på strukturelt nivå har vært knyttet til vedvarende endringer i atferds-og psykologiske funksjon, gir Golgi-Cox farging teknikk forskere med et verdifullt verktøy for å måle nevroplastisitet.
Protocol
Alle forsøkene ble utført i samsvar med den kanadiske Council of Animal Care og godkjent av Universitetet i Lethbridge, Animal Care Committee.
En. Avl og Taktil Stimulering
- Bestill drektige rotter fra vanlige dyr leverandører eller avle unger i huset ved hjelp av standard laboratorieoppdrettsprosedyrer.
- Hus alle dyr i en temperatur kontrollert avl rom (21 ° C), opprettholdes på en 12:12 hr lys: mørke-syklusen og gi tilgang til mat og vann ad libitum.
- Når valpene er født, huset hunnrotter individuelt med sine avkom.
- For å unngå ekstra stress knyttet til håndtering umiddelbart etter fødselen, begynner taktil stimulering av valper på P3.
- Tactile stimulering bør gjennomføres tre ganger per dag (09:00, 01:00 og 16:00) fra P3-P21 og valpene skal avvennes fra sine mødre på P21.
- Når du bruker et kors kull design, halvparten av valpene frOM hvert kull vil gjennomgå taktil stimulering med den andre halvparten som tjener som kontroller. Tilfeldig tildele like mange mannlige og kvinnelige valper til hver gruppe. For å skille valpene gjennomgår taktil stimulering og kontroller, markere en gruppe unger med en permanent markør på bakbeina og halen. Merking må bli brukt igjen annenhver dag.
Tactile Stimulering
- Fjern demninger fra sine hjem bur og plassere dem i et midlertidig bur med mat og vann. Hold demningen og midlertidig bur i avl / bolig rom.
- Vei rotteunger som en gruppe før morgenen taktil stimulering økten (09:00). For hver økt, pups transport rotte sine hjem bur til en egen testing rom for taktil stimulering. Plasser hjemmet buret på en varmepute som er satt til 24 ° C.
- Bruk en stiv styret å dele hjemmet buret i to halvdeler. Plasser rotteunger i de taktile stimulering gruppen en halv og kontroll unger i den andre halvparten.Sett en timer til 15 min.
- Ved hjelp av en myk fjærlignende duster, pusse alle valpene i taktil stimulering gruppen på samme tid for 15 sammenhengende minutter. De unge rotteunger (~ P3-P12) ususally klynge sammen og ser ut til å gå inn i en dyp søvn syklus gjør det svært enkelt å stimulere alle valpene på en gang. Som unger alder, de blir mer aktive, med noen unger går og undersøker i løpet av økten. Eksperimentator bør kontinuerlig flytte vandrende unger inn i gruppen for å sikre at hver valp får lik stimulering.
- Når 15 min sesjon er fullført, transporteres pups tilbake til avl rommet og tilbake moren til buret.
- Gjenta denne prosessen tre ganger om dagen i de 19 dagene av taktil stimulering. Etter den siste taktil stimulering økt på P21, bør valpene bli avvent fra sine mødre. Valper skal da bli plassert i bur med fem eller seks andre avvent dyr av samme kjønn.
- Hvis rotter er under ingen ytterligere testing, bør de stå unforstyrret, på den normale lys: mørke syklus med adgang til for og vann ad libitm (bortsett fra vanlig bur rengjøring og håndtering) inntil de når omtrent 100 dagers alder. Hvis gjennomgår andre eksperimentelle manipulasjoner, bør dyrene behandles eller testet i samsvar med disse laboratorieprotokoller.
2. Offer og Golgi-Cox Farging
- Ved ca P100, gi en overdose av natrium-pentobarbital via IP-injeksjon i rottene og perfuse intracardially med ca 100 ml 0,9% saltvann.
- Pakk hjernen når perfusjon er fullført. Fjern hjernen fra skallen, kutte synsnerven under med forsøk på å holde lillehjernen intakt; forskere kan velge å beholde eller fjerne olfactory pærer. Plasser hentet hjerner i en ugjennomsiktig Nalgene flaske med 20 ml av Golgi-Cox løsning 14.
