Summary
的技术移栽“至尊前域” 非洲爪蟾的面巾纸蟾胚胎已经研制成功。组织可以从一个基因表达的背景被转移到另一个，允许对颅面发展和信令面部区域之间的相互作用当地要求的研究。
Abstract
颅面先天缺陷发生在1每700出来的活产婴儿，但病因却很少，由于颅面部发育的了解有限知。以识别其中的显影脸的图案形成过程中信号转导途径和组织行动，一个“脸移植”技术已发展中的青蛙非洲爪蟾胚胎。推定面巾纸（在“至尊前域”（EAD））的区域从供体胚胎tailbud阶段取出，并移植到同一个舞台主机胚胎，从中相当于区域已被删除。这可以用于产生嵌合面的主机或供体组织具有在基因中的损耗或增益函数，和/或包括一个谱系标签。愈合后，发展的结果进行监测，并表示捐赠者或周围的宿主组织内的信号转导通路的作用。 非洲爪蟾是面对发展的宝贵的典范，作为面部区域很大，随手一ccessible的显微操作。许多胚胎可以检测，在很短的时间内开发以来迅速发生。青蛙发现是有关人的发展，因为颅面过程出现爪蟾和哺乳动物之间的保守性。
Introduction
要了解颅面发育过程中相关颅面先天缺陷1-2，重要组织和他们的贡献的信令机制必须进行标识。在青蛙非洲爪蟾中，面部的一部分，包括口腔和鼻孔形式从“极端前域”（EAD），其中外胚层和内胚层直接并置3-4。在EAD也作为一个信令中心来影响周围的组织，包括颅神经嵴，形成钳口和其他面部区域5。识别基因，有助于EAD功能，一个“脸移植”技术被开发，其中组织从供体移植到宿主胚胎，除去对应主机区域之后。继移植，导致面部发育评估。因此，功能丧失（LOF）或功能（GOF）中的EAD特定基因增益的效果的局部分析，其中的h时休息EAD和身体是由野生型的组织。的倒数可移植的执行，其中野生型组织被移植到与全局LOF或GOF中的胚胎特异性基因。移植已被经常使用在非洲爪蟾和小鸡研究6。例如， 非洲爪蟾移植已经解决了纯合神经诱导，镜头和神经的能力，和神经嵴迁移7-10。鹌鹑鸡嵌合体移植术分析了前神经板，前神经嵴，神经嵴和颅骨11-14的发展。这是在非洲爪蟾颅面部发育的研究第一次移植技术，该技术已经证明了的Wnt抑制剂Frzb1和红新月会在推定口5调节基底膜形成了一种新的作用。 非洲爪蟾是颅面部发育的研究的理想模型因为胚胎是大的，发展对外，一个ND面对的是随时可见，让显微和发展成像。机制相关的面部发育出现保守，表明在青蛙作出裁断洞察人类发展4,15-16。
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Protocol
1。试剂的准备
- 10X MBS：准备1升10倍的改进巴特的盐水（MBS）的解决方案17。参照表1，试剂，成分，和指令。用蒸馏水所有的解决方案。混在烧杯中，用搅拌棒，直到充分溶解。所有溶液应在室温下进行。
- 1X MBS：稀释于900ml蒸馏水百毫升10倍的MBS解决方案，使1升1X的MBS。加0.7毫升的1M的CaCl 2溶液。
- 0.1倍MBS：稀释1X MBS准备1升的0.5倍的MBS解决方案和2升0.1倍的MBS解决方案。以1升的0.1倍的MBS解决方案，加入1毫升10毫克/毫升庆大霉素溶液。与庆大霉素的0.1倍的MBS解决方案将用于长期的胚胎培养。
- 聚蔗糖/ MBS：添加15克聚蔗糖400至500ml 0.5倍的MBS解决方案。充分混合。添加搅拌棒和搅拌，直到聚蔗糖完全溶解（几个小时）。
- 70％乙醇：用稀释的100％乙醇70％乙醇蒸馏水。
2。玻璃的准备工作工具
- 针制剂：加载毛细管进针车夫。
- 拉将根据表2所示的设置的织针：针拔出器的设置。该设置是一个萨特仪器有限公司型号P-80/PC微量拉马和毛细管管材，作为特定的试剂和设备的表中描述。但是，这些设置是特定于萨特针车夫，并需要进行调整，其他机器。设置可以使用一个斜坡测试来确定，具体由机床制造商。
