Summary
Cursos de tempo para a actividade de glicosilase de 8-oxoguanina glicosilase de ADN são bifásica exibindo uma explosão de formação do produto e uma fase de estado estacionário linear. Utilizando as técnicas de têmpera de fluxo, o rebentamento e as taxas em estado estacionário pode ser medida, o que corresponde à excisão de 8-oxoguanina e libertação da glicosilase de ADN a partir do produto, respectivamente.
Abstract
Humano 8-oxoguanina ADN glicosilase (OGG1) extirpa o mutagénicas lesão oxidativa do ADN de 8-oxo-7 ,8-dihydroguanine (8-oxoG) a partir de ADN. Caracterização cinética da OGG1 é realizada para medir as taxas de excisão 8 oxoG e lançamento do produto. Quando a concentração de OGG1 é menor do que o ADN do substrato, o período de formação de produto são bifásicos, com uma fase exponencial rápida (isto é, explosão) de formação do produto é seguido por uma fase de estado estacionário linear. O assomo inicial de formação do produto corresponde à concentração de enzima adequadamente acoplada no substrato, e a amplitude de explosão depende da concentração de enzima. A constante do sinal de sincronismo de velocidade de primeira ordem corresponde à taxa intrínseca da excisão 8-oxoG e da taxa em estado estacionário mais lento mede a taxa de libertação de produto (produto de ADN constante da taxa de dissociação, koff). Aqui, descrevemos as abordagens de estado estacionário, pré-steady-estado, e um único volume de negócios de isolar e medir spetapas ecific durante OGG1 ciclismo catalítico. Um oligonucleótido marcado fluorescente lesão contendo OGG1 e purificados são utilizados para facilitar as medições cinéticas exactas. Uma vez que baixas concentrações de enzima são utilizados para fazer medições de estado estacionário, a mistura de reagentes manuais e têmpera da reacção pode ser executada para determinar a taxa de estado estacionário (k off). Além disso, a extrapolação da taxa em estado estacionário de um ponto na ordenada no tempo zero indica que uma explosão de formação do produto ocorreu durante o primeiro volume (isto é, intercepção de y é positivo). A constante da taxa de fase do sincronismo exponencial de primeira ordem pode ser medida utilizando uma técnica de mistura e de arrefecimento rápido, que examina a quantidade de produto formado em intervalos de tempo curtos (<1 s) antes da fase de estado estacionário correspondendo a uma taxa de 8 -oxoG excisão (isto é, química). O passo de química também pode ser medida utilizando uma abordagem de um único volume de negócios onde ciclismo catalítica éprevenida por ADN com a enzima de substrato saturante (E> S). Estas abordagens podem medir constantes de velocidade elementares que influenciam a eficiência da remoção de uma lesão de DNA.
Introduction
Um ambiente aeróbico acelera instabilidade genômica. Uma lesão grande de DNA resultante promutagenic do stress oxidativo é 7,8-di-hidro-8-oxoguanina (8-oxoG). Isto é devido ao potencial de codificação ambígua de 8-oxoG. Human 8 oxoguanine DNA glicosilase (OGG1) é responsável por iniciar reparo por excisão de base do 8 oxoG. A atividade glicosilase de OGG1 extirpa a base de 8 oxoG resultando em DNA produto com um site apurínico (AP-local). A atividade lyase fraco OGG1 pode incisão no AP local em alguns casos.
Caracterização cinética da glicosilases DNA geralmente acha que eles exibem cursos de tempo bifásicos. Depois de uma fase rápida inicial de formação do produto (isto é, explosão), uma fase de estado estacionário linear é observada 1-3. Este comportamento é indicativo de um passo na sequência da química (isto é, a mudança conformacional ou libertação do produto) a ser limitante da velocidade, durante a porção linear do decurso do tempo, enquanto que a brocaª fase, muitas vezes referida como a fase transitória, corresponde à formação do produto no sítio activo da enzima, durante o primeiro ciclo de reacção. Quando o lançamento do produto é a taxa de limitação durante a fase de steady-state, as medições de atividade fornecer uma medida qualitativa do DNA produto afinidade de ligação, mas não fornecem informações cinética sobre eventos no sítio ativo da enzima (ou seja, química). Deste modo, os métodos para isolar e medir a fase do sincronismo de pré-estado estacionário exponencial são necessários para investigar acontecimentos durante a primeira rotação enzimática em local activo da enzima 4.