- Hold hjernen i Golgi-Cox løsning for 14 dager. Etter 14 dager, erstatte Golgi-Cox-løsning med en 30% sukroseløsning. Hold hjernen i sukroseløsning i 2-5 dager før seksjonering.
Merk: Hvis hjernene ikke kan seksjoneres i løpet av 14 dager etter overføring til sukrose-løsning, trenger forskeren til å erstatte sukrose med et nytt lager av 30% sukrose. Forskeren kan erstatte sukrose hver uke for fire måneder uten negative effekter på farging.
- For § hjernen, bør hjernen bli utslettet tørt og fast til seksjonering scenen med cyanocacrylic lim. For å unngå å rive eller ujevn seksjonering, skal forskeren være forsiktige og sikre at hele hjernen er skikkelig festet til scenen.
- Vibratome reservoaret må fylles med 6% sukrose løsning på et nivå som dekker seksjonering bladet. Sett vibratome parametere til en hastighet og amplitude til 5, (midtpunktet på begge skalaer). Skjær hjernen til 200 mikrometer seksjoner og plassere delene på en 2% gelatinized microOmfanget lysbilde. Pass på å holde delene våt i løpet av seksjonering.
- Når alle delene av interesse har blitt samlet inn, trykk seksjonene på lysbildene ved å legge press på lysbildene med fuktet bibulous papir. Oppbevar lysbilder i en lysbilde rack i fuktighet kammer før de er klare til å bli farget. De bør forbli i fuktighetskammeret i minst 12 timer, men ikke mer enn 4 dager. Lysbildene må være fuktig og bør ikke få lov til å tørke ut.
- Forbered farging regiment før du begynner farging prosessen. Etikett tolv glass flekker retter (10,7 x 8,5 x 6,8 cm) og prosess på følgende måte:
- Destillert Vann - en min
- Ammonium hydroksid - 30 min (i mørket)
- Destillert Vann - en min
- Kodak Fix for Film - 30 min (i mørket)
- Destillert Vann - en min
- 50% alkohol - en min
- 70% alkohol - en min
- 95% alkohol - en min
- 100% Alcohol - 5 min
- 100% alkohol - 5 min
- Løsning (1/3 kloroform, 1/3 HemoDe, 1/3 100% alkohol) - 15 min
- HemoDe - 15 min
* Xylen kan brukes i bytte av HemoDe. For å sikre konsekvent flekker kvalitet, bør friske løsninger brukes for hvert lysbilde stativ behandlet.
- Etter den siste 15 min emersion i HemoDe, dekk lysbildene med Permount.
- Tillat lysbildene lufttørke før du undersøke med et mikroskop.
Representative Results
Når dette farging prosedyre er fulgt på riktig måte, er konsekvent og ensartet farging av dendritter og pigger generert. Se figur 1 for fremstilling av Golgi-Cox neuronal farging. Denne prosedyren gir flekker som kan sammenlignes med den nyutviklede in vitro metoder og kan tillate visualisering av dendrittiske felt som er uninterruptable følgende vev innebygging. Den vibratome basert teknikk for Golgi-Cox farging er blitt funnet å gi mer utbredt farging av terminale grener og pyramidale neuroner enn farging med enten celloidin-forankret og kryostaten-seksjonert vev, 15.. Videre, fordi denne metoden for farging impregnerer hele hjernen, alle seksjoner kan analyseres enten umiddelbart eller i fremtiden. Som plasseringen av morfologiske endringen er det ikke alltid opplagt når du genererer en original hypotese, gjør denne prosessen for utforskning av flere områder av hjernen end forhindrer destruksjon av vev som kan være nyttig i fremtiden.