- 在筹备过程拉4-6针。针应该被打破，使得玻璃尖端的柔性，毛发状部被完全除去，这通常是2-3毫米长。尖端必须是相对刚性的，但仍然足够窄以被用作切割工具。见照片图1A理想的针。 存储针在培养皿用粘土下来的中心带。按每一针的轴成泥，拿着它在的地方，以保持脆弱的锐利尖端离底部和两侧。
- 对于额外的工具，获得玻璃盖玻片，一对长标准模式镊子，本生灯，和3-4的玻璃巴斯德吸液管（大小5¾英寸）。
- 吸管工具：为了使吸移管工具，点燃本生灯和玻璃巴斯德吸管的尖端放置到火焰的蓝色部分 ，同时旋转它，使得该尖端熔化和孔完全密封，形成一个封闭的圆形端。圆形，密封尖稍后用于使凹陷的粘土菜，在操作过程中保持胚胎。 见图1B。
- 玻璃桥：为了使玻璃桥，用一个较长的标准模式由镊子盖玻片玻璃3毫米大块仔细折断3毫米。按住一块盖玻片用吨weezers，将玻璃中的火焰，直到所有四个边缘软化和曲线向下，形成一个微小的玻璃圆顶。边缘应该不再是尖锐的。参见图1C。
- 通过将它们存储在玻璃盖片的桥梁，边缘向下放入橡皮泥，衬培养皿的底部。插入的桥梁，使得桥的顶部保持在粘土表面的上方。不要用力过猛，使得桥梁断裂，并不能完全嵌入桥进入粘土，因为它可以是很难去除。灭菌用火焰或70％乙醇后，将桥可以从实验中重复使用试验。
3。准备胚胎操作
- A线小60毫米塑料培养皿橡皮泥。使用之间，盘子和粘土表面用蒸馏水彻底洗涤，然后用70％的乙醇。
注：使用红色，白色或黄色，凡阿肯Plastalina橡皮泥，可以在当地被买走y或艺术品商店。黑粘土不建议，因为它释放残余物。 - 用3％聚蔗糖0.5倍的MBS解决方案，填补了菜。较高浓度的盐可以防止组织离解，并且该多糖的Ficoll有助于增稠溶液，这有助于保持面中的位置。
- 用火烧巴斯德吸管工具（ 见图1），以使浅2-3毫米的凹陷中的粘土，约20阶段胚胎体的深度。做20-30洼地，1-2 mm处，上的菜的每一面，所以总共有40-60洼地是。标签一侧LOF / GOF，和另一侧的野生型，通过雕刻字母与镊子的粘土。
4。术前准备胚胎
- 获得文化非洲爪蟾使用标准方法17胚胎。青蛙养殖的详细说明，请参见西伯等 17
- 四十八小时在实验前要想获取从雌蛙卵和体外受精执行。
- 注入0.5-1纳克的封膜的GFP表达，以及任何所需的基因或反义吗啉代修饰的反义寡核苷酸（“吗啉”）在一个细胞阶段或成2细胞在2细胞期。一个细胞阶段持续约70-90分钟。注入的1-3 NL的总体积。在这里的RNA编码荧光蛋白（如GFP或RFP的RNA）的，可以注入FITC标记的吗啉代或荧光标记的葡聚糖。荧光是用于确定是否移植的组织愈合，并保持在头部重要。
- 封顶的mRNA可以从使用mMessage mMachine SP6或T7试剂盒的线性质粒准备。吗啉代可以被设计，并通过基因Tools公司订购。所需的所希望的效果吗啉的用量必须为每一个基因18来确定。
- 存储注射的胚胎在15℃下进行48小时，直到它们达到19-20级。 （F或所有后续步骤，根据非洲爪蟾由Nieuwkoop和法贝尔19的普通表阶段的胚胎。）
注意：在手术当天，受援国和捐助国的胚胎必须在对方的一个阶段的移植以最佳状态工作。然而，胚胎注射吗啉（“morphants”）有时发展比野生型更慢或控制morphant胚胎，进行必要的协调实验，把它所以无论morphant和野生型胚胎是在同一个舞台。 Morphants可能需要被维持在较高的温度下12-24小时前的程序。以增加的胚胎可以在匹配阶段发现的可能性，胚胎可以保持在不同温度。实验前二十四小时，应该划分胚胎成几盘，放morphants在18-20℃和野生型的胚胎在15-18°C。
- 在移植实验中，REM的一天从the15℃培养箱奥雅纳胚胎，并根据Nieuwkoop和法贝尔19阶段他们。如果他们是年龄小于神经胚后期（19级），让它们在室温下放置1-2小时，直到他们达到阶段19。
- 屏幕的荧光显微镜下注射的胚胎。选择显示均匀，明亮荧光的实验胚胎。
- 除去杂波和可能的污染物的经营面积近。擦拭下来的操作表面，体视显微镜和所有的工具，用70％的乙醇。
- 一旦胚胎正处于阶段19，删除使用＃45分之5杜蒙钳在立体显微镜下卵黄膜。
