Summary
تقنية لزرع "المتطرفة الأمامي المجال" بين أنسجة الوجه القيطم المورق وقد تم تطوير الأجنة. يمكن نقل الأنسجة من احد خلفية التعبير الجيني إلى أخرى، والسماح للدراسة المتطلبات المحلية للتنمية والقحفي للانزعاج التفاعلات بين مناطق الوجه.
Abstract
تحدث العيوب الخلقية القحفي في 1 من كل 700 ولادة حية، ولكن نادرا ما يعرف المسببات بسبب الفهم المحدود للتنمية القحفي. لتحديد حيث مسارات الإشارات والأنسجة التصرف خلال الزخرفة من الوجه النامية، وقد تم تطوير تقنية "زرع وجه" في الأجنة الضفدع القيطم المورق. تتم إزالة المنطقة من أنسجة الوجه الظني (في "المتطرفة الأمامي المجال" (EAD)) من جنين المانحة في مرحلة tailbud، وزرعها إلى الجنين المضيف من نفس المرحلة، والتي تمت إزالة المنطقة يعادلها. وهذا يمكن أن تستخدم لتوليد وجه خيالية حيث الأنسجة المضيفة أو المانحة له الخسارة أو الربح من وظيفة في الجينات، و / أو يتضمن تسمية النسب. بعد الشفاء، ويتم رصد نتائج التنمية، ويشير إلى أدوار مسار الإشارات داخل الجهة المانحة أو الأنسجة المحيطة المضيف. القيطم يمثل نموذجا قيما للتنمية وجهه، ومنطقة الوجه كبيرة وبسهولة وccessible لالمجهرية. يمكن أن يعاير العديد من الأجنة، على مدى فترة زمنية قصيرة منذ حدوث التنمية بسرعة. النتائج في الضفدع ذات الصلة بالتنمية البشرية، منذ ظهور عمليات الحفظ القحفي بين القيطم والثدييات.
Introduction
لفهم الآليات الكامنة وراء العيوب القحفي الولادة 1-2، والأنسجة الهامة والمساهمات إشارة أثناء تطوير القحفي يجب تحديدها. في الضفدع القيطم المورق، جزء من الوجه، بما في ذلك الفم وشكل الخياشيم من "المتطرفة الأمامي المجال" (EAD)، حيث الأديم الظاهر الأديم الباطن ويتم جنبا إلى جنب مباشرة 3-4. يعمل EAD أيضا كمركز إشارات للتأثير على الأنسجة المحيطة بها، بما في ذلك قمة العصبية في الجمجمة، الذي يشكل الفكين والوجه المناطق الأخرى 5. لتحديد الجينات التي تساهم في وظيفة هيئة البيئة، وقد تم تطوير تقنية "زرع وجه"، حيث يتم زرع أنسجة من متبرع إلى الجنين المضيف، بعد إزالة منطقة المضيف المقابلة. بعد زرع، مما أدى تنمية الوجه وتقييمها. وبالتالي، يتم تحليل آثار فقدان وظيفة (LOF) أو مكسب من وظيفة (GOF) لجين معين في هيئة البيئة محليا، حيث بقية حوتتألف هيئة البيئة والجسم من النوع البري الأنسجة. زرع متبادلة لا يمكن أن يؤديها، حيث يتم زرع نوع البرية الأنسجة في الأجنة مع LOF العالمية أو صندوق القناص في جينات معينة. وقد تم زرع يكثر استخدامها في القيطم والدراسات فرخ 6. على سبيل المثال، تناول زرع القيطم الحث متماثل التوالد العصبية، عدسة والكفاءة العصبية، والعصبية الهجرة قمة 7-10. السمان-فرخ تطعيم خيالية وقد حللت تطوير لوحة الأمامية العصبية، التلال العصبية الأمامي، قمة العصبية، وعظام الجمجمة 11-14. هذا هو الأسلوب زرع أول لدراسة التنمية القحفي في القيطم. وقد أثبتت هذه التقنية دورا رواية لمثبطات WNT Frzb1 والهلال في تنظيم تشكيل الغشاء القاعدي في الفم الظني 5. القيطم المورق هو نموذج مثالي لدراسة التطور القحفي كما أجنة كبيرة، وتطوير خارجيا، والثانية الوجه مرئيا بسهولة، مما يسمح المجهرية والتصوير التنمية. تظهر الآليات الكامنة وراء تطوير الوجه حفظها، مشيرا إلى أن النتائج قدمت في الضفدع توفير نظرة ثاقبة التنمية البشرية 4،15-16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الكواشف إعداد
- 10X MBS: تحضير 1 لتر من 10X التعديل المالحة بارت (MBS) حل 17. الرجوع إلى الجدول رقم 1، الكواشف، والمكونات، والتعليمات. استخدام الماء المقطر لجميع الحلول. المزيج في كوب، وذلك باستخدام شريط ضجة، حتى حل كامل. وينبغي بذل كل الحلول في درجة حرارة الغرفة.
- 1X MBS: تمييع 100 مل من 10X MBS الحل في 900 مل من الماء المقطر لجعل 1 لتر من 1X MBS. إضافة 0.7 مل من 1 M و CaCl 2 الحل.