Denne fargemetoden kan brukes for pålitelig farging av eventuelle eldre rottehjerner (P0 gammel alder). Imidlertid, når fargingen små hoder (<1 g), hjernen bør bare være i Golgi-Cox-løsning i 6 dager, i stedet for de 14 dager som anbefales for voksne hjerner, alle andre fremgangsmåter blir holdt konstant. Den største vanskeligheten som kan oppstå i løpet av denne Golgi-Cox farging prosessen er manglende evne til å produsere høy kvalitet farging av sentrale områder av hjernen, inkludert thalamus. Ettersom hele hjernen impregneres på samme tid, kan det sentrale områder ikke mottar ideelle konsentrasjoner av flekken. Til tross for dette funnet, produserer Golgi-Cox teknikk eksepsjonell farging av subkortikale regioner som hippocampus og striatum. En endelig begrensning av fremgangsmåten oppstår ved ufullstendig fjerning av blod fra hjernen under perfusjon prosessen. Blod kan produsere gjenstander i hjernevevsom gjør det vanskelig å fotografere og spore nervecellene.
Golgi-Cox fargeteknikker gir et pålitelig mål på dendrittiske morfologi og nevroanatomi som er nyttig for et omfattende utvalg av studier designet for å undersøke endringer på nevronale nivå. Når undersøke nevrale strukturen i prefrontal cortex følgende taktil stimulering i tidlig postnatal periode, Golgi-Cox flekker avdekket dramatiske økninger i dendrittiske kompleksitet. Anatomiske forandringer i forbindelse med tidlig taktil stimulering kan påvises visuelt ved å sammenligne tettheten til ryggraden pyramidale neuroner fra en kontrollrotte å pyramidal neuroner fra en rotte som gjennomgikk taktil stimulering (se figur 1). I tillegg kan parametere slik som dendritiske arborization, dendrittiske lengde, og ryggraden tetthet bli beregnet og statistisk analysert for å generere kontinuerlig data som kan bli sammenlignet på tvers av dyr. For å generere pålitelige resultater, bør analysen utføres på aminimum av tre dyr pr behandlingsgruppe og omtrent fem nevroner pr halvkule bør velges tilfeldig for hver enkelt hjerne område under analyse. Figur 2 demonstrerer den dendrittiske kompleksitet (pigger / um x mikrometer av dendrite) av dyr som mottok taktil stimulering og dyr som ikke gjorde . I begge de apikale og basilaris felt av nevroner analysert fra mPFC (CG3), taktil stimulering resulterte i spredning av nevrale parametere.
Figur 1. A. representant fotografi av et Golgi-Cox beiset pyramide nevron fra lag III av området CG3 i en rotte som fikk taktil stimulering under utvikling. B. Representant forstørret (1000 X) fotografi av dendrittutløperne på terminalen dendritter i basilaris innen CG3 ; lyse bildet til venstre for en rotte i kontrollgruppen og den mørkere bilde på right er fra en rotte som fikk taktil stimulering.
Figur 2. Illustrasjons representasjon av gjennomsnittlig apikale og basilaris dendrittiske kompleksitet (pigger / mikrometer x mikrometer) for nevroner i CG3 området fra voksne rotter som enten fikk taktil stimulering under utvikling eller ikke (* p <0,01).
Discussion
På grunn av den åpen plastisitet av utviklingen av hjernen, er det viktig at eksperimentelle prosedyrer som involverer tidligere erfaringer blir grundig gjennomgått, og det gjøres forsøk på å kontrollere for alle mellomliggende variabler. Av denne grunn er en tverr kull utforming som er anvendt i den taktile stimuleringsprosedyre for å sikre at unger får lignende erfaringer i alle andre områder av utvikling. I tillegg er det også viktig at flere pups fra flere kull blir valgt for analyse for å unngå muligheten for at virkningene skyldes en skjevhet i en enkelt pup eller kull.
Taktil stimulering er antatt å etterligne naturlig fore mors oppførsel, slikking og stell, som er antatt å være fordelaktig å utvikle avkom. Selv om tidligere forskning har lagt vekt på den første uken av livet (P0-P7) for å være en kritisk periode for slikking og stell 16, identifisert selve omfanget av endring etter 18 dager med TActile stimulering kan innebære at selv om sensitive ganger eksisterer, er overlegen lengre eksponering. Det er også viktig å merke seg at valpene får taktil stimulering i denne eksperimentelle paradigmet også oppleve slikker og stell av sine mødre, derav taktil stimulering er i tillegg til vanlig stimulering administreres av moren. Til slutt må man også være bevisste på regionens avhengige endringer. Selv om taktil stimulering under utvikling økt dendrittiske kompleksiteten i prefrontal cortex, betyr dette ikke garantere at strukturelle endringer av denne art vil være tydelig i alle områder av hjernen. Det er mulig at neuronal morfologi i andre områder av hjernen som parietal cortex, ville svare på en påfallende forskjellig måte til den samme opplevelsen. Men fordi den taktile stimuleringen måles enkelt administreres og utgjør ingen risiko for avkommet eller demninger, har det potensial til å fungere som et verdifullt verktøy for mange forskningsstudier for å bedre utviklingal utfall.
