Summary
Een techniek voor het transplanteren "Extreme Voorste Domain" tissues tussen Xenopus laevis embryo ontwikkeld. Weefsel kan worden verplaatst van de ene genexpressie achtergrond in de andere, waardoor de studie van de lokale vereisten voor craniofaciale ontwikkeling en voor het signaleren van interacties tussen het gezicht regio.
Abstract
Craniofaciale aangeboren afwijkingen voorkomen bij 1 op de 700 levendgeborenen, maar etiologie is zelden bekend vanwege de beperkte kennis van craniofaciale ontwikkeling. Om te bepalen waar signaalwegen en weefsels handelen tijdens patroonvorming van de zich ontwikkelende gezicht, heeft een 'gezicht transplantatie-techniek is ontwikkeld in embryo's van de kikker Xenopus laevis. Een gebied van vermoedelijke tissues (de "Extreme Anterior Domain" (EAD)) wordt verwijderd uit een donor embryo in tailbud stadium en getransplanteerd naar een gastheer embryo van dezelfde fase, waarvan de equivalente gebied is verwijderd. Dit kan worden gebruikt om een chimeer gezicht waarbij de gastheer of donor weefsel heeft een verlies of winst van functie in een gen en / of omvat een geslacht label genereren. Na genezing is het resultaat van ontwikkeling gevolgd, en geeft aan rollen van de signalerende weg binnen de donor of de omliggende weefsels van de gastheer. Xenopus is een waardevol model voor gezicht ontwikkeling, zoals het gezicht regio is groot en gemakkelijk eenccessible voor micromanipulatie. Veel embryo's kunnen worden getest, gedurende een korte periode sinds de ontwikkeling snel optreedt. Bevindingen in de kikker zijn aan de menselijke ontwikkeling relevant, aangezien craniofaciale processen lijken geconserveerd tussen Xenopus en zoogdieren.
Introduction
Naar onderliggende mechanismen van craniofaciale aangeboren afwijkingen 1-2, belangrijke weefsels en hun signalering bijdragen tijdens craniofaciale ontwikkeling te begrijpen moeten worden geïdentificeerd. In de kikker Xenopus laevis, een deel van het gezicht, zoals de mond en neus vorm van de "Extreme Anterior Domain" (EAD), waarbij ectoderm en endoderm direct naast elkaar 3-4. De EAD fungeert ook als een signalering centrum omliggende weefsels, waaronder de craniale neurale lijst, die de kaken en andere gezichtgebied 5 vormt beïnvloeden. Om genen die bijdragen aan EAD functie te identificeren, werd een 'gezicht transplantatie-techniek ontwikkeld, waarbij weefsel wordt getransplanteerd van een donor in een gastheer embryo, na het verwijderen van de bijbehorende host-regio. Na de transplantatie, resulterende gezicht ontwikkeling wordt beoordeeld. Aldus worden de effecten van functieverlies (LOF) of overexpressie-(GOF) voor een specifiek gen in de EAD lokaal geanalyseerd waar de rest van de hEAD en lichaam is samengesteld uit wild-type weefsel. De wederzijdse transplantatie kan worden uitgevoerd, waarbij wild-type weefsel wordt getransplanteerd in embryo's met wereldwijde LOF of GOF in specifieke genen. Transplantatie is vaak gebruikt in Xenopus en chick bestudeert 6. Zo heeft Xenopus transplantatie gericht homogenetic neurale inductie, lens en neurale competentie, en de neurale lijst migratie 7-10. Kwartel-chick chimere enten heeft de ontwikkeling van de voorste neurale plaat, voorste neurale kam, neurale en schedelbeenderen 11-14 geanalyseerd. Dit is de eerste transplantatie techniek voor onderzoek van craniofaciale ontwikkeling in Xenopus. Deze techniek heeft een nieuwe rol voor de Wnt-remmers Frzb1 en Crescent in het reguleren van de basale membraan vorming in de vermoedelijke mond 5 aangetoond. Xenopus laevis is een ideaal model voor de studie van craniofaciale ontwikkeling als embryo's zijn groot, ontwikkelen extern, eennd het gezicht is goed zichtbaar, waardoor micromanipulatie en beeldvorming van ontwikkeling. Onderliggende mechanismen gezichtsontwikkeling verschijnen geconserveerd, wat aangeeft dat de bevindingen in de kikker geven inzicht in de menselijke ontwikkeling 4,15-16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiden van reagentia
- 10x MBS: Bereid 1 liter 10x gewijzigd Barth's Saline (MBS)-oplossing 17. Zie Tabel 1, reagentia, ingrediënten, en instructies. Gebruik gedestilleerd water voor alle oplossingen. Meng in een beker, met behulp van een roerstaafje, tot volledige ontbinding. Alle oplossingen moet worden bij kamertemperatuur.