- 0.1X MBS: تمييع 1X MBS لإعداد 1 لتر من 0.5X MBS الحل و 2 L من 0.1X MBS الحل. إلى 1 L من 0.1X MBS الحل، إضافة 1 مل من 10 ملغ / مل حل الجنتاميسين. وسوف تستخدم الحل MBS 0.1X مع الجنتاميسين للثقافة الجنين على المدى الطويل.
- Ficoll / MBS: إضافة 15 غراما من Ficoll 400-500 مل من محلول 0.5X MBS. مزيج بقوة. إضافة شريط ضجة وتخلط حتى يذوب Ficoll بالكامل (عدة ساعات).
- 70٪ من الإيثانول: تمييع الإيثانول بنسبة 100٪ إلى 70٪ من الإيثانول باستخدامالماء المقطر.
2. إعداد زجاج أدوات التشغيل
- إعداد إبرة: تحميل الأنابيب الشعرية في مجتذب الإبرة.
- سحب الإبر وفقا للإعدادات هو مبين في الجدول رقم 2: إعدادات ساحبة الإبرة. الإعدادات هي لmicropipette مجتذب سوتر شركة الصك النموذجي P-80/PC والأنابيب الشعرية، كما هو موضح في الجدول الكواشف والمعدات الخاصة. ومع ذلك، فإن هذه الإعدادات خاصة إلى إبرة مجتذب سوتر، وسوف تحتاج إلى تعديل لآلات أخرى. يمكن تحديد إعدادات باستخدام اختبار منحدر، على النحو المحدد من قبل الشركة المصنعة للجهاز.
- سحب الإبر 4-6 استعدادا لإجراء العملية. ينبغي كسر الإبر بحيث مرنة، مثل الشعر جزء من طرف زجاج تتم إزالة بشكل كامل، والذي هو عادة 2-3 ملم طويلة. يجب أن يكون الطرف جامدة نسبيا، ولكن لا تزال ضيقة بما يكفي لاستخدامه كأداة القطع. انظر الصورة من إبرة مثالية في الشكل 1A. تخزين الإبر في طبق بتري مع شريط من الطين أسفل المركز. اضغط على رمح من كل إبرة في الطين، ليثبت في مكانه وللحفاظ على طرف حاد هشة بعيدا عن القاع والجوانب.
- لأدوات إضافية، الحصول على الزجاج زلات الغطاء، وزوج من ملقط طويل القياسية النمط، وناسخ بنسن و3-4 ماصات باستور الزجاج (حجم 5 ¾ في).
- أداة ماصة: لجعل أداة ماصة، وعلى ضوء الموقد بنسن ووضع غيض من ماصة باستير الزجاج في الجزء الأزرق من اللهب في حين تناوب عليه، مثل أن يذوب طرف والحفرة تماما والأختام، وتشكيل، نهاية تقريب مغلقة . يتم استخدام مدورة، غيض مختومة في وقت لاحق لجعل المنخفضات في صحن الطين التي تحمل أجنة أثناء العملية. انظر الشكل 1B.
- الجسور الزجاج: لجعل الجسور الزجاجية، واستخدام الملقط نمط القياسية طويلا لكسر بعناية من 3 مم 3 مم قطع من الزجاج غطاء زلة. في حين الضغط على قطعة من الغطاء زلة مع رweezers، وضع الزجاج في اللهب حتى عن حواف أربعة تليين ومنحنى الهبوط، وتشكيل الزجاج قبة صغيرة. يجب على حواف لم تعد حادة. انظر الشكل 1C.
- تخزين الجسور زلة غطاء زجاجي عن طريق إدراج لهم، حواف إلى أسفل، في الصلصال، بطانة الجزء السفلي من طبق بيتري. إدراج الجسور بحيث الجزء العلوي من الجسر لا يزال فوق سطح الطين. لا تدفع جدا مثل الصلب الذي فواصل الجسر، وعدم تضمين بالكامل الجسر في الطين، لأنه يمكن أن يكون من الصعب إزالته. بعد التعقيم بلهب أو 70٪ من الإيثانول، والجسور يمكن إعادة استخدامها من تجربة إلى تجربة.
3. التحضير للعملية الأجنة
- خط 60 مم طبق بتري بلاستيكية صغيرة مع الصلصال. بين الاستخدامات، ويتم غسل سطح الطبق والطين جيدا بالماء المقطر ثم مع الايثانول 70٪.
ملاحظة: استخدم الأحمر والأبيض أو الأصفر، فان أكين Plastalina الصلصال، والتي يمكن شراؤها في المحلية لذ أو متجر الفن. لا ينصح السوداء الطين لأنه يطلق بقايا. - ملء الطبق مع 3٪ Ficoll MBS 0.5X حل. تركيز أعلى من الملح يمنع تفكك الأنسجة، ويساعد على Ficoll السكاريد رشاقته الحل، الذي يساعد في عقد وجهه في الموقف.
- استخدام أداة ماصة باستور ملتهب (انظر الشكل 1) لجعل الضحلة، 2-3 ملم المنخفضات في الطين، عن عمق الجسم الجنين المرحلة 20. جعل المنخفضات 20-30، 1-2 مم وبصرف النظر، على كل جانب من الطبق، حتى لا يكون هناك ما مجموعه 40-60 المنخفضات. تسمية جانب واحد LOF / صندوق القناص، وعلى الجانب الآخر من النوع البري، من خلال نحت بالاحرف الاولى في الطين بالملقط.