Existem três métodos cinéticos padrão para caracterizar o comportamento catalítico do OGG1, (1) no estado estacionário, (2) pré-de estado estacionário, e (3) um único volume. Estas abordagens diferem umas das outras pela concentração da enzima na mistura de reacção e da enzima em relação ao substrato utilizada em cada abordagem. Em uma abordagem típica de estado estacionário,por vezes referido como o volume de negócios múltiplos cinética, baixas concentrações de enzima são utilizados para seguir a formação do produto. A concentração do substrato é muito superior à concentração de enzima de modo a que várias das modificações enzimáticas não afectam significativamente a concentração de substrato. Nesta situação, os cursos de tempo deve ser linear e muitas vezes é difícil discernir se uma explosão ocorreu durante a primeira rotação, devido à baixa concentração de enzima usada neste método; nota que a amplitude de ruptura é equivalente à concentração de enzima. Isto pode ser ultrapassado utilizando uma concentração de enzima mais elevada e extrapolando o curso de tempo linear para o tempo zero para detectar se o primeiro volume enzimática ocorreu rapidamente. O intercepto no eixo das ordenadas (eixo y) deve ser proporcional à concentração de enzima e fornece uma medida da enzima activa envolvida com o substrato. Embora esta abordagem pode, em princípio fornecem evidência para a existência de uma fase de explosão, uma diferené necessária para medir abordagem rente a cinética da fase de sincronização. Em muitos casos, a fase de explosão é muito rápido de medir por meio de técnicas de mixagem e têmpera manuais. Nesta situação, a cinética de pré-estado estacionário e um único volume de negócios (ou seja cinética transiente) aproxima-se muitas vezes requerem um instrumento de mistura rápida e de têmpera para seguir os pontos de uma reacção de 5 tempo iniciais. Em uma abordagem de pré-estado estacionário elevadas concentrações de enzima são utilizadas de modo a que uma quantidade significativa de produto é formado durante a primeira rotação. Dado que várias das modificações são seguidos para observar ciclismo catalítica (isto é, a fase linear que segue a rajada), a concentração de substrato é maior do que a concentração de enzima ([enzima] <[substrato]). Para isolar os eventos no sítio ativo da enzima sem ciclismo catalítico, são utilizadas as condições de um único volume de negócios. Neste caso, o substrato é impregnado com a enzima (E >> S), de modo que todo o substrato vai participar in o «volume de negócios single 'e normalmente apresentam um curso de tempo single-exponencial.
Como mencionado acima para as enzimas que exibem uma fase do sincronismo, de libertação do produto (k off) muitas vezes limita a taxa da fase de estado estacionário ao longo do tempo. A taxa de libertação de produto (. / Hora v ss, conc) pode ser determinada a partir do declive da fase de estado estacionário linear. A concentração da enzima ativa (E) é necessário para converter a taxa de liberação do produto para uma constante taxa intrínseca onde k off = v ss / [E]. Importante, a concentração de enzima activa é tipicamente menor do que a concentração de proteína medida devido às impurezas, enzima inactiva, enzima não produtivamente ligado ao substrato e ao método utilizado para determinar a concentração de proteína. A concentração de enzima activa pode ser determinado a partir da amplitude de ruptura quando a libertação do produto é lenta. Assim, extrapolando a um curso de tempo de estado estacionário paratempo zero fornece uma estimativa da enzima activa necessária para calcular k off (libertação do produto) a partir da taxa em estado estacionário observada.
Para medir a cinética da explosão, uma abordagem de pré-estado estacionário é necessário seguir a formação do produto, durante a primeira rotação, que ocorre antes da fase de estado estacionário linear. A cinética de ruptura segue a formação do intermediário enzima-produto. Uma vez que a reacção é iniciada pela enzima de mistura com o substrato, a quantidade do produto da enzima aumenta rapidamente até que a reacção atinge uma fase de estado estacionário. Se a catálise é muito mais rápida do que a libertação do produto, a amplitude do impulso é igual a enzima envolvida activamente e a abordagem exponencial observada até ao equilíbrio (kobs) corresponde à taxa de conversão química do substrato em produto, assumindo que a taxa de reverso química é negligenciável.