Med hensyn til Golgi-Cox farging av hjernevev, de kritiske trinn for vellykket visualisering av neuronale celler er som følger: 1) det må være tilstrekkelig perfusjon av hjernen med saltløsning. Feilaktig eller utilstrekkelig perfusjon av hjernen vev resulterer i blod fartøyet gjenstander som gjør det vanskelig å faktisk visualisere nerveceller gjennom labyrinten av blodårene, mens også kompliserer muligheten til å fotografere farget nevroner. 2) perfundert hjerner skal oppbevares i Golgi-Cox-løsning og sukrose-løsning i mørket. Lagring av hjernevevet i mørke reduserer bakgrunnsfarging av vev, igjen øker sjansen for suksess visualisere kvalitets neuronale celler. 3) Brain vev lagres i sukrose-løsning etter 14 dagers lagring i Golgi-Cox-løsning. Når vevet er neddykket i 30% sukrose-løsning i 2-5 dager, hjerner er mer ettergivende som hindrer knusing og rive av seksjonene nårskjæring. Det er viktig å hindre at hjernevev fra gjenværende i sukroseløsning for økte tidsperioder (mindre sukroseløsning blir kontinuerlig erstattet med frisk oppløsning), fordi lengre tids lagring i sukrose reduserer fargingskvalitet. 4) Til slutt, når lysbilder har blitt farget og dekselet gled, de bør gis tilstrekkelig tid til å tørke før visualisering med et mikroskop. Hvis lysbilder er ikke tillatt å tilstrekkelig lufttørke, kan vevet mørkere, redusere vellykket visualisering av kortikale nevroner.
Stabile endringer i psykologisk funksjon og adferdsmessige responser som forekommer som respons på erfaringer antas å lettes ved omorganisering av neuronal morfologi og synaptisk tilkobling 17.. Ettersom disse strukturelle endringer gi en målbar kilde til erfaring avhengig plastisitet, er bruken av en pålitelig fargingsprosedyre viktig. Dette vibratome basert Golgi-Cox flekker prosedyre gir pålitelig flekkening av fine grener og dendrittutløperne som kanskje ikke er tydelig med andre protokoller som celloidin-embedding. Den egenart av Golgi-Cox fremgangsmåte kommer av dens evne til bare å sette flekker på en liten brøkdel av neuronal elementer (1-10%), som tillater sporing av enkelt neuroner for lange avstander. Til tross for at bare en liten brøkdel av nevroner er impregnert med flekken, celler som gjengis synlig, vedlikeholde alle funksjoner, inkludert cellen kroppen, dendritter, dendrittutløperne og axons. Dessuten, når farging prosedyren utføres riktig, de fargede cellene skiller seg ut klart og tydelig mot en gjennomsiktig bakgrunn fordi andre kortikale strukturer forblir unstained og gjennomsiktig. På grunn av den erkjennelse at varige endringer i ytre funksjon må være relatert til plastisitet i nervesystemet, det vil si evnen til nerveceller til å endre sin struktur og tilkoblingsmuligheter, gir Golgi-Cox farging prosedyre forskere med etpålitelig teknikk for å visualisere og kvantifisere denne plastisitet.