4. إعداد Preoperation الأجنة
- الحصول على والثقافة القيطم المورق أجنة باستخدام الطرق القياسية 17. للحصول على وصف مفصل لتربية الضفادع، يرجى الاطلاع SIVE وآخرون 17
- ثمانية وأربعين ساعة قبل التجربة obtaفي بيض الضفادع من الإناث وإجراء التخصيب في المختبر.
- حقن 0.5-1 نانوغرام من الغشاء مرنا توج GFP، بالإضافة إلى أي مرنا المطلوب أو مكافحة الشعور المعدلة morpholino أليغنوكليوتيد] العقاقير ("morpholinos") في مرحلة خلية واحدة أو في خلايا 2 في المرحلة 2 الخلية. مرحلة خلية واحدة تستغرق حوالي 70-90 دقيقة. حقن إجمالي حجم 1-3 NL. بدلا من الترميز الحمض النووي الريبي لبروتين فلوري (مثل GFP أو طلب تقديم العروض RNA)، يمكن للمرء أن حقن morpholino FITC المسمى أو ديكستران fluorescently المسمى. مضان مهم لتحديد ما إذا كان زرع يشفي الأنسجة ويبقى في الرأس.
- توج مرنا يمكن إعداد من البلازميد خطي باستخدام SP6 mMessage mMachine أو عدة T7. Morpholinos يمكن تصميم وأمر من خلال أدوات جين LLC. يجب تحديد مبلغ morpholino المطلوبة للتأثير المطلوب لكل الجين 18.
- تخزين الأجنة حقن في 15 درجة مئوية لمدة 48 ساعة، حتى تصل إلى مرحلة 19-20. (Fأو جميع الخطوات اللاحقة، مرحلة الأجنة وفقا للجدول عادي من القيطم المورق بواسطة Nieuwkoop وفابر 19).
ملاحظة: في يوم من الجراحة، يجب أن يكون كلا المتلقية والبلدان المانحة الأجنة داخل مرحلة واحدة من بعضها البعض لزرع للعمل على النحو الأمثل. ومع ذلك، مع حقن الأجنة morpholinos ("morphants") تطوير في بعض الأحيان ببطء أكثر من نوع البرية أو السيطرة الأجنة morphant، مما يجعل من الضروري تنسيق التجارب ذلك على حد سواء morphant والأجنة النوع البري هي في نفس المرحلة. قد تحتاج Morphants إلى الحفاظ عليها في درجة حرارة أعلى لمدة 12-24 ساعة قبل الإجراء. لزيادة احتمال أن الأجنة يمكن العثور عليها في المراحل مطابقة، يمكن الحفاظ على الأجنة في عدة درجات الحرارة. أربع وعشرين ساعة قبل التجربة، ينبغي للمرء أن تقسيم الأجنة في عدة أطباق، وmorphants مكان في 18-20 درجة مئوية، والأجنة النوع البري في 15-18 درجة مئوية.
- في يوم من التجربة زرع، عينياوفه الأجنة من the15 ° C الحاضنة وتنظيم وفقا لNieuwkoop وفابر 19. إذا كانت أصغر من أواخر العصيبة (المرحلة 19)، وترك لهم في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 ساعة، حتى تصل مرحلة 19.
- فحص الأجنة حقن تحت المجهر الفلورسنت. حدد الأجنة التي تظهر موحدة، مضان مشرق للتجربة.
- إزالة فوضى والملوثات المحتملة بالقرب من منطقة التشغيل. مسح أسفل سطح التشغيل، stereomicroscope وجميع الأدوات مع الايثانول 70٪.
- مرة واحدة على الأجنة في مرحلة 19، وإزالة الغشاء المحي باستخدام # 5/45 ملقط دومون تحت stereomicroscope.
- إزالة الغشاء المحي من 20-30 من كل من الجهات المانحة والأجنة المضيفة.
- لأول وجه عدة تجارب زرع، ينبغي للمرء ممارسة مع عدد قليل من الأجنة لكل حالة. هذه الطريقة صعبة ويتطلب ممارسة الحذر قبل أنها يمكن أن تستخدم على نطاق أوسع، وبسرعة وبنجاح. يمكن للمرء أن يعمل يوع لفعل زرع 20 / التجربة.
- نقل الأجنة المضيفة في طبق التشغيل باستخدام البلاستيك تخرج نقل ماصة مع طرف قطع بحيث يكون الافتتاح أوسع بكثير من جنين (ما لا يقل عن بضعة ملليمترات). كن حذرا لتجنب لمس الأجنة إلى فقاعات أو سطح الماء، والأجنة سوف تنفجر في التوتر السطحي.
- استخدام # 5/45 ملقط لإدراج الأجنة في المنخفضات الطينية، مع الخلفي من الجنين في الطين. بلطف إغلاق الطين حول قواعد الجنين باستخدام ملقط، وترك الربع العلوي من الجنين، الرأس، جاحظ من الاكتئاب.