Em alguns casos cy catalíticaagarram interfere com a análise pré-steady-state, como quando as magnitudes de taxas para a química e lançamento do produto não são significativamente diferentes. Neste caso, utilizando o excesso de enzima em relação ao substrato previne ciclismo catalítico e do substrato com a enzima de limites ligado a um único volume. Por conseguinte, o primeiro passo da reacção química pode ser isolado e determinado com precisão como a constante de velocidade de primeira ordem (k obs). Esta constante de velocidade deve ser semelhante ao kobs determinada a partir da abordagem de pré-estado estacionário descrito acima.
Aqui descrevemos como estes métodos cinéticos pode ser utilizado para analisar a actividade de OGG1 glicosilase.
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Protocol
1. Preparação de enzima e substrato de ADN
- Over-express OGG1 como uma proteína de fusão GST-em E. coli, utilize o tag GST para a purificação e, em seguida, remover o tag GST por clivagem com HRV-3C protease (Figura 1) 6.
- Adquirir a sintetizado quimicamente 5'-6-carboxifluoresceína (6-FAM) oligonucleotídeo marcado contendo um único resíduo de 8 oxoG e a sua cadeia de oligonucleótido não marcado complementar. Os oligonucleótidos 34-mero contêm a 8 oxoG na posição 17 a partir da extremidade 5 '. Purifica-se estes oligonucleótidos por electroforese em gel de poliacrilamida.
- Preparar substrato de ADN de cadeia dupla contendo 8-oxoG por mistura 5'-6-FAM oligonucleótido marcado com a sua cadeia complementar a uma razão molar de 1:1,2 em tampão de hibridação (Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 10 mM, 50 mM, 1 mM de EDTA) num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Coloque o tubo em um carro alegórico em água fervente por 5 min. Deixe o tubo no lugar e, em seguida, deixe a água esfriar lentamente para rtemperatura oom (isso leva cerca de 2 horas).
- Realizar a preparação da amostra e da experiência em condições de baixa ou mínima de luz, de modo a minimizar a fotodegradação do marcador fluorescente.
2. Medição do Tempo Curso de Estado Estável e do Active Titulação site de OGG1
2.1. A preparação da amostra e decurso de tempo de estado estacionário
- Preparar substrato de ADN e OGG1 soluções separadamente em tampão de reacção (HEPES 50 mM, pH 7,5, KCl 20 mM, EDTA 0,5 mM e 0,1% de albumina de soro de bovino) em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml em gelo. A concentração de ADN é de 400 nM e a concentração aparente de OGG1 é de 30, 60, 90 ou 120 nM como determinado por um ensaio de proteína de Bradford. Colocar os tubos de reacção de um conjunto de bloco de calor a 37 ° C. Pré-incubar enzima e do substrato de ADN soluções separadamente a 37 ° C durante 1 min.
- Iniciar a reacção por mistura de volumes iguais das soluções de substrato e OGG1 DNA por pipetagem. Depois de misturar estes soluções 1:1 (v / v), as concentrações finais são de 200 nM e 15 de ADN, 30, 45, ou 60 nM OGG1, respectivamente. Remover alíquotas (10 ul) em intervalos de tempo e temperar a reacção por mistura com 1 ml de NaOH 1M. Como controlo para os cursos de tempo, 10 ul da mistura de reacção, sem enzima é misturada com 1 ml de NaOH 1M.
- Coloque as amostras de reacção de um bloco de aquecimento de 90 ° C durante 5 minutos para separar o produto resultante do AP local. Após o aquecimento, adicionar 1 ml de HCl 1 M para neutralizar cada uma das amostras.
- Adicionar um volume igual (12 ul) de tampão de carregamento de gel (95% de formamida, EDTA 20 mM, 0,02% de bromofenol, e 0,02% de xileno cianol) a cada amostra de reacção, e, em seguida, colocar a mistura num bloco de aquecimento de 95 ° C durante 2 min, em seguida, colocar imediatamente o tubo em gelo.