- 1x MBS: Verdun 100 ml 10x MBS opgelost in 900 ml gedestilleerd water tot 1 liter 1x MBS maken. Voeg 0,7 ml 1 M CaCl2-oplossing.
- 0,1 x MBS: Verdun 1x MBS 1 L van 0,5 x MBS-oplossing en 2 L van 0,1 x MBS te bereiden. Tot 1 L van 0,1 x MBS oplossing, voeg 1 ml van 10 mg / ml gentamycine oplossing. De 0,1 x MBS oplossing met gentamycine zal gebruikt worden voor de lange termijn embryo cultuur.
- Ficoll / MBS Voeg 15 g Ficoll 400 tot 500 ml 0,5 x MBS oplossing. Meng krachtig. Voeg een roerstaafje en meng tot Ficoll volledig is opgelost (enkele uren).
- 70% ethanol: Verdun 100% ethanol 70% ethanol metgedestilleerd water.
2. Voorbereiden van Glass Operating Gereedschap
- Naald voorbereiding: Load capillaire slang in een naald trekker.
- Trek de naalden volgens de in tabel 2 instellingen: Naald trekker instellingen. De instellingen voor Sutter Instrument Co Model P-80/PC micropipet trekker en capillaire buizen, zoals beschreven in de tabel specifieke reagentia en apparatuur. Echter, deze instellingen zijn specifiek voor de Sutter naald trekker, en zal moeten worden aangepast voor andere machines. Instellingen kunnen worden bepaald met behulp van een hellingbaan test, zoals gespecificeerd door de fabrikant van de machine.
- Trek 4-6 naalden ter voorbereiding van de procedure. De naald moet zo worden gebroken dat de flexibele, haar-achtige gedeelte van het glas topen volledig is verwijderd, die typisch 2-3 mm lang. De punt moet relatief stijf, maar smal genoeg om als een snij-instrument. Zie foto van een ideaal naald in figuur 1A. Bewaar de naalden in een petrischaal met een strook van klei in het midden. Druk op de as van elke naald in de klei, om het op zijn plaats houden en de fragiele scherpe punt uit de buurt van de bodem en de zijkanten te houden.
- Voor extra gereedschap, verkrijgen glas dekglaasjes, een paar lange standaard patroon tang, een bunsenbrander, en 3-4 glazen pasteurpipetten (Grootte 5 ¾ in).
- Pipet tool: Om een pipet tool, licht de bunsenbrander en plaats de punt van een glas Pasteur pipet in het blauwe deel van de vlam tijdens het draaien, zodat de tip smelt en het gat volledig zeehonden, die een gesloten, afgerond eind . De afgeronde, verzegelde tip wordt later gebruikt om depressies te maken in de klei gerecht dat de embryo's heeft tijdens de operatie. Zie Figuur 1B.
- Glas bruggen: Om glas bruggen maken, gebruiken lange standaard patroon tang om zorgvuldig af te breken 3 mm bij 3 mm brokken van dekglas glas. Terwijl u het stuk van dekglas met tweezers, plaats het glas in de vlam totdat alle vier de randen verzachten en curve naar beneden, de vorming van een kleine glazen koepel. De randen moeten niet langer scherp. Zie figuur 1C.
- Bewaar de glazen afdekplaat slip bruggen door ze, randen naar beneden in boetseerklei, langs de bodem van een petrischaal. Plaats de bruggen zodat de bovenzijde van de brug blijft boven het oppervlak klei. Niet te hard duwen zodanig dat de brug breekt, en niet volledig insluiten de brug in de klei, omdat het moeilijk te verwijderen zijn. Na sterilisatie met een vlam of 70% ethanol, kan de bruggen worden hergebruikt van experiment om te experimenteren.
3. Voorbereiding op de Embryo Operation
- Lijn een kleine 60 mm plastic petrischaal met boetseerklei. Tussen toepassingen wordt de schotel en klei oppervlak grondig gewassen met gedestilleerd water en daarna met 70% ethanol.
OPMERKING: Gebruik rood, wit of geel, Van Aken Plastalina boetseerklei, die kunnen worden gekocht bij een lokale naary of Art Store. Zwarte klei wordt niet aanbevolen omdat het een residu releases. - Vul de schaal met 3% Ficoll 0.5x MBS oplossing. De hogere zoutconcentratie voorkomt weefsel dissociatie en het polysaccharide Ficoll helpt de oplossing, die helpt bij het houden van het gezicht in stand dikker.