- مرة واحدة يتم تأمين جميع الأجنة المضيفة في المنخفضات، والانتقال إلى الجانب الآخر من اللوحة والبدء في إدراج الأجنة المانحة في المنخفضات بهم. تكرار عملية تأمين الأجنة في آبارهم.
5. أداء جراحة زرع الوجه
- قطع سكين: سكين وقطع لإزالةمن الأنسجة EAD المانحة، استخدام إبرة الزجاج الشعرية كسر بشكل مناسب (انظر الخطوة 2.3 والشكل 1).
ملاحظة: يمكن للمرء أن يعقد مباشرة الشعرية بين الأصابع (وهذا يعمل بشكل جيد للأشخاص الذين يعانون الأيدي الصغيرة) أو واحد يمكن تحميل إبرة في حامل دبوس الحشرات. الإبر التنغستن Electrosharpened 17 تحميلها في حامل دبوس يمكن استخدامها بدلا من إبرة الأنابيب الشعرية. يرجى الاطلاع أصحاب دبوس المقترحة والإبر التنغستن في جدول الكواشف محددة والمعدات. - تحت stereomicroscope، أدخل الإبرة في رأس الجنين إلى اليسار للغدة الاسمنت. ينبغي إدخال الإبرة بعمق، بحيث يمر من خارج الجنين، من خلال الرأس، وإلى المعى الأمامي. لزرع EAD بأكمله، ينبغي خفض تمتد من خارج الجنين إلى المعى الأمامي. لزرع-الأديم الظاهر فقط، وينبغي أن تكون التخفيضات عمقا وتمتد إلا من خلال الأديم الظاهر.
- نفض الغبار الإبرة من الجهة اليسرى إلى الجانب الأيمن منرئاسة، عبر عرض كامل للغدة الاسمنت. لعبها لا يقل أهمية عن الحركة يعطي قطع نظيفة. الرجوع إلى الشكل 2A للحصول على ملخص للتقنية والشكل 2B لمظاهرة من التخفيضات. الغدة الاسمنت والعيون هي المعالم الهامة للتخفيضات. ترتيب التخفيضات لا يؤثر على النتيجة ويمكن أن تختلف على أساس تفضيل المستخدم أو الطغيان.
- وضع الإبرة في بداية الخفض السابق، على الحدود اليسرى للغدة الاسمنت، ونفض الغبار الإبرة إلى أعلى حتى تصل إلى أسفل العين اليسرى. هذا سيخلق قطع رأسي من الحدود اليسرى للغدة الاسمنت لأسفل العين اليسرى.
- وضع الإبرة على الحدود الأيمن من الغدة الأسمنت، ونفض الغبار الإبرة إلى أعلى حتى تصل إلى أسفل العين اليمنى. هذا سيخلق قطع رأسي من الحد الأيمن للغدة الاسمنت لأسفل العين اليمنى.
- لاستئصال كامل النسيج، فليكك الإبرة من أسفل العين اليسرى إلى أسفل العين اليمنى، وخلق خفض الأفقية التي ستفرج الأنسجة. يمكن تمديد التخفيضات من خارج الجنين إلى المعى الأمامي، بما في ذلك الأديم الظاهر الأديم الباطن وهيئة البيئة في ازدراع. بالتناوب، والتخفيضات الضحلة يمكن استخدامها لالأديم الظاهر فقط زرع EAD. مرة واحدة تتم إزالة الأنسجة EAD، يجب أن يكون هناك حفرة مستطيلة من خارج الجنين في المعى الأمامي، وتمتد من الغدة الأسمنت إلى أسفل العينين (الأعلى إلى الأسفل). الثقب ينبغي أن تمتد من الحدود داخل العين اليسرى إلى الحدود داخل العين اليمنى (جنبا إلى جنب). انظر الشكل 2BB.
- دفع بلطف الأنسجة رفعه على رأس الإبرة، ورفعه من خلال المخزن المؤقت إلى جزء من صحن يحتوي الأجنة المضيفة. لا تعرض الأنسجة إلى الهواء السطحي أو أنها سوف تصبح التالفة.
- استئصال الأنسجة نفسها من الجنين المضيف، كما للمتبرع. تجاهل ازدراع EAD المضيف أو حفظه إلى INSERر في وجه الجهات المانحة، لزرع متبادلة.
- إدراج يزدرع المانحة في حفرة المضيف الناتجة باستخدام # 5/45 ملقط.
- مرة واحدة يتم وضع الأنسجة المانحة بشكل صحيح وإدراج بالكامل، ووضع بعناية جسر الزجاج (انظر الشكل 1 والشكل 2BC) على وجهه الجنين لاجراء عملية الزرع في المكان. يجب على طرفي الجسر إدراج في الطين، عقد في مكانه. الجسر يجب أن تطبق بلطف الضغط على الأنسجة المزروعة مثل أن زرع تقع مطاردة مع رئيس المضيفة، دون أن تخرج من الرأس أو الكذب عميقة داخل الرأس. رئيس يمكن بالارض قليلا من انزلاق الغطاء، ولكن يجب الحرص على عدم الاضرار الجنين مع الكثير من الضغط. يجب أن يتم تنفيذ عمليات زرع في غضون 5 دقائق.