- Coloque as amostras (5 ul) para um gel desnaturante de poliacrilamida a 15% contendo 8 M de ureia em 89 mM de EDTA mM Tris-HCl, pH 8,8, ácido bórico 89 mM e 2. O substrato e os produtos clivados são bem separados depoisexecutando o gel.
2.2. Imagem do gel
- Digitalizar o gel utilizando um gerador de imagens que pode detectar o ADN marcado por fluorescência e visualizar as bandas do substrato e do produto.
- Quantificar as bandas depois de imagiologia do gel. Note-se que alguma clivagem do fundo podem ser observados após o tratamento do próprio substrato com NaOH (Figura 2A). Subtrair este pano de fundo a partir da quantidade medida de cada um dos produtos de reacção.
2.3. A análise dos dados
- Traça-se a quantidade de produto formado em cada tempo de reacção (t) (Figura 2B). Analisar os dados não processados usando a Equação 1 para determinar a amplitude do sinal de sincronismo (A 0, intercepção de y) e o declive da fase de estado estacionário linear (v ss).
- Enredoa intercepção y em relação à concentração de proteína total (isto é, concentração de enzima aparente; figura 2C), proporcionando uma medida da fracção de enzima activa. É um ajuste linear com uma intercepção de zero para proporcionar o factor de correcção para a determinação da fracção de enzima activa.
- Traça-se a taxa em estado estacionário em relação à concentração de enzima activa (Figura 2D), proporcionando a taxa de dissociação constante do produto (isto é, a inclinação da linha ajustada).
3. Medição do Tempo Curso Pré-steady-state
Como mostrado na Figura 2, a formação do produto durante a fase de explosão é demasiado rápido para medir por mistura manual e têmpera. Assim, um instrumento de fluxo rápido de têmpera pode fornecer um método poderoso para medir reacções rápidas que ocorrem na escala de tempo em milisegundos (Figura 3) 5. O instrumento usa um motor de accionamento controlado por computador, para rapidamente misturar umaª saciar reações após os tempos de reação especificados. Por exemplo, usar um RQF-3 Rápido Instrumento Quench-Flow Kintek para medir a fase de libertação inicial e subsequente fase de estado estacionário de formação do produto catalisado por OGG1. Rápido Instruments Quench-Flow estão disponíveis de vários fabricantes.
3.1. Preparação da amostra
Separadamente preparar substrato de ADN e OGG1 soluções em tubos de 1,5 ml, tal como descrito em 2-1. As concentrações de ADN e OGG1 activas são 400 nm e 80 nm, respectivamente. Isto resulta em concentrações finais de 200 nM e de ADN de 40 nm OGG1 activo após mistura 1:1 (v / v).
3.2. Preparação de instrumento rápido resfriamento de fluxo
- Ligação de um banho de água de circulação para o instrumento de fluxo rápido arrefecimento para controlo da temperatura (37 ° C).
- Ajuste dos parâmetros do aparelho e escolha do circuito de reacção adequada para o tempo desejado pontos de acordo com instruções do fabricanteções. Os laços de reacção são de comprimento variável para proporcionar tempos de reacção alternativos.
- Prepare tampão de reação e NaOH saciar soluções em 10 ml luer lock seringas descartáveis e anexar essas seringas para as portas da unidade e carregar os Reservatórios unidade com tampão de reação (seringas B) e NaOH 142 mM (seringa Q) (Seringa Válvulas de Carga em posição LOAD) . Para remover as bolhas de ar da seringa, trabalhar a solução e para trás várias vezes.
- Abaixe o motor de passo até tocar no topo das seringas (válvulas de carga de seringas e válvulas de carga Amostra na posição FIRE).
- Lave as amostras Loops, o ciclo de reação, ea linha de saída com água e metanol. Seque as áreas coradas por completo (válvulas em posição de descarga).
3.3. Curso de tempo pré-steady-state
- Fazer um buraco na parte superior de um tubo de 1,5 ml tapado com uma agulha de calibre 16. Anexar um tubo na linha de saída para recolher a reacção extinta.