- 除去各捐助者和东道国胚胎20-30卵黄膜。
- 这是第几个脸移植实验，应该练了几个胚胎每个条件。该方法是有挑战性的，需要小心实践它可用于较大规模之前，快速和成功。一个可以工作üp到20做移植/实验。
- 移动主机的胚胎成使用塑料的操作盘刻度移液管的尖端切断，使得开口比胚胎（至少几个毫米）宽得多。要小心，避免触及胚胎气泡或水面，因为胚胎会在表面张力的爆炸。
- 使用＃四十五分之五钳子插入胚胎成粘土凹陷，与胚胎中的粘土后部。轻轻关闭周围使用镊子胚胎的基础粘土，留下胚胎的前25％，头部，从抑郁症突出。
- 一旦所有的主机胚胎固定在其洼地，移动到板的另一侧，并开始将供体胚胎到他们的洼地。重复固定在其孔中的胚胎的过程。
5。进行面部移植手术
- 割刀：作为切割刀去除捐助EAD组织，使用适当碎玻璃毛细管针（见步骤2.3和图1）。
注意：一个可以直接持有的手指之间的毛细管（这适用于用小手的人），或者可以安装在针昆虫针固定器。加载到针保持器Electrosharpened钨针17可以被用来代替毛细管针。请参阅特定的试剂和设备的表中提出销户，钨针。 - 在立体显微镜下，将针入胚胎的头部到水泥腺的左侧。针应深深插入时，使得它从胚胎外的推移，通过磁头，并进入前肠。移植整个EAD，削减应该从胚胎外延伸到前肠。对于外胚层只移植，削减应该是浅和扩展只能通过外胚层。
- 从左侧轻弹针向右侧的头，穿过水泥腺的整个宽度。轻弹是重要的，因为运动给人以干净的切割。参阅图2A的技术和图2B所示的切口的一个示范的概要。水泥腺体和眼睛都为削减重要的地标。切口的顺序不会影响结果，并且可以根据用户的偏好或螺旋性而有所不同。
- 将针在上切割的起点，在水泥腺的左边框，并且向上轻弹针，直到它到达左眼的底部。这会创建一个从水泥腺的左侧边界的垂直切到左眼的底部。
- 将针在水泥腺的右边界，并且向上轻弹针，直到它到达右眼的底部。这会创建一个从水泥腺的右边界的垂直切到右眼的底部。
- 为了充分切除组织，弗力ķ从左眼到右眼的底部的底部针，创建一个横向切，将释放组织。切口可从胚胎的外侧延伸到前肠，包括外胚层和内胚层中的EAD植体。另外，浅切，可用于外胚层只EAD移植。一旦EAD组织被去除，应该有一个矩形孔从胚胎的外进入前肠，从水泥腺拉伸到刚好在眼睛（从上到下）所示。这个洞应该从左眼内侧边界延伸到右眼（边到边）的内部边框。参见图2BB。
- 轻推针的尖切除的组织，并通过缓冲抬起它包含主机胚胎的菜的一部分。请勿将组织暴露在表面的空气，否则将被损坏。
- 由宿主胚切除相同的组织，作为供体。丢弃主机EAD外植体或将其保存到插入背板t代入供体的脸，因为相互移植。
- 将供体植进用＃45分之5钳造成主机孔。
- 一旦供体组织的位置正确，并完全插入，小心地将玻璃桥（ 见图1和图2BC）对胚胎的脸持有的移植到位。桥的两端应插入到粘土，拿着它到位。这座桥应该轻轻地施加压力，移植的组织，使得移植在于主机头平齐，没有它伸出的头部或深的头内躺着。头部可以通过盖玻片被稍扁平，但要小心，不要损坏胚胎有太大的压力。移植应在5分钟内完成。
注：一个有经验的调查员可以为每个实验进行约二十移植，过2-3小时。在此期间，将胚胎从阶段20-22进步。完成了面部移植手术在21级或22 s不影响结果。后移植（在阶段22-26）可以做到，但更难以作为波峰 - 自由EAD中线区域变窄为颅神经嵴移动到脸上。整个移植的一致性是至关重要的。
6。脸部移植手术后恢复
- 治疗通常需要2-3个小时。离开胚胎在室温下不受干扰地在他们的粘土洼地与玻璃桥控股供体组织到位。
- 一旦移植治好了，小心取出玻璃桥，从各地使用镊子胚胎的底部去掉泥土，并用塑料刻度移液管轻轻真空胚胎他们的洼地。
- 把胚胎成适当标记的培养皿中，一半充满了干净的0.1倍MBS与庆大霉素。
- 成长的胚胎在15℃或18℃下了好几天，直到他们达到在40期喂养蝌蚪阶段，W母鸡面部表型可以得分。
- 与庆大霉素的0.1倍的MBS溶液应每天更换，任何死胚应及时清除，以防止污染其他胚胎的死亡。