ملاحظة: محقق من ذوي الخبرة يمكن أن تؤدي نحو عشرين زرع في التجربة، أكثر من 2-3 ساعة. خلال هذه الفترة الأجنة سوف تقدم من مرحلة 20-22. استكمال عملية زرع وجهو في المرحلة 21 أو 22 لا تؤثر على نتائج. زرع في وقت لاحق (في مراحل 22-26) يمكن القيام به ولكن أكثر صعوبة كما هو تضييق EAD المنطقة خط الوسط خالية من قمة الجمجمة كما التحركات قمة العصبية في الوجه. الاتساق عبر زرع أمر بالغ الأهمية.
6. زرع وجه آخر للبترول استعادة
- وعادة ما يستغرق الشفاء 2-3 ساعة. ترك الأجنة في درجة حرارة الغرفة دون عائق في المنخفضات الطينية مع الجسور الزجاجية الأنسجة المانحة عقد في المكان.
- مرة واحدة وقد شفى زرع، وإزالة بعناية الجسور الزجاجية، وإزالة الطين من حول قاعدة الأجنة باستخدام ملقط، واستخدام تخرج من البلاستيك ماصة نقل لفراغ بلطف الأجنة من المنخفضات بهم.
- وضع الأجنة في طبق بتري وصفت بشكل مناسب، وشغل نصف مع MBS 0.1X نظيفة مع الجنتاميسين.
- نمو الأجنة عند 15 درجة مئوية أو 18 درجة مئوية لعدة أيام حتى وصولها إلى مرحلة تغذية الشرغوف في المرحلة 40، ثيمكن سجل الظواهر الوجه الدجاجة.
- يجب تغيير الحل MBS 0.1X مع الجنتاميسين اليومية، ويجب إزالة أي أجنة ميتة على وجه السرعة لمنع التلوث وفاة الأجنة الأخرى.
- يفتح فمه في المرحلة 40. في مرحلة 40-41، يجب على المرء أن تأكد من أن الأنسجة المزروعة لا يزال تلتئم في المكان عن طريق عرض مضان لها. زرع تقع من حين لآخر، لذلك يجب على المرء أن تأكد من أن جميع الأجنة وسجل لديهم الأنسجة المانحة في المكان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ينبغي إدراج الأنسجة المزروعة بالكامل في رأس المضيف بعد زرع كما هو مبين في الشكل 3A، ولها جسر زجاجي يوضع بشكل مناسب على وجه الجنين، كما هو مبين في الشكل 2BC. يجب أن يكون الحجم الأنسجة المانحة المزروعة بشكل صحيح لافتتاح المضيف، لزرع لتكون ناجحة. يجب الأنسجة EAD لا تبرز من الرأس، بأي شكل من الأشكال، كما رأينا في أرقام 3B و 3C. بالإضافة إلى ذلك، لا ينبغي أن استدارة زرع وجه النسبية لموقعها في الجسم المانحة، كما هو مبين في الشكل 3D. بعد عدة ساعات، ينبغي أن الأنسجة المزروعة والوجه المحيطة شفاء، وبحلول اليوم التالي، يجب أن يظهر الجنين كما هو مبين في المثال في أرقام 4A 4A و'. يمكن للمرء أن يلاحظ، في إطار مضان، أن زرع لا يزال في مكانه في الشكل 4B. في المرحلة 41، والأنسجة المزروعة السيطرة مقاولاتIBUTE إلى الفم، وستبقى خضراء الفلورسنت، وينظر في الشكل 4B ". النوع البري EAD الأنسجة المزروعة في المضيفين النوع البري ينبغي أن تؤدي إلى وجوه عادية، بالمقارنة مع رابط الجأش الأجنة النوع البري. ومع ذلك، مع LOF أو GOF الأنسجة المانحة، يواجه ينبغي أن تلتئم وتبقى في الرأس، ولكن هذه قد تكون أو لا تؤدي إلى هياكل القحفي العادية، كما هو مبين في الشكل (3) من ديكنسون وSIVE 5.
| كاشف | المكونات | تعليمات |
| 1 M و CaCl 2 الحل | 111 غرام من و CaCl 2 لتر الواحد | الأوتوكلاف وتخزينها في 1 مل aliquots في -20 أو 4 درجات مئوية. |
| 10X التعديل المالحة (MBS) الحل بارت | 880 ملي مول كلوريد الصوديوم، 51.4 غرام | ضبط حجم ما يصل الى 1 لتر بالماء المقطر. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.8 النهائية مع هيدروكسيد الصوديوم وثم الأوتوكلاف. |
| 10 ملي بوكل، 745.5 ملغ | ||
| 10 ملي MgSO 4، 1.2 غرام | ||
| 50 ملي HEPES (الرقم الهيدروجيني 7.8)، 11.9 غرام | ||
| 25 مم 3 NaHCO، 2.1 غرام | ||
| 1X MBS الحل | تركيزات النهائي: | إعداد 1X MBS حل عن طريق خلط 100 مل من 10X MBS أملاح الحل مع 0.7 مل من 1M و CaCl 2 الحل. ضبط حجم ما يصل الى 1 لتر بالماء المقطر. تمييع هذا الحل إلى جعل MBS 0.5X 0.1X وMBS. |
| 88 ملي مول كلوريد الصوديوم | ||
| 1 ملي بوكل | ||
| 0.7 مم CaCl 2 | ||
| 1 ملي MgSO 4 | ||
| 5 ملي HEPES (الرقم الهيدروجيني 7.8) | ||
| 2.5 مم 3 NaHCO |
الجدول 1. الكواشف، والمكونات، والتعليمات.
| حرارة | سحب | فيل. | وقت |
| 800 | 70 | 40 | 50 |
الجدول 2. إعدادات بولير إبرة *.