- Defina o reactio desejadotempo n (em segundos), utilizando o teclado. O motor de passo será fazer o backup para ajustar o volume de loop, de modo a manter o volume de têmpera constante. Posição êmbolos de seringa B contra a plataforma de motor de passo, adicionando tampão com as seringas descartáveis ligados às portas da unidade.
- Preencha 1 ml luer lock seringas descartáveis com substrato DNA e OGG1 soluções, respectivamente (válvulas de amostra em posição LOAD). Anexar seringas com substrato DNA e OGG1 soluções para cada um dos portos de carga de exemplo e, em seguida, preencher os Loops amostra com substrato de DNA e OGG1 soluções, respectivamente (Amostra Válvulas de Carga em posição LOAD).
- Todas as válvulas de carga seringa e Amostra Válvulas de carga para a posição FOGO. Iniciar a reação por um golpe teclado (por exemplo, imprensa de "G" ou tecla "START"). Substrato de ADN e OGG1 soluções (18 mL de cada) são imediatamente misturados na Curva de Reacção.
- Aguardar até que a reacção é temperada a automaticamente o tempo de reacção desejado, misturando 36 ul da reaction mistura com 86 ml de NaOH 142 mM. Após extinção da reacção, a amostra é descarregada a partir da linha de saída.
- Defina as válvulas de carga da seringa na posição da carga e da Amostra Carga válvulas para a posição de descarga. Lave as amostras Loops, o ciclo de reação, ea linha de saída com água e metanol e secar como descrito no ponto 3.2. Repetir o procedimento acima para cada ponto de tempo.
- Realizar uma experiência de controlo sem enzima para determinar uma correcção do fundo, que pode ser feita manualmente ou com o instrumento de rápido arrefecimento. Para realizar um controle com o instrumento de rápido resfriamento, preencha o loop de amostra para DNA com substrato de DNA, mas manter o loop de amostra para OGG1 vazio. Definir o tempo de reacção, realizar a mistura e extingue-se tal como descrito no 3.3.4-3.3.6.
- Lave os Loops Amostra eo loop Reação com NaOH 2 M, 2 M HCl, água e metanol e, em seguida, secar as linhas lavados. Depois de definir o motor de passo para a posição inicial, mudar as válvulas de carga da seringa para a positio CARGAn e lavar os reservatórios com água da unidade.
- Tratar as amostras temperadas, com o calor de reacção, e, em seguida, separada do substrato e o ADN do produto de 15% de electroforese desnaturante em gel de poliacrilamida, como descrito no item 2.1.
- Visualiza e quantificar as bandas no gel, tal como descrito em 2.2.
3.4. A análise dos dados
Montar os cursos de tempo de formação do produto por análise de regressão não linear a uma equação com a subida dos termos exponenciais e linear (equação 2) proporcionando a constante de velocidade de primeira ordem (k obs), a amplitude do impulso (A 0), e um ritmo linear (v ss).
4. Curso Tempo único volume de negócios
- Preparar substrato de ADN e OGG1 em tubos separados de 1,5 ml como descrito em 2-1. A concenções de DNA e OGG1 activas são 100 nm e 500 nm, respectivamente, isto resulta em concentrações finais de 50 nM e 250 nM ADN OGG1 após mistura 1:1 (v / v).
- Preparar o aparelho de arrefecimento rápido de fluxo e preparar as amostras de reacção, tal como descrito em 3.2 e 3.3.
- Tratar as amostras de reacção interrompida com calor e sujeitá-las a 15% de desnaturação para electroforese em gel de poliacrilamida e os produtos de substrato separada, tal como descrito em 2.1.
- Visualiza e quantificar as bandas no gel, tal como descrito em 2.2.
- Montar os cursos de tempo da formação de um único produto para exponencial para determinar a constante de velocidade de primeira ordem (k obs) como dada pela Equação 3.