- 口开在阶段40。在40-41阶段，必须检查移植的组织仍然未愈的地方通过查看它的荧光。移植偶尔掉下来，所以必须确保所有打进胚胎有供体组织到位。
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Representative Results
移植组织应完全插入主机头移植后， 如图3A所示，并有一个玻璃桥适当地放置在胎儿的脸， 如图2BC。移植的供体组织必须正确尺寸为主机开放，为移植成功。在EAD组织不应从头部伸出，以任何方式，如在图3B和3C所示。此外，表面移植不应转动相对于其在供体身体的位置， 如图3D。几个小时后，将移植的组织与周围面应该愈合，并且在第二天，胚胎应显示为如图4A和4A的例子“。人们可以观察到，根据荧光，该移植保持在原位， 如图4B所示 。在阶段41中，被移植的对照组织将CONTRibute嘴巴，并将继续荧光绿色，见于图4B“。野生型EAD组织移植到野生型主机应该会引起正常的面孔，用时泰然自若野生型的胚胎进行比较。然而，LOF或GOF供体组织，面临着要医治并保持在头部，但这些可能会或可能不会正常颅面结构产生，如图迪金森和西伯5 图3。
| 试剂 | 成分 | 说明 |
| 1米氯化钙溶液 | 111克的CaCl 2，每升 | 高压灭菌器和存储1毫升分装在-20℃或4℃。 |
| 10X修改巴特的盐水（MBS）解决方案 | 880 mM氯化钠，51.4克 | 调整音量至1L蒸馏水。调节最终pH至7.8，用NaOH和然后高压灭菌。 |
| 10毫米氯化钾，745.5毫克 | ||
| 的10mM MgSO 4干燥，1.2克 | ||
| 50毫米的HEPES（pH值7.8），11.9克 | ||
| 25毫米碳酸氢钠3，2.1克 | ||
| 1X MBS解决方案 | 最终浓度： | 通过将100毫升10×MBS盐溶液用0.7ml的1M的CaCl 2溶液制备1X的MBS溶液。调整音量至1L蒸馏水。稀释该解决方案使MBS 0.5倍0.1倍和MBS。 |
| 88 mM氯化钠 | ||
| 1毫米氯化钾 | ||
| 0.7毫米氯化钙2 | ||
| 1毫米硫酸镁4 | ||
| 5毫米HEPES（pH值7.8） | ||
| 2.5毫米碳酸氢钠3 |
表1中。试剂，原料，和说明。
| 热 | 拉 | 德维尔。 | 时间 |
| 800 | 70 | 40 | 50 |
表2。针拔轮器设置*。
*针拔出器的设置而有所不同从机器到机器所以每个实验室将可能需要优化自己的针拉马设置。
图1：所使用的工具。a）显示一个完整的，完整的针和断针灵活的尖端已被删除后，B）描述了两个吸管工具，其目的完全密封，并四舍五入。c）给出三个示例的玻璃桥。比例尺= 1,000毫米。
。的面部移植手术方法图2总结一）一般移植计划：。面部移植手术方法的示意图一个胚胎在1细胞期注射了荧光剂和反义寡核苷酸吗啉。荧光剂可以是绿色荧光蛋白基因，FITC标记的吗啉代，或荧光葡聚糖。 湾口推定在台22从主机野生型胚胎和捐赠者morphant胚胎被删除。移植的组织也可被放大到包括根据推定的鼻子，它位于正上方的嘴部区域。施主morphant组织被移植到野生型宿主，然后固定在适当位置，用玻璃桥。灰色拱：孵化腺。
图3。示意图胚胎移植后不久。显示正面的看法。移植组织是在红点所述。A和A'描绘一个理想的结果，在阶段22。组织被完全插入并正确地定位在头部。B和B'显示一个不正确的移植，以部分地插入头。C和C的组织'显示一个不正确的移植与大多数插入头部的组织，但过剩区域是从愈合站点突出。该组织将necrose，并抑制周围，正确插入区域的愈合。D和D'显示不正确的移植，那里的脸上已经在主机旋转，相对于它在供体位置。经t问题会愈合成头，但脸上会不会正常发育。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4。旧的胚胎与理想的结果。显示正面的看法。 CG：水泥腺体;莫：。口A）会显示一天移植后的胚胎，在展示阶段32 A'一个正常愈合，移植）显示此相同的胚胎用荧光叠加，确认移植组织仍然在B地。 ）显示了相同的胚胎阶段42其中有一个控制啉，GFP +移植前几天。面对已经发展正常。B'）显示了相同的胚胎用荧光叠加，确认移植组织仍然在头上，并通常以面部结构做出了贡献。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
