Summary
En teknik til omplantning "Extreme Anterior Domain" facial væv mellem Xenopus laevis embryoner er blevet udviklet. Væv kan flyttes fra en genekspression baggrund til en anden, hvilket tillader undersøgelse af lokale krav til kraniofaciale udvikling og til signalering interaktioner mellem ansigtet regioner.
Abstract
Kraniofaciale misdannelser forekommer i 1 ud af hver 700 levendefødte, men Ætiologien sjældent kendt på grund af begrænset forståelse af kraniofaciale udvikling. At identificere, hvor signalveje og væv handle under mønstret af ansigtet udvikle, har en 'ansigt transplantation' teknik er udviklet i embryoner fra frøen Xenopus laevis. En region af formodede ansigtsservietter (den "Extreme Anterior Domain" (EAD)) fjernes fra en donor embryo på tailbud scenen, og transplanteres til en værtsembryo af samme fase, hvorfra den tilsvarende region er blevet fjernet. Dette kan bruges til at generere et kimært ansigt, hvor værten eller donorvæv har et tab eller gevinst af funktion i et gen, og / eller omfatter en slægt etiket. Efter healing, er resultatet af udviklingen overvåges, og angiver roller signalvejen inden donor eller de omkringliggende værtsvævene. Xenopus er en værdifuld model for ansigt udvikling, da ansigtet regionen er stor og let enccessible for mikromanipuleringer. Mange embryoner kan analyseres i løbet af en kort tidsperiode, da udvikling sker hurtigt. Fund i frøen er relevante for menneskelig udvikling, da kraniofaciale processer vises konserveret mellem Xenopus og pattedyr.
Introduction
For at forstå mekanismerne bag kraniofaciale misdannelser 1-2, vigtige væv og deres signalering bidrag i løbet af kraniofaciale udvikling skal identificeres. I frøen Xenopus laevis del af ansigtet, herunder munden og næsebor form fra "Extreme Anterior Domain" (EAD), hvor ektoderm og endoderm direkte sammenstillet 3-4. EAD fungerer også som en signalering center til at påvirke omgivende væv, herunder kranie neurale våbenskjold, som danner kæberne og andre ansigtstræk regioner 5. Til at identificere gener, der bidrager til EAD funktion, en 'ansigt transplantation' teknik udviklet, hvor væv transplanteres fra en donor til en værtsembryo efter fjernelse af den tilsvarende vært regionen. Efter transplantationen, medfører ansigtet udvikling vurderes. Således er virkningerne af tab af funktion (LOF) eller øget funktion (GOF) for et specifikt gen i EAD analyseret lokalt, hvor resten af head og krop består af vildtype væv. Den gensidige transplantation kan udføres, hvor vildtype væv er transplanteret ind i embryoner med global LOF eller GOF i specifikke gener. Transplantation er ofte blevet brugt i Xenopus og chick studies 6. For eksempel har Xenopus transplantation behandlet homogenetic neural induktion, linse og neurale kompetence, og neuralkam migration 7-10. Quail-chick kimære podning har analyseret udviklingen af den forreste neurale plade, anterior neural højderyg, neurale våbenskjold, og kranieknogler 11-14. Dette er den første transplantation teknik til undersøgelse af kraniofaciale udvikling i Xenopus. Denne teknik har vist en hidtil ukendt rolle for Wnt inhibitorer Frzb1 og Crescent i reguleringen basalmembran dannelse i den formodede munden 5. Xenopus laevis er en ideel model for undersøgelse af kraniofaciale udvikling embryoer er store, udvikle eksternt, etnd ansigtet er umiddelbart synlige, så mikromanipulering og billeddannelse af udvikling. Mekanismerne bag facial udvikling ser bevaret, hvilket indikerer, at konstateringer i frøen give indsigt i den menneskelige udvikling 4,15-16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Forberedelse reagenser
- 10x MBS: Forbered 1 L 10x Modificeret Barths Saline (MBS) løsning 17. Se Tabel 1, reagenser, ingredienser, og instruktioner. Brug destilleret vand til alle løsninger. Bland i et bæger, ved hjælp af en omrører, indtil fuld opløsning. Alle opløsninger bør foretages ved stuetemperatur.
- 1x MBS: Fortynd 100 ml 10x MBS løsning i 900 ml destilleret vand til at gøre 1 L 1X MBS. Tilføj 0,7 ml 1 M CaCl2-opløsning.
- 0.1x MBS: fortynd 1x MBS at forberede 1 L 0,5 X MBS-opløsning og 2 l 0,1 x MBS løsning. Til 1 liter 0,1 x MBS opløsningen, tilsættes 1 ml 10 mg / ml gentamycin løsning. Den 0.1x MBS løsning med gentamycin skal bruges til langsigtet embryo kultur.
- Ficoll / MBS: Tilføj 15 gram Ficoll 400 til 500 ml 0,5 x MBS løsning. Bland kraftigt. Tilføj en omrørerstav og bland indtil Ficoll er helt opløst (flere timer).
- 70% ethanol: Fortynd 100% ethanol til 70% ethanol under anvendelse afdestilleret vand.
2. Forberedelse Glas Operating Tools
- Needle forberedelse: Load kapillarrør ind i en nål aftrækker.
- Træk nåle i henhold til de indstillinger, der vises i tabel 2: Needle puller indstillinger. Indstillingerne er for en Sutter Instrument Co Model P-80/PC mikropipette aftrækker og kapillær slanger, som beskrevet i tabel specifikke reagenser og udstyr. Men disse indstillinger er specifikke for Sutter nål aftrækker, og bliver nødt til at blive justeret for andre maskiner. Indstillinger kan bestemmes ved hjælp af en rampe test, som angivet af maskinens fabrikant.
- Træk 4-6 nåle i forberedelse til proceduren. Nålene bør opdeles sådan, at den fleksible, hår-lignende del af glasset spidsen fjernet helt, hvilket er typisk 2-3 mm lang. Spidsen skal være relativt stiv, men stadig smal nok til at blive brugt som et skærende værktøj. Se foto af en ideel nål i figur 1A. Opbevar nåle i en petriskål med en strimmel af ler ned i midten. Tryk på skaftet af hver nål i leret, for at holde det på plads, og for at holde den skrøbelige skarpe spids væk fra bunden og sider.
- For yderligere værktøjer, få dækglas, et par lange standard mønster pincet, en bunsenbrænder, og 3-4 glas Pasteur-pipetter (str. 5 ¾