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Representative Results
A análise cinética de estado estacionário foi realizada usando 200 nM de substrato de ADN e quatro diferentes concentrações aparentes de OGG1 (15, 30, 45 e 60 nM), como determinado por um ensaio de proteína de Bradford 2. Os cursos de tempo da formação de produto foram ajustados a uma equação linear para determinar a intercepção de y, que foram de 2,2, 11, 15 e 26 nM, respectivamente, em relação a cada concentração de proteína (Figura 2B). A y-intercepta foram ainda traçada em relação a cada concentração de proteína real (Figura 2C). A fracção de enzima activa foi determinado ser de 38% a partir do declive da linha na Figura 2C. Para determinar a taxa de estado estacionário, v ss determinados a partir dos ajustes lineares na Figura 2B foram traçados em relação às y-intercepta (Figura 2D). O declive da linha na Figura 2D foi 0,0028 seg -1, o que é equivalente à taxa constante de dissociaçãopara o produto AP local e incisão AP local formado por DNA glicosilase / atividades liase.
Um curso de tempo de pré-estado estacionário foi seguido, usando 200 nM de substrato de ADN e 40 nM OGG1 activas. Os cursos de tempo da formação do produto pode estar apto a uma equação com o aumento dos termos exponenciais e linear. Como mostrado na Figura 4, kobs e koff foram determinados como sendo de 0,75 seg -1 e 0,0055 seg -1, 2, respectivamente. A amplitude da fase de explosão (33 nM), foi ligeiramente inferior à prevista a partir da concentração do OGG1 activa adicionada (40 nM). Isto pode ser devido à ligação não específica de OGG1 ao substrato de ADN que reduz o número de moléculas de enzima disponíveis.
Em condições de turnover único, a reacção de excisão 8-oxoG foi terminado dentro de 6 seg (Figura 5) 2. O tempo de formação do produto poderia estar apto a uma única exponencialequação e rendeu k obs de 0,74 seg -1. Notavelmente, a amplitude para a formação do produto foi inferior a 50 nM esperados adicionado substrato de ADN. Isto poderia ter sido devido em parte ao fundo da clivagem do ADN por tratamento com NaOH (Figura 2A) ou na presença de oligonucleótidos de substrato não recozido na mistura de reacção.
Figura 1. A purificação do OGG1 humano de E. coli. OGG1 O gene humano foi clonado em pGEX-6P-1, e sobre-expressa em BL21 (DE3) células. Pista 1, células não induzidas, pista 2, as células induzidas com IPTG, a pista 3, fracção de proteína solúvel, pista 4; glutationa Sepharose 4B após incubação com fracção de proteína solúvel, pista 5; fluxo através fracção após a incubação de glutationa sepharose 4B com 3 VFCC protease, pista 6; fluxo através fracção após a remoção de contaminantes de coluna Mono Q. Uma fotografia do azul gel corado com Coomassie é mostrado.
Figura 2. Cinética de estado estacionário e titulação sítio ativo purificado OGG1 2 OGG1 (15 Nm, ○, □, 30 nm, 45 nm, ◊, ou 60 Nm, ×). Foi incubado com 200 Nm substrato DNA (5'-CTGCAGCTGATGCGCC X TACGGATCCCCGGGTAC -3 ', onde X é a 8-oxoG emparelhado com C) a 37 ° C durante 1-30 min, conforme indicado. Estas concentrações de enzimas representam concentrações de proteína aparentes com base num ensaio de proteínas de Bradford, quantificada a partir de uma curva padrão de BSA. UM, géis de poliacrilamida desnaturante mostrando substratos separados (S) e os produtos (P). OGG1 (30 nM) e 200 Nm D NA substrato foi utilizado para a reacção. B, o período de formação de produto. Os dados foram ajustados a uma equação linear para determinar a amplitude da fase do sincronismo (intercepto-y) e uma taxa aparente de libertação do produto (inclinação). C, Lote de intercepções determinados a partir dos ajustes lineares em relação ao painel B que determinou pelo ensaio de Bradford. O declive da linha corresponde à fracção de enzima activa. A barra de erro indica que o erro na amplitude deduzir ajustes lineares para a formação do produto no painel B. D, lote das pistas determinada a partir dos ajustes lineares no painel B em relação à concentração de enzima activa. A barra de erro indica que o erro da inclinação deduzir ajustes lineares para a formação do produto no painel B. O declive da linha corresponde à taxa em estado estacionário (k off), 0,0028 seg -1.
Figura 3. Visão geral de Rapid Instrumento Quench-Flow.