* ضبط الإبرة ساحبة تختلف من آلة إلى آلة لذلك سيكون لكل مختبر ربما تحتاج لتحسين إعدادات ساحبة إبرة خاصة بهم.
الشكل 1. الأدوات المستخدمة. A) يظهر سليمة، إبرة دون انقطاع وكسر إبرة بعد أن تم إزالة غيض مرنة. B) يصور اثنين من أدوات ماصة مع غاياتهم مختومة بالكامل وتقريبه. C) المعارض ثلاثة جسور الزجاج العينة. قضبان مقياس = 1،000 مم.
يتم حقن تخطيطي لطريقة زرع وجه الجنين مع وكيل الفلورسنت والعقاقير morpholino نيوكليوتيدات دقيقة في مرحلة الخلية 1: مخطط الشكل 2 ملخص الوجه طريقة زرع A) زرع العامة... وكيل الفلورسنت يمكن أن تكون إما GFP مرنا، morpholino FITC الموسومة، أو ديكستران الفلورسنت. ب. تتم إزالة الفم افتراض في مرحلة 22 من مضيف البرية نوع الجنين والجنين morphant المانحة. ويمكن أيضا توسيع الأنسجة المزروعة لتشمل الأنف الظني، التي تقع مباشرة فوق منطقة الفم. يتم زرع الأنسجة morphant المانحة لنوع المضيف البرية، ثم يتم تأمين في مكان مع جسر الزجاج. قوس غراي: الفقس الغدة.
الرقم 3. تخطيطي للأجنة بعد وقت قصير من الزرع. يتم عرض وجهات النظر أمامي. ويرد الأنسجة المزروعة في النقط الحمراء. ألف وألف "تصور نتيجة مثالية في المرحلة 22. يتم إدراج الأنسجة بالكامل وضعه بشكل صحيح في الرأس. B و B 'تظهر زرع غير صحيحة، مع إدراج الأنسجة جزئيا في الرأس. C و C' تظهر زرع غير صحيحة مع معظم الأنسجة إدراجها في الرأس، ولكن المنطقة الزائدة وجاحظ من موقع الشفاء. وهذا النسيج يتنخر، وتمنع شفاء المحيطة والمناطق إدخالها بشكل صحيح. التطوير وعرض D 'زرع غير لائق، حيث تم استدارة الوجه في البلد المضيف، نسبة إلى موقعها في الجهة المانحة. روالقضية شفاء في الرأس، ولكن وجهه لا تتطور بشكل طبيعي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. الأجنة أقدم مع نتائج مثالية. يتم عرض وجهات النظر أمامي. CG: الغدة الأسمنت؛ مو:. الفم A) يعرض الجنين بعد يوم واحد زرع، والتي تبين عملية زرع تلتئم بشكل صحيح في المرحلة 32 A ') يظهر هذا الجنين نفسه مع تراكب الفلورسنت، مؤكدا أن الأنسجة المزروعة لا يزال في مكانه B. ) المعارض نفس الجنين في المرحلة 42 والتي كان لها morpholino السيطرة، GFP + زرع عدة أيام قبل. وقد وضعت وجهه بشكل صحيح. B ')يظهر نفس الجنين مع تراكب الفلورسنت، مؤكدا أن الأنسجة المزروعة لا يزال في الرأس وساهم عادة إلى هياكل الوجه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
خطوات حاسمة والقيود: إن EAD وجه إجراء عملية زرع حان الوقت والعمل المكثف. ذلك يتطلب ممارسة واليدين ثابتة، والبراعة إلى الكمال. يعتمد بروتوكول زرع وجه على قدرة الباحث لإزالة الأنسجة بكفاءة والزرع. إذا كان واحد يأخذ وقتا طويلا لإدراج زرع في وجه المضيف، ووجه المضيف بدء التعاقد وشفاء. ملقط يمكن استخدامها لتوسيع المنطقة بدقة الوجه. ومع ذلك، إذا حدث جرح كبير الانكماش، وزرع لن تلتئم بالاضافة الى ما قد تحتاج إلى تخفيض في حجم لتناسب حفرة المضيف الوجه. حجم وشكل زرع يجب أن تتطابق تقريبا حجم وشكل تجويف المستلم الوجه، للسماح الإدراج الناجح.
زرع وجه هي الأكثر نجاحا عندما يقوم بين 19-22 مراحل، مع الأجنة التي تقابلها المرحلة. زرع وجه في السن، بين المراحل 22-26، أمر ممكن، ولكن هي أكثر تحديا ود قد يعطل الهجرة قمة العصبية في جانبي الوجه منذ المنطقة خط الوسط خالية من قمة يصبح أضيق بكثير من مرحلة 22-26.