- Gebruik de gevlamde pasteurpipet gereedschap (zie figuur 1) te ondiep, 2-3 mm depressies te maken in de klei, over de diepte van een stadium 20 embryo lichaam. Voeg 20-30 depressies, 1-2 mm uit elkaar, aan weerszijden van de schotel, zodat er in totaal 40-60 depressies. Label ene kant LOF / GOF, en de andere kant wild type, door snijden initialen in de klei met een tang.
4. Preoperation Embryo Voorbereiding
- Verkrijgen en cultuur Xenopus laevis embryo's met behulp van standaard methoden 17. Voor een gedetailleerde beschrijving van de kikker veeteelt, zie Sive et al.. 17
- Achtenveertig uur voor het experiment obtain eieren van vrouwelijke kikkers en uit te voeren in vitro fertilisatie.
- Injecteer 0,5-1 ng bedekte membraan GFP mRNA plus gewenste mRNA of anti-sense-morfolino gemodificeerde antisense oligonucleotiden ("morfolino") en de fase van een cel of in 2 cellen bij het stadium van 2 cellen. De ene cel fase duurt ongeveer 70-90 minuten. Injecteer een totaal volume van 1-3 nl. In plaats van RNA dat codeert voor een fluorescent eiwit (zoals GFP of RFP RNA) kan men FITC gemerkte morfolino of fluorescent gelabelde dextran injecteren. De fluorescentie is belangrijk te bepalen of de getransplanteerde weefsel geneest en blijft de weg.
- Capped mRNA kan worden bereid uit een gelineariseerde plasmide met een mMessage mMachine SP6 of T7 kit. Morpholinos kunnen worden ontworpen en besteld via Gene Gereedschap LLC. De hoeveelheid morfolino die voor een gewenst effect moet worden vastgesteld voor elk gen 18.
- Bewaar de geïnjecteerde embryo's bij 15 ° C gedurende 48 uur, totdat fase 19-20 bereiken. (Fof alle volgende stappen embryo's volgens de normale tabel van Xenopus laevis bij Nieuwkoop en Faber 19.)
OPMERKING: Op de dag van de operatie, moeten zowel ontvanger als donor embryo's zich binnen een fase van elkaar voor de transplantaties om optimaal te werken. Echter, embryo geïnjecteerd met morpholinos ("morphants") soms langzamer dan wild-type te ontwikkelen of te beheersen morphant embryo, waardoor het noodzakelijk is om experimenten te coördineren, zodat zowel morphant en wild-type embryo's zijn in hetzelfde stadium. Morphants moet bij een hogere temperatuur gedurende 12-24 uur voorafgaand aan de procedure te handhaven. Om de kans dat de embryo's kan worden gevonden op bijpassende fasen te verhogen, kunnen embryo's worden gehandhaafd op verschillende temperaturen. Vierentwintig uur voorafgaand aan het experiment, moet men de embryo verdelen in verschillende gerechten en morphants plaats bij 18-20 ° C en wildtype embryo bij 15-18 ° C.
- Op de dag van de transplantatie-experiment, remove de embryo's uit 15N ° C incubator en staged ze volgens Nieuwkoop en Faber 19. Als ze jonger zijn dan laat neurula (stadium 19), laat ze bij kamertemperatuur gedurende 1-2 uur, totdat ze het podium 19 bereiken.
- Zeef de geïnjecteerde embryo onder een fluorescentiemicroscoop. Selecteer embryo's die uniforme, heldere fluorescentie voor het experiment laten zien.
- Verwijder rommel en mogelijke verontreinigingen in de buurt van het werkgebied. Veeg de operationele oppervlakte, stereomicroscoop en alle gereedschappen met 70% ethanol.
- Zodra de embryo's zijn in de eerste fase 19, verwijder de vitelline membraan met behulp van # 5/45 Dumont tang onder een stereomicroscoop.
- Verwijder de vitelline membraan van 20-30 voor elke van donor en gastheer embryo.
- Voor de eerste paar gezichtstransplantatie experimenten, moet men oefenen met een paar embryo's voor elke conditie. De werkwijze is moeilijk en vereist een zorgvuldige oefenen voordat het kan worden gebruikt op een grotere schaal, snel en succesvol. Men kan uwerkp tot het doen van 20 transplantaties / experiment.
- Verplaats gastheer embryo's in de operationele schaal met een kunststof gegradueerde overdracht pipet met de punt afgesneden zodat de opening is veel breder dan een embryo (tenminste enkele millimeters). Wees voorzichtig om te voorkomen dat het aanraken van embryo's om luchtbellen of het wateroppervlak, als embryo zal ontploffen in de oppervlaktespanning.
- Gebruik # 5/45 tang om het embryo te voegen in de klei depressies, met de achterkant van het embryo in de klei. Sluit het klei rond de basis van de embryo met de tang, waarbij de bovenste kwart van het embryo, de kop, uitstekend uit de depressie.