Figura 4. Pré-cinética no estado estacionário de excisão 8-oxoG por OGG1 2. OGG1 (40 nM de enzima activa) foi incubado com 200 nM de substrato de ADN (5'-CATGGGCGGCATGAACC GAGGCCCATCCTCACC X-3 ', onde X é a 8-oxoG emparelhado com C) a 37 ° C durante 0-100 seg. A linha a ponteado indica uma extrapolação da fase de estado estacionário. Os dados foram ajustados à equação de ruptura com uma amplitude igual a 33 ± 0,89 nM, kobs igual a 0,75 ± 0,083seg -1, v s s iguais a 0,18 ± 0,018 nM seg -1 e koff igual a 0,0055 ± 0,020 seg -1.
Figura 5. Cinética rotatividade individuais de excisão 8-oxoG por OGG1 2. OGG1 (250 nM de enzima activa) foi incubado com 50 nM de substrato DNA (5'-CTGCAGCTGATGCGCC TACGGATCCCCGGGTAC X-3 ', onde X é a 8-oxoG emparelhado com C) a 37 ° C durante 0-60 seg. Os dados foram ajustados à equação exponencial simples com k obs igual a 0,74 ± 0,015 s -1. A linha pontilhada indica a amplitude extrapolada (isto produto a um tempo infinito).
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Discussion
As aproximações cinéticas descritas aqui delinear métodos para definir constantes cinéticas elementares. Se um decurso de tempo de formação do produto é bifásico, com a primeira reposição enzimática ocorre rapidamente, em seguida, um passo após a química é limitante da velocidade durante a rotatividade catalíticas subsequentes. No caso de OGG1, o primeiro volume pode ser medido utilizando elevadas concentrações de enzima, quer com a limitação (S <E) ou alta (S> E), as concentrações de ADN. No primeiro caso, a reacção é limitada a um 'turnover único "e fornece uma medida da velocidade catalítica no sítio activo da enzima. Neste último caso, várias das modificações enzimáticas são avaliadas. A sequência de formação do produto que ocorre durante o primeiro volume proporciona uma medida do evento química no sítio activo da enzima, enquanto Modificações subsequentes fornecem uma medida de o passo que limita a ciclagem catalítico. Além disso, a amplitude do sinal de sincronismo de formação do produto proporciona uma medida da enzima activa envolvida. Isto deve ser conhecido de modo a calcular a velocidade de dissociação constante do produto a partir da velocidade do estado estacionário (koff = v ss / E). Para OGG1, a libertação de ADN do produto (isto é, produto de ADN taxa constante de dissociação) limita ciclismo catalítico e da sua taxa em estado estacionário de 7,8. Tal como mostrado na Figura 4, o produto de ADN constante de velocidade de dissociação (koff = 0,0055 seg -1) para OGG1 é duas ordens de grandeza menor do que a taxa catalítica observada (kobs = 0,75 seg -1). É uma característica comum cinética de glicosilase de ADN que as bases de ADN danificadas consumo para ligar os seus produtos (ADN com um sitio não básico) firmemente de forma que a libertação do produto é limitante da taxa durante as medições do estado estacionário 1,8-10. É importante ressaltar que as medições de atividade em estado de equilíbrio, assim, fornecer uma maneira simples e direta para determinar o DNA do produto afinidade de ligação; menor atividade sugere apertado produto binding.
Conforme descrito na Figura 2 e resultados representativos, a fração ativa da enzima está determinado a ser de 38%. A fracção activa é inferior à determinada a partir da concentração de proteína, embora a enzima preparada é> 95% homogénea (Figura 1). Isto pode ser devido à ligação não específica da enzima para o substrato e / ou o método de determinação de proteínas que não podem avaliar com precisão a concentração de proteína verdadeira (por exemplo, ensaio de proteína de Bradford usa tipicamente albumina de soro bovino como padrão, que pode não ser um bom imitar para a enzima de interesse). Alternativamente, a concentração de proteína pode ser determinada por outros métodos ou estimada a partir de calculados os coeficientes de extinção molar de 280 nm como o desenvolvido por Gill e Von Hippel 11.