Disclosures
Forfatterne erklærer at har vi ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet er finansiert av NSERC tilskudd til BK og RG. Forfatterne vil også takke Kehe Xie og Russell Hosain for deres Golgi-Cox flekker kompetanse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium Dichromate | Fisher | P188 | |
| Mercuric Chloride | Fisher | M1561 | |
| Potassium Chromate | Fisher | P220 | |
| Ammonium Hydroxide | Fisher | A669-500 | |
| Kodak Rapid Fix | Vistek | Kodak 146 4016 | |
| EtOH-95 & Anhydrous | Commercial Alcohols | No Cat Numbers | All other Et-OH are dilutions |
| Swiffers- Soft Feather-Like dusters | Safeway | Can be found at most grocery stores | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-9378 | |
| HemoDe | Electron Microscopy Sciences | 23410 | |
| Permount | Fisher | Sp15 | |
| Slides | VWR | 160004-365 | |
| Coverslips | VWR | 062011-9 |
References
- Mychasiuk, R., Ilnystkyy, S., Kovalchuk, O., Kolb, B., Gibb, R. Intensity matters: Brain, behaviour, and the epigenome of prenatally stressed rats. Neuroscience. 180, 105-110 (2011).
- Muhammad, A., Carroll, C., Kolb, B. Stress during development alters dendritic morphology in the nucleus accumbens and prefrontal cortex. Neuroscience. 216, 103-109 (2012).
- Wiesel, T., Hubel, D. Effects of visual deprivation on morphology and physiology of cells in the cat's lateral geniculate body. Journal of Neurophysiology. 26 (978), 6 (1963).
- Dwyer, J., McQuown, S., Leslie, F. The dynamic effects of nicotine on the developing brain. Pharmacology & Therapeutics. 122, 125-139 (2009).
- Richards, S., Mychasiuk, R., Kolb, B., Gibb, R. Tactile stimulation during development alters behaviour and neuroanatomical organization of normal rats. Behavioural Brain Research. 231, 86-91 (2012).
- Schanberg, S., Field, T. Sensory deprivation stress and supplemental stimulation in the rat pup and preterm neonate. Child Development. 58 (6), 1431-1447 (1987).
- Caldji, C., Tannenbaum, J., Sharma, S., Francis, D., Plotsky, P., Meaney, M. Maternal care during infancy regulates the development of neural systems mediating the expression of fearfulness in the rat. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (9), 5335-5340 (1998).
- Imanaka, A., Morinobu, S., Toki, S., Yamamoto, S., Matsuki, A., Kozuru, T., et al. Neonatal tactile stimulation reverses the effect of neonatal isolation on open-field and anxiety-like behavior, and pain sensitivity in male and female adult Sprague-Dawley rats. Behavioural Brain Research. 186, 91-97 (2008).
- Gibb, R., Gonzalez, C., Wegenast, W., Kolb, B. Tactile stimulation promotes motor recovery following cortical injury in adult rats. Behavioural Brain Research. 214 (1), 102-107 (2010).
- Rodrigues, A., Artneni, N., Abel, C., Zylbersztejn, D., Chazan, R., Viola, G., et al. Tactile stimulation and maternal separation prevent hippocampal damage in rats submitted to neonatal hypoxia-ischemia. Brain Research. 1002, 94-99 (2004).
- Kolb, B., Gibb, R. Tactile stimulation after frontal or parietal cortical injury in infant rats facilitates functional recovery and produces synaptic changes in adjacent cortex. Behavioural Brain Research. 214, 115-120 (2010).
- Muhammad, A., Hossain, S., Pellis, S., Kolb, B. Tactile stimulation during development attenuates amphetamine sensitization and structurally reorganizes prefrontal cortex and striatum in a sex-dependent manner. Behavioral Neuroscience. 125 (2), 161-174 (2011).
- Golgi, C. Sulla struttura della sostanza grigia dell cervello. Gaz Med Lomb. 33, 244-246 Forthcoming.
- Glaser, E. M., van der Loos, H. Analysis of thick brain sections by obverse-reverse computer microscopy: Application of a new, high clarity Golgi-Nissl stain. Journal of Neuroscience Methods. 4, 117-125 (1981).
- Gibb, R., Kolb, B. A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain. Journal of Neuroscience Methods. 79, 1-4 (1998).
- Meaney, M. Maternal care, gene expression, and the transmission of individual differences in stress reactivity across generations. Annual Review of Neuroscience. 24, 1161-1192 (2001).
- Robinson, T. E., Kolb, B. Structural plasticity associated with exposure to drugs of abuse. Neuropharmacology. 47, Suppl 1. 33-46 (2004).