- Zodra alle ontvangende embryo zijn vastgezet in hun depressies, naar de andere zijde van de plaat en wordt dan de donor embryo voegen in hun depressies. Herhaal het proces ter waarborging van de embryo's in de putjes.
5. Het uitvoeren van het Gezicht Transplant Surgery
- Snijmes: Als een mes voor het verwijderenvan donor EAD weefsel, gebruik een geschikt gebroken glazen capillaire naald (zie stap 2.3 en figuur 1).
OPMERKING: Men kan rechtstreeks houd de capillaire tussen de vingers (dit werkt goed voor mensen met kleine handen) of men kan de naald monteren in een insect penhouder. Electrosharpened wolfraam naalden 17 in een penhouder geladen kan worden gebruikt in plaats van een capillair naald. Zie stelde pinhouders en wolfraam naalden in de Tabel van specifieke reagentia en apparatuur. - Onder een stereomicroscoop, steek de naald in het hoofd van het embryo aan de linkerkant van het cement klier. De naald moet diep worden ingebracht, zodat het passeren van buiten het embryo door het hoofd en in de voordarm. Om het volledige EAD transplantatie dient sneden zich vanaf de buitenkant van de embryo de voordarm. Alleen voor-ectoderm transplantaties, moet bezuinigingen ondieper zijn en zich slechts door het ectoderm.
- Flick de naald van de linker naar de rechterkant van dehoofd, over de gehele breedte van het cement klier. Het tikken is belangrijk als de beweging geeft een zuivere snede. Raadpleeg Figuur 2A voor een overzicht van de techniek en figuur 2B voor een demonstratie van de bezuinigingen. Het cement klier en de ogen zijn belangrijke mijlpalen voor de bezuinigingen. De volgorde van de bezuinigingen heeft geen invloed op de uitkomst en kan variëren op basis van voorkeur of handigheid van de gebruiker.
- Plaats de naald aan het begin van de vorige snede, aan de linkerrand van het cement klier en flick de naald omhoog tot aan de onderkant van de linker oog bereikt. Dit zal een verticale snede van de linkerrand van het cement klier onderaan het linkeroog maken.
- Plaats de naald aan de rechterrand van het cement klier en flick de naald omhoog tot aan de bodem van het rechteroog bereikt. Dit zal een verticale snede van de rechterrand van het cement klier onderaan het rechteroog maken.
- Om volledig accijnzen het weefsel, flick de naald uit de bodem van het linkeroog onderaan het rechteroog, waardoor een horizontale snede dat het weefsel vrij. Cuts kan zich uitstrekken van de buitenkant van het embryo naar de voordarm, zowel ectoderm en endoderm in de EAD explantaat. Als alternatief kunt ondiepe sneden worden gebruikt voor ectoderm alleen-EAD transplantaties. Zodra de EAD weefsel wordt verwijderd, moet er een rechthoekig gat van de buitenkant van het embryo in de voordarm zijn, zich van het cement klier tot net onder de ogen (boven naar beneden). Het gat moet uitstrekken van de binnenrand van het linker oog naar de binnenrand van het rechter oog (links naar rechts). Zie afbeelding 2Bb.
- Duw de weggesneden weefsel op de punt van de naald, en til het door de buffer naar het deel van het schaaltje met gastheer embryo's. Stel het weefsel niet bloot aan de oppervlakte lucht of het zal worden beschadigd.
- Accijnzen hetzelfde weefsel van de gastheer embryo, als de donor. Gooi de gastheer EAD explant of opslaan op insertiet in de donor gezicht, voor wederzijdse transplantaties.
- Plaats de donor explant in de resulterende gastheer gat met behulp van # 5/45 tang.
- Zodra het donorweefsel correct geplaatst is en goed geplaatst, zorgvuldig plaats een glazen brug (zie Figuur 1 en Figuur 2BC) over het gezicht van de embryo's om de transplantatie plaats te houden. De uiteinden van de brug moet invoegen in de klei, die het op zijn plaats. De brug moet voorzichtig druk uitoefenen op het getransplanteerde weefsel, zodanig dat de transplantatie gelijk ligt met de gastheer hoofd, zonder het steken van het hoofd of liggen diep in het hoofd. Het hoofd kan enigszins worden afgevlakt door de cover slip, maar wees voorzichtig het embryo niet te beschadigen met te veel druk. Transplantaties worden uitgevoerd binnen 5 minuten.