关键步骤和限制：EAD换脸程序的时间和密集的工作。它需要实践，稳定的双手，灵巧和完善。换脸协议依赖于研究人员的能力，有效地去除和移植组织。如果时间过长插入移植到宿主的脸，主机脸会开始收缩和愈合。镊子可以用来微妙地扩大面部区域。然而，如果已经发生显著伤口收缩，移植不会愈合，以及与可能需要减小尺寸，以适应宿主的面部孔。移植的尺寸和形状必须大致相匹配的收件人的面部空腔的尺寸和形状，以允许插入成功。
阶段19-22之间进行时，与由匹配阶段的胚胎面部移植是最成功的。较旧的面部移植，阶段22-26之间，是可能的，但更具挑战性的d可以扰乱神经嵴迁移进入面的侧面，因为波峰的无中线区域从阶段22-26变成显著窄。
无论是受援国和捐助国必须在类似阶段的移植以最佳状态工作。理想情况下，它们应该是相同的阶段，和最低限度必须在几个小时内对方。胚胎注射了反义RNA的吗啉代寡核苷酸（“morphants”）有时发展比野生型更慢或控制morphant胚胎，要求morphants在较高的温度下生长，以匹配的野生型胚胎“阶段。
捐赠人脸组织不应该在宿主体内相对于供体胚胎原始位置的旋转，否则脸会不会正常发育。水泥腺不需要被包括在脸部移植的程序工作;面部正常发展没有它。然而，水泥腺通常包括在吨他摘除面巾纸，因为它作为一个独特的标记，以指示和定位移植的底部。此标记将有助于避免面部组织至收件人在传输过程中不小心旋转组织。如果移植已正确插入主机的脸，供体组织，可以取出并丢弃。一个可以尝试插入一个新的移植到相同的主机，如果开口还没有开始收缩。但是，如果主机开业以来明显萎缩，则丢弃该主机和重新开始。
关键是要直接放在玻璃桥对移植脸部，从而使移植的愈合过程中主机的头举行。如果移植不到位举行的移植可以从主机的脸上挤出。移植未完全插入面部或愈合过程中蹦出来将发生坏死。即使在完美的移植，可能周围的边缘Ø出现少量的组织死亡F中的移植。通常这并不会造成不良影响，仍然可以形成一个完全正常的脸。在成功地控制我们4周发展表明软骨正常形成，且拒绝组织是罕见后没有观察到任何畸形。
最后，如果一个吗啉扰乱所需的正常伤口愈合的蛋白质，这种技术可能无法正常工作，因为移植的LOF组织可能不会被纳入主机头。
可能的修改和故障排除：修改可到的程序。通过实践，研究者可以学习到移植较小的区域，例如，一半的EAD。浅切口允许外胚层移植，留下更深的内胚层原状。胚胎组织的其他地区可以移植，采用类似的方法。
如果移植组织植入后死亡，有一对夫妇的possible原因。移植组织未完全插入主机或到位的玻璃桥适当地举行，会死，妨碍适当的愈合。一定要完全插入移植组织并用玻璃桥将其固定到位。如果移植是从吗啉或RNA注入供体来源，那么组织可能从注射剂死于中毒。类似地，如果在主机胚胎morphants或RNA注入和频繁死亡，然后吗啉代或RNA的量将需要被减小。要解决这些问题，滴定注入RNA或吗啉的用量，并确定成功的面部移植一个安全量。最后，增加0.1倍以上的MBS溶液中盐的浓度也可以帮助愈合。
意义：描述的换脸技术允许的颅面发育过程中局部要求和基因产物的活性分析。这种方法可以澄清SI发展noncrest，神经嵴，与周围结构之间gnaling。它允许一个检查LOF或GOF（使用任何策略），在所有的EAD衍生的组织，这是不可能的，任何单一的启动子驱动的构建体。虽然没有组织移植的历史悠久，在发育生物学，这是移植的第一个应用程序颅面发展的青蛙的研究，是机理研究7关键。因此，该技术可以帮助解开这个复杂的机制控制脊椎动物脸图案和形成和澄清颅面发育缺陷的原因。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