Como mostrado nas Figuras 4 e 5, a magnitude da kobs determinada from ao longo do tempo pré-steady-state deve ser coerente com o determinado a partir de um experimento de um único volume de negócios. O valor de k deve ser desligado também experimentalmente consistente entre os métodos cinéticos alternados. Se, no entanto, essas constantes de taxa são diferentes (por exemplo, k off é diferente entre as condições de estado estacionário e pré-estado estacionário), as diferentes etapas podem ser medidos por cada um método e um novo modelo deve ser considerada. Como alternativa, a inibição do produto ou a depleção de substrato pode influenciar a taxa de estado estacionário aparente num curso de tempo de pré-estado estacionário que contamina a porção linear.
Na situação em que as fases de estado estacionário de ruptura e não estão bem separadas (ou seja, k obs ~ k off), a amplitude do impulso e as constantes de velocidade observadas são compósitos de constantes de velocidade elementares para múltiplos passos 12. Além disso, se a liberação do produto é rápida (ou seja, k off> kobs), o curso do tempo de formação do produto não é bifásico (primeiro volume e rotatividade subsequentes são limitados pelo mesmo passo; química). Neste caso, um ensaio um único volume pode proporcionar uma medida de catálise.
Se é realizada uma abordagem de uma única rotação, para determinar uma velocidade catalítica intrínseca, a enzima suficiente deve ser usada para assegurar que a ligação não está parcialmente limitante da taxa. Da mesma forma, a ligação do substrato também deve ser rápida para que a taxa de ruptura não é limitada pela ligação do substrato. Para verificar que a ligação de enzima não é limitante da velocidade, durante uma experiência de um único volume, o curso de tempo é repetido com uma concentração de enzima diferente para confirmar que o curso do tempo exponencial não é alterada. Além disso, uma vez que a amplitude do curso de tempo de ruptura ou de um único volume é directamente proporcional à concentração de enzima ou substrato, respectivamente, as concentrações utilizadas devem ser escolhidas so Eles podem ser medidos de forma confiável. Finalmente, deve ser notado que, quando as taxas de ruptura e em estado estacionário não são bem separadas, a amplitude da rajada subestima a verdadeira concentração de enzima activa 12.
As abordagens descritas acima cinética proporcionar um método fiável para isolar passos chave durante o ciclo catalítico da glicosilase de ADN. Com estas constantes cinéticas de referência, a influência da alteração de sequência / estrutura 1,13-18 ADN, os resíduos no local activas 19,20, iões de metal 21, ou proteína acessória celular na catálise enzimática ou ciclismo pode agora ser avaliado 22-24.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. Julie K. Horton para a leitura crítica do manuscrito e Dr. Rajendra Prasad para sugestões e discussões úteis. Partes desta pesquisa foram originalmente publicado no The Journal of Biological Chemistry, Sassa A et. al., "DNA Sequence efeitos de contexto sobre a atividade glicosilase of Human glicosilase DNA 8 oxoguanine." J Biol Chem. 287, 36702-36710 (2012) 2. Este trabalho foi apoiado, no todo ou em parte, pelo National Institutes of Health Research Grant Projeto Z01-ES050158 no Programa de Pesquisa intramuros, NIEHS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| 5’-6-FAM labeled oligonucleotides containing a single 8-oxoG | Eurofins MWG Operon | 5’-P32 radiolabeled oligonucleotides can be used as well. Polyacrylamide gel purification grade is recommended. | |
| Unlabeled oligonucleotides (complementary strand) | Eurofins MWG Operon | Polyacrylamide gel purification grade is recommended. | |
| 1 ml BD Luer Lock disposable syringe | BD Medical | 309628 | Lue Lock disposable syringe from other vendors can be used as well. |
| 10 ml BD Luer Lock disposable syringe | BE Medical | 309604 | Luer Lock disposable syringe from other vendors can be used as well. |
| Equipment | |||
| Circulating water bath | Any vender | ||
| RQF-3 Rapid Quench-Flow Instrument | KinTek Corporation | Rapid Quench-Flow Instrument from other vendors can be used as well. | |
| Typhoon Phosphorimager 8600 | GE Healthcare Life Sciences | Imager from other vendors can be used as well. | |
| KaleidaGraph | Synergy Software | ||
References
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