OPMERKING: Een ervaren onderzoeker kan ongeveer twintig transplantaties uit te voeren per experiment, meer dan 2-3 uur. Gedurende deze periode zal de embryo's de voortgang van fase 20-22. Het invullen van de gezichtstransplantaties in stap 21 of 22 heeft geen invloed op de resultaten. Later transplantaties (stadia 22-26) kan worden gedaan, maar zijn moeilijker als de-kuif gratis EAD middellijn regio wordt versmald als craniale neurale lijst beweegt in het gezicht. Consistentie in transplantaties is van cruciaal belang.
6. Gezicht Transplant Post-operatie Recovery
- Genezing duurt meestal 2-3 uur. Verlaat de embryo's bij kamertemperatuur ongestoord in hun klei depressies met de glazen bruggen die het donorweefsel op zijn plaats.
- Zodra de transplantaties zijn genezen, verwijder voorzichtig de glazen bruggen, verwijder de klei uit rond de basis van de embryo's met behulp van een tang, en gebruik een plastic afgestudeerd transferpipet om voorzichtig stofzuigen de embryo's uit hun depressies.
- Doe de embryo's in een geschikt gemerkte petrischaal, half gevuld met schoon 0.1x MBS met gentamycine.
- Groeien de embryo's bij 15 ° C of 18 ° C gedurende enkele dagen totdat ze voeden kikkervisje stadium stadium 40, wduivin gezicht fenotypes kan worden gescoord.
- De 0,1 x MBS oplossing met gentamycine moet dagelijks worden veranderd, en eventuele dode embryo's moet onmiddellijk worden verwijderd om besmetting en de dood van andere embryo's te voorkomen.
- De mond opent in fase 40. In fase 40-41, moet men controleren dat het getransplanteerde weefsel blijft genezen in plaats door het bekijken van de fluorescentie. Transplantaties af en toe vallen, dus moet men ervoor zorgen dat alle scoorde embryo's hebben het donorweefsel op zijn plaats.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Getransplanteerde weefsel moeten volledig worden ingebracht in de gastheer kop na transplantatie zoals getoond in figuur 3A, en een glazen brug adequaat op het gezicht van de embryo's geplaatst, zie figuur 2BC. De getransplanteerde donorweefsel moet correct worden gedimensioneerd voor de host opening, voor de transplantatie succesvol te zijn. De EAD weefsel moet niet uitsteken van de kop, op enige wijze, zoals getoond in figuren 3B en 3C. Bovendien moet de gezichtstransplantatie niet worden geroteerd ten opzichte van zijn positie in de donor, zoals getoond in figuur 3D. Na enkele uren moet het getransplanteerde weefsel en de omringende gelaat genezen, en de volgende dag, moet het embryo worden weergegeven als voorbeeld getoond in Figuren 4A en 4A. Men kan waarnemen, onder fluorescentie, dat de transplantatie plaats blijft in figuur 4B. In stap 41 wordt de getransplanteerde controleweefsel contribute de mond, en fluorescente groen blijven, gezien in figuur 4B. Wild-type EAD weefsel getransplanteerd in wild type gastheren moeten leiden tot normale gezichten, in vergelijking met onverstoord wild-type embryo's. Echter, met LOF of GOF donorweefsel, gezichten moeten genezen en blijven in het hoofd, maar deze kan wel of niet tot normale craniofaciale structuren, zoals weergegeven in figuur 3 van Dickinson en Sive 5.
| Reagens | Ingrediënten | Instructies |
| 1 M CaCl2-oplossing | 111 g CaCl2 per liter | Autoclaaf en op te slaan in 1 ml fracties bij -20 of 4 ° C. |
| 10x Modified Barth's Saline (MBS) Oplossing | 880 mM NaCl, 51,4 g | Stel het volume tot 1 l met gedestilleerd water. Pas uiteindelijke pH tot 7,8 met NaOH endan autoclaaf. |
| 10 mM KCl, 745,5 mg | ||
| 10 mM MgSO4, 1,2 g | ||
| 50 mM HEPES (pH 7,8), 11,9 g | ||
| 25 mM NaHCO 3, 2,1 g | ||
| 1x MBS Solution | Final Concentraties: | Bereid 1x MBS-oplossing door het mengen van 100 ml 10x MBS zoutoplossing met 0,7 ml 1 M CaCl2-oplossing. Stel het volume tot 1 l met gedestilleerd water. Verdun deze oplossing aan 0,5 x MBS en 0,1 x MBS maken. |
| 88 mM NaCl | ||
| 1 mM KCl | ||
| 0,7 mM CaCl2 | ||
| 1 mM MgSO4 | ||
| 5 mM HEPES (pH 7,8) | ||
| 2,5 mM NaHCO3 |
Tabel 1. Reagentia, ingrediënten, en instructies.
| Warmte | Trek | Vel. | Tijd |
| 800 | 70 | 40 | 50 |
Tabel 2. Naald Puller instellingen *.