يجب أن يكون كل من المتلقي والجهات المانحة في مراحل مماثلة لزرع للعمل على النحو الأمثل. من الناحية المثالية، ينبغي أن تكون نفس المرحلة، ويكون الحد الأدنى ليكون في غضون ساعات قليلة من بعضها البعض. الأجنة حقن العقاقير [أليغنوكليوتيد-RNA morpholino ("morphants") تطوير في بعض الأحيان ببطء أكثر من نوع البرية أو السيطرة الأجنة morphant، والتي تتطلب أن morphants زراعتها في درجة حرارة أعلى لمطابقة مراحل نوع الأجنة 'البرية.
لا ينبغي أن تكون استدارة الوجه الأنسجة المانحة في الجسم المضيف نسبة إلى موقعها الأصلي في الجنين المانحة، وإلا فإن الوجه لا تتطور بشكل طبيعي. لا تحتاج الغدة الأسمنت ليتم تضمينها في زرع وجه لإجراء العملية للعمل، ووجه يتطور عادة دون ذلك. ومع ذلك، غالبا ما يتم تضمين الغدة الاسمنت في رانه استأصل أنسجة الوجه لأنه بمثابة علامة مميزة للإشارة ووضع الجزء السفلي من عملية الزرع. هذه العلامة سوف يساعد على تجنب الخطأ الدورية الأنسجة أثناء نقل أنسجة الوجه إلى المستلم. إذا كان قد تم إدراج زرع بشكل غير صحيح في وجه المضيف، يمكن إزالة الأنسجة المانحة والتخلص منها. يمكن للمرء أن محاولة إدراج عملية زرع جديدة في نفس المضيف، إذا فتح لم تبدأ لانقباض. ومع ذلك، إذا فتح المضيف قد تقلصت بشكل ملحوظ، ثم تجاهل المضيف والبدء من جديد.
لا بد من وضع الجسر الزجاجي مباشرة على الوجه المزروع، بحيث يتم عقد زرع في رأس المضيف أثناء الشفاء. إذا لم يتم عقد زرع في مكان، ويمكن زرع مقذوف من وجه المضيف. سوف الزرع التي لا يتم إدراجها بالكامل في الوجه أو التي تخرج أثناء الشفاء الخضوع نخر. حتى في زرع الكمال، قد تحدث كميات صغيرة من موت الأنسجة حول حواف سو عملية الزرع. عادة هذا لا يسبب آثارا ضارة ووجه طبيعي تماما لا يزال من الممكن تشكيلها. في الضوابط ناجحة أننا لم يلحظ أي تشوه بعد أربعة أسابيع من التنمية مما يدل على أن غضاريف شكلت عادة والتي رفض الأنسجة أمر نادر الحدوث.
أخيرا، إذا كان morpholino يشوش على البروتين اللازم لالتئام الجروح العادية، قد لا تعمل هذه التقنية، كما لا يجوز إدراج الأنسجة LOF زرعها في رأس المضيف.
ويمكن إجراء تعديلات على الإجراء: تعديلات ممكنة ومشاكل وحلول. مع الممارسة، ويمكن للباحث معرفة زرع مناطق أصغر، على سبيل المثال، نصف EAD. شقوق الضحلة تسمح زرع الأدمة، وترك أعمق الأديم الباطن دون عائق. مناطق أخرى من الأنسجة الجنينية يمكن زرعها، وذلك باستخدام نهج مماثلة.
إذا مات النسيج المزروع بعد الإدراج، وهناك زوجين من عأسباب ossible. الأنسجة المزروعة التي لم يتم إدراجها بالكامل في المضيف أو عقد مناسب في المكان مع جسر الزجاج، وسوف يموت وتعيق الشفاء المناسبة. تأكد من إدراج تماما الأنسجة المزروعة وضمان الحصول عليها في مكان مع جسر الزجاج. إذا مشتق من عملية الزرع أو morpholino حقن الحمض النووي الريبي المانحة، ثم الأنسجة قد يموتون بسبب التسمم من وكلاء حقن. وبالمثل، إذا الأجنة المضيفة morphants أو حقن الحمض النووي الريبي ويموت كثير من الأحيان، ثم كمية من الحمض النووي الريبي أو morpholino سوف تحتاج إلى أن تخفض. لحل هذه المشكلات، يعاير كمية من الحمض النووي الريبي حقن أو morpholino وتحديد كمية آمنة لعمليات زرع وجه ناجحة. أخيرا، وزيادة تركيز الملح من الحل MBS أعلاه 0.1X يمكن أن تساعد أيضا الشفاء.