我们感谢拉狄克Sindelka他的帮助，或Cas Bresilla协助与青蛙养殖和胚胎的准备。这项工作是通过grant R01DE021109到HLS劳拉Jacox经费由美国国立卫生研究院资助的赫歇尔史密斯研究生奖学金在哈佛大学和F30DE022989-01通过NIDCR的F30个人奖学金补助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pasteur pipette | VWR | 14672-400 | Lime Glass |
| Size 5 3/4 in | Cotton Plugged | ||
| Graduated Transfer Pipette | VWR | 16001-180 | Disposable |
| #5/45 forceps | Fine Science Tools by Dupont medical | 11251-35 | Angled 45° |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-20 | Straight; serrated tip; stainless steel |
| Capillary Tubing (for needles) | FHC | 30-30-1 | Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID/Fiber |
| Cover slip | VWR | 48393 252 | 24 x 60 mm micro cover glass; |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 | |
| Needle Puller | Sutter Instrument Co | Needle Puller: discontinued Filament: FB300B | The most similar, currently available needle puller is the P-97. For filaments, use Sutter 3.00 mm square box filaments, 3.0 mm wide. |
| Model P-80 | Flaming / Brown micropipette puller | ||
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Stereomicroscope Lighting by Fostec | Fostec | Use a light box with 2 fiberoptic arms. | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | Jaw Opening Diameter: 0-1 mm |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Jaw opening Diameter: 0-1 mm |
| Tungsten Needles | Fine Science Tools | 10130-05 | 0.125 mm Rod diameter |
| Van Aken Plastalina | Blick | #33268-2981 | |
| Modeling Clay- white, red, or yellow | |||
| mMessage mMashine SP6 or T7 Kit | Ambion | AM1340 |
References
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