* Naald puller instellingen variëren van machine tot machine, zodat elk lab zal waarschijnlijk nodig hebben om hun eigen naald trekker instellingen te optimaliseren.
Figuur 1. Instrumenten die worden gebruikt. A) toont een intact, ongebroken naald en een gebroken naald na de flexibele punt is verwijderd. B) toont twee pipet gereedschap waarvan de uiteinden zijn volledig afgesloten en afgerond. C) toont drie monster glazen bruggen. Schaalbalken = 1,000 mm.
.. Figuur 2 Samenvatting van het gezicht transplantatie methode A) Algemeen Transplant Scheme:.. Schematische voorstelling van het gezicht transplantatie methode een Embryo's worden geïnjecteerd met een fluorescerende stof en een antisense oligonucleotide morfolino op de 1-cel stadium. De fluorescerende stof kan zowel GFP mRNA, FITC-gelabeld morfolino, of TL-dextran. B. Vermoedelijk mond wordt verwijderd in fase 22 van een groot wild-type embryo en een donor morphant embryo. Het getransplanteerde weefsel kan ook worden vergroot om de vermoedelijke neus, die direct boven de monding regio ligt omvatten. De donor morphant weefsel wordt getransplanteerd naar de wild-type gastheer, en dan wordt vastgezet op zijn plaats met een glazen brug. Grijs boog: uitbroeden klier.
Figuur 3. Schematische voorstelling van embryo kort na transplantatie. Worden bekeken Frontale getoond. Het getransplanteerde weefsel wordt geschetst in rode stippen. A en A 'tonen een ideale uitkomst in stap 22. Het weefsel wordt volledig ingebracht en goed in de weg. B en B 'vertonen werkende transplantatie, met het weefsel gedeeltelijk in de weg. C en C ingevoegd "toon werkende transplantatie meeste van het weefsel ingebracht in de kop, maar de overbodige gebied uitsteekt vanuit de genezing plaats. Dit weefsel zal afsterven, en remmen de genezing van de omgeving, goed geplaatst regio. D en D 'tonen een onjuiste transplantatie, waar het gezicht is in de ontvangende gedraaid, ten opzichte van zijn positie in de donor. De tkwestie zal genezen in de kop, maar het gezicht zal niet normaal ontwikkelen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Oudere embryo's met ideale uitkomst. Worden bekeken Frontale getoond. cg: cement klier; mo:.. mond A) Geeft een embryo een dag na de transplantatie, met een goed genezen transplantatie in fase 32 A ') Geeft deze zelfde embryo met een fluorescerende overlay, wat bevestigt dat het getransplanteerde weefsel blijft op zijn plaats B. ) toont dezelfde embryo in de eerste fase 42 die een controle morfolino, GFP + transplantatie enkele dagen voor hadden. Het gezicht is goed. B 'ontwikkeld)Toont dezelfde embryo met een fluorescerende overlay, wat bevestigt dat het getransplanteerde weefsel blijft in het hoofd en heeft normaal bijgedragen aan gezicht structuren. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritische stappen en beperkingen: De EAD gezicht transplantatie procedure is tijd en arbeidsintensief. Het vereist oefening, een vaste hand, en behendigheid te perfectioneren. Het gezicht transplantatie protocol is gebaseerd op het vermogen van de onderzoeker om efficiënt te verwijderen en de transplantatie weefsel. Als men te lang duurt om de transplantatie te voegen in het gezicht van de gastheer, zal de gastheer gezicht beginnen te contracteren en te genezen. Tang kan worden gebruikt om delicaat breiden het gezicht regio. Indien significante wondcontractie heeft plaatsgevonden, de transplantatie niet zo goed genezen en moeten in grootte worden verkleind om te passen in het gezicht gat van de gastheer. Grootte en vorm van de transplantatie moet ongeveer overeenkomen met de grootte en de vorm van het gezicht holte van de ontvanger, om succesvol te kunnen inbrengen.
Gezicht transplantaties zijn het meest succesvol wanneer deze wordt uitgevoerd tussen de fasen 19-22, met embryo's die zijn afgestemd op het podium. Oudere gezicht transplantaties, tussen fasen 22-26, zijn mogelijk, maar zijn meer uitdagende eend kan neurale migratie verstoren in de zijkanten van het gezicht, omdat de-kuif gratis middellijn regio wordt aanzienlijk smaller uit fase 22-26.
Zowel de ontvanger en donor moet op soortgelijke stappen voor de transplantatie om optimaal te werken. Het dient bij hetzelfde stadium en minimaal moeten binnen enkele uren na elkaar. Embryo geïnjecteerd met antisense-RNA morfolino oligonucleotiden ("morphants") soms langzamer dan wild-type te ontwikkelen of te beheersen morphant embryo's, te eisen dat morphants worden gekweekt bij een hogere temperatuur om stadia het wild type embryo 'overeenkomen.