أهمية: تقنية زرع وجه وصفها يسمح تحليل المتطلبات المحلية والنشاط من خلال تطوير منتجات الجين القحفي. هذا النهج يمكن توضيح الاشتراكيةgnaling بين noncrest النامية، قمة العصبية، والهياكل المحيطة بها. فإنه يسمح احد لدراسة LOF أو صندوق القناص (باستخدام أي استراتيجية) في جميع الأنسجة المستمدة من هيئة البيئة، وهو أمر غير ممكن مع أي المروج مدفوعة بناء واحد. على الرغم من أن هناك تاريخ طويل من زرع الأنسجة في البيولوجيا التطورية هذا هو أول تطبيق من زرع لدراسة تطوير القحفي في الضفادع وغير حاسمة للدراسات الميكانيكية 7. وبالتالي فإن تقنية يمكن أن تساعد على كشف الآليات المعقدة السيطرة الزخرفة وتشكيل الوجه الفقاريات وتوضيح أسباب العيوب التنموية القحفي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نشكر راديك Sindelka لمساعدته، وكاس Bresilla لمساعدة مع تربية الضفادع وإعداد الجنين. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة عن طريق R01DE021109 منحة لورا HLS Jacox بتمويل من زمالة الدراسات العليا هيرشيل سميث في جامعة هارفارد، ومنحة الزمالة F30-01 F30DE022989 الفردية من خلال NIDCR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pasteur pipette | VWR | 14672-400 | Lime Glass |
| Size 5 3/4 in | Cotton Plugged | ||
| Graduated Transfer Pipette | VWR | 16001-180 | Disposable |
| #5/45 forceps | Fine Science Tools by Dupont medical | 11251-35 | Angled 45° |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-20 | Straight; serrated tip; stainless steel |
| Capillary Tubing (for needles) | FHC | 30-30-1 | Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID/Fiber |
| Cover slip | VWR | 48393 252 | 24 x 60 mm micro cover glass; |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 | |
| Needle Puller | Sutter Instrument Co | Needle Puller: discontinued Filament: FB300B | The most similar, currently available needle puller is the P-97. For filaments, use Sutter 3.00 mm square box filaments, 3.0 mm wide. |
| Model P-80 | Flaming / Brown micropipette puller | ||
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Stereomicroscope Lighting by Fostec | Fostec | Use a light box with 2 fiberoptic arms. | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | Jaw Opening Diameter: 0-1 mm |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Jaw opening Diameter: 0-1 mm |
| Tungsten Needles | Fine Science Tools | 10130-05 | 0.125 mm Rod diameter |
| Van Aken Plastalina | Blick | #33268-2981 | |
| Modeling Clay- white, red, or yellow | |||
| mMessage mMashine SP6 or T7 Kit | Ambion | AM1340 |
References
- Gorlin, R. J., Cohen, M., Levin, L. Syndromes of the head and neck. , Oxford University Press. UK. (1990).
- Trainor, P. Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention. Am. J. Med. Gen. A. 152, 2984-2994 (2010).
- Dickinson, A. J., Sive, H. L. Development of the primary mouth in Xenopus laevis. Dev. Bio. 295, 700-713 (2006).
- Dickinson, A. J., Sive, H. L. Positioning the extreme anterior in Xenopus: cement gland, primary mouth and anterior pituitary. Sem. Cell Dev. Bio. 18, 525-533 (2007).
- Dickinson, A. J., Sive, H. L. The Wnt antagonists Frzb-1 and Crescent locally regulate basement membrane dissolution in the developing primary mouth. Dev. 136, 1071-1081 (2009).
- Gilbert, S. F. Developmental Biology. , Sinauer Associates, Inc. Sunderland, MA. (2010).
- Borchers, A., Epperlein, H. H., Wedlich, D. An assay system to study migratory behavior of cranial neural crest cells in Xenopus. Dev. Genes Evol. 210, 217-222 (2000).
- Grunz, H. Homoiogenetic neural inducing activity of the presumptive neural plate of Xenopus laevis. Dev. Growth Differ. 32, 583-589 (1990).
- Servetnick, M., Grainger, R. M. Changes in neural and lens competence in Xenopus ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer. Dev. Bio. 112, 177-188 (1991).
- Servetnick, M., Grainger, R. M. Homeogenetic neural induction in Xenopus. Dev. Bio. 147, 73-82 (1991).
- Couly, G., Coltey, P., Le Douarin, N. The triple origin of skull in higher vertebrates: a study in quail-chick chimeras. Dev. 117, 409-429 (1993).
- Couly, G. F., Le Douarin, N. M. Mapping of the early neural primordium in quail-chick chimeras : I. Developmental relationships between placodes, facial ectoderm. 110, 422-439 (1985).
- Couly, G. F., Le Douarin, N. M. Mapping of the early neural primordium in quail-chick chimeras II. The prosencephalic neural plate and neural folds: Implications for the genesis of cephalic human congenital abnormalities. Dev. Bio. 120, 198-214 (1987).
- Lievre, A. L., Le Douarin, N. The early development of cranial sensory ganglia and the potentialities of their component cells studied in quail-chick chimeras. Dev. Bio. 94, 291-310 (1982).
- Kennedy, A., Dickinson, A. Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes. Dev. Bio. 365, 229-240 (2012).
- Trainor, P., Tam, P. Cranial paraxial mesoderm and neural crest of the mouse embryo- codistribution in the craniofacial mesenchyme but distinct segregation in the branchial arches. Dev. 121, 2569-2582 (1995).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
- Tandon, P., Showell, C., Christine, K., Conlon, F. Morpholino injection in Xenopus. Methods Mol. Biol. 843, 29-46 (2012).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , Garland Publishing. New York. (1994).