De donor gezicht weefsel moet niet worden geroteerd in het ontvangende lichaam ten opzichte van zijn oorspronkelijke positie in de donor embryo, anders het gezicht niet normaal te ontwikkelen. Het cement klier hoeft niet te worden opgenomen in het gezicht transplantatie de procedure werkt, het gezicht normale ontwikkeling zonder. Echter, de cement klier vaak inbegrepen in thij uitgeroeid tissues omdat het dient als een afzonderlijke merker aan te geven en de positie van de onderkant van het transplantaat. Deze marker zal helpen voorkomen ongeluk draaien het weefsel tijdens de overdracht van het gezicht weefsel aan de ontvanger. Als de transplantatie is onjuist geplaatst in de gastheer gezicht, kan het donorweefsel worden verwijderd en weggegooid. Men kan proberen een nieuwe transplantatie te voegen in dezelfde host, als de opening niet is begonnen te vernauwen. Echter, als de host opening merkbaar is gekrompen, gooi de gastheer en opnieuw beginnen.
Het is cruciaal om de glazen brug direct aan de getransplanteerde gezicht plaatst, zodat de transplantatie tijdens genezing in het hoofd van de gastheer wordt gehouden. Als de transplantatie niet zijn plaats wordt gehouden, kan de transplantatie worden geëxtrudeerd uit gezicht gastheer. Transplantaties die niet helemaal in het gezicht of die pop tijdens de genezing zal necrose ondergaan. Zelfs in perfecte transplantaties, kunnen kleine hoeveelheden dood weefsel optreden rond de randen of de transplantatie. Meestal wordt dit veroorzaakt geen bijwerkingen en een volledig normale gezicht kan nog worden gevormd. Bij succesvolle controles we geen malformaties waargenomen na vier weken ontwikkeling suggereert dat het kraakbeen normaal gevormd en dat de afwijzing van het weefsel is zeldzaam.
Tot slot, wanneer morfolino verstoort een eiwit nodig is voor normale wondgenezing, deze techniek niet werken, aangezien het getransplanteerde weefsel LOF niet in de ontvangende dieren worden opgenomen.
Eventuele wijzigingen en Trouble Shooting: Wijzigingen kunnen worden aangebracht in de procedure. Met de praktijk, kan de onderzoeker leren om kleinere regio's, bijvoorbeeld de helft van de EAD transplantatie. Ondiepe insnijdingen toe ectodermale transplantaties, waardoor de diepere endoderm ongestoord. Andere gebieden van embryonaal weefsel kunnen worden getransplanteerd, met soortgelijke aanpak.
Als de getransplanteerde weefsel sterft na het inbrengen, zijn er een paar pOGELIJKE oorzaken. Getransplanteerde weefsel die niet volledig wordt ingebracht in de gastheer of passende plaats gehouden met een glazen brug, sterven en belemmeren goede genezing. Zorg ervoor dat u volledig in te brengen het getransplanteerde weefsel en zet het vast met een glazen brug. Als de transplantatie is afgeleid van een morfolino of RNA geïnjecteerd donor, dan het weefsel sterven door toxiciteit van geïnjecteerde middelen. Evenzo, als de ontvangende embryo's morphants of-RNA geïnjecteerde en vaak sterven, wordt het bedrag van morfolino of RNA moet worden verminderd. Om deze problemen op te lossen, titreer de hoeveelheid ingespoten RNA of morfolino en bepaal een veilige hoeveelheid voor een succesvolle gezicht transplantaties. Tenslotte verhogen van de zoutconcentratie van de oplossing boven 0,1 x MBS kan genezing helpen.
Betekenis: De transplantatie techniek gezicht beschreven maakt analyse van de lokale behoeften en de activiteit van genproducten tijdens craniofaciale ontwikkeling. Deze aanpak kan si verduidelijkengnaling tussen de zich ontwikkelende noncrest, neurale lijst, en de omliggende structuren. Het maakt het mogelijk om LOF of GOF (met elke strategie) onderzoeken alle EAD afgeleide weefsels, wat niet mogelijk is met een enkele promotor aangedreven construct. Hoewel er een lange geschiedenis van weefseltransplantatie in ontwikkelingsbiologie dit is de eerste toepassing van de transplantatie aan de studie van craniofaciale ontwikkeling in kikkers en is cruciaal voor mechanistische studies 7. Zo kan de techniek helpen om de complexe mechanismen die de patronen en de vorming van de gewervelde gezicht ontrafelen en om de oorzaken van craniofaciale defecten in de ontwikkeling te verduidelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Radek Sindelka voor zijn hulp, en Cas Bresilla voor het assisteren met kikker veeteelt en embryo voorbereiding. Dit werk werd gefinancierd door de NIH via de subsidie R01DE021109 om HLS Laura Jacox werd gefinancierd door de Herschel Smith Graduate Fellowship aan de Harvard University en een F30 individuele beurs subsidie F30DE022989-01 via de NIDCR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pasteur pipette | VWR | 14672-400 | Lime Glass |
| Size 5 3/4 in | Cotton Plugged | ||
| Graduated Transfer Pipette | VWR | 16001-180 | Disposable |
| #5/45 forceps | Fine Science Tools by Dupont medical | 11251-35 | Angled 45° |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-20 | Straight; serrated tip; stainless steel |
| Capillary Tubing (for needles) | FHC | 30-30-1 | Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID/Fiber |
| Cover slip | VWR | 48393 252 | 24 x 60 mm micro cover glass; |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 | |
| Needle Puller | Sutter Instrument Co | Needle Puller: discontinued Filament: FB300B | The most similar, currently available needle puller is the P-97. For filaments, use Sutter 3.00 mm square box filaments, 3.0 mm wide. |
| Model P-80 | Flaming / Brown micropipette puller | ||
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Stereomicroscope Lighting by Fostec | Fostec | Use a light box with 2 fiberoptic arms. | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | Jaw Opening Diameter: 0-1 mm |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Jaw opening Diameter: 0-1 mm |
| Tungsten Needles | Fine Science Tools | 10130-05 | 0.125 mm Rod diameter |
| Van Aken Plastalina | Blick | #33268-2981 | |
| Modeling Clay- white, red, or yellow | |||
| mMessage mMashine SP6 or T7 Kit | Ambion | AM1340 |
References
- Gorlin, R. J., Cohen, M., Levin, L. Syndromes of the head and neck. , Oxford University Press. UK. (1990).
- Trainor, P. Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention. Am. J. Med. Gen. A. 152, 2984-2994 (2010).
- Dickinson, A. J., Sive, H. L. Development of the primary mouth in Xenopus laevis. Dev. Bio. 295, 700-713 (2006).
- Dickinson, A. J., Sive, H. L. Positioning the extreme anterior in Xenopus: cement gland, primary mouth and anterior pituitary. Sem. Cell Dev. Bio. 18, 525-533 (2007).
- Dickinson, A. J., Sive, H. L. The Wnt antagonists Frzb-1 and Crescent locally regulate basement membrane dissolution in the developing primary mouth. Dev. 136, 1071-1081 (2009).
- Gilbert, S. F. Developmental Biology. , Sinauer Associates, Inc. Sunderland, MA. (2010).
- Borchers, A., Epperlein, H. H., Wedlich, D. An assay system to study migratory behavior of cranial neural crest cells in Xenopus. Dev. Genes Evol. 210, 217-222 (2000).
- Grunz, H. Homoiogenetic neural inducing activity of the presumptive neural plate of Xenopus laevis. Dev. Growth Differ. 32, 583-589 (1990).
- Servetnick, M., Grainger, R. M. Changes in neural and lens competence in Xenopus ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer. Dev. Bio. 112, 177-188 (1991).
- Servetnick, M., Grainger, R. M. Homeogenetic neural induction in Xenopus. Dev. Bio. 147, 73-82 (1991).
- Couly, G., Coltey, P., Le Douarin, N. The triple origin of skull in higher vertebrates: a study in quail-chick chimeras. Dev. 117, 409-429 (1993).
- Couly, G. F., Le Douarin, N. M. Mapping of the early neural primordium in quail-chick chimeras : I. Developmental relationships between placodes, facial ectoderm. 110, 422-439 (1985).
- Couly, G. F., Le Douarin, N. M. Mapping of the early neural primordium in quail-chick chimeras II. The prosencephalic neural plate and neural folds: Implications for the genesis of cephalic human congenital abnormalities. Dev. Bio. 120, 198-214 (1987).
- Lievre, A. L., Le Douarin, N. The early development of cranial sensory ganglia and the potentialities of their component cells studied in quail-chick chimeras. Dev. Bio. 94, 291-310 (1982).
- Kennedy, A., Dickinson, A. Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes. Dev. Bio. 365, 229-240 (2012).
- Trainor, P., Tam, P. Cranial paraxial mesoderm and neural crest of the mouse embryo- codistribution in the craniofacial mesenchyme but distinct segregation in the branchial arches. Dev. 121, 2569-2582 (1995).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
- Tandon, P., Showell, C., Christine, K., Conlon, F. Morpholino injection in Xenopus. Methods Mol. Biol. 843, 29-46 (2012).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , Garland Publishing. New York. (1994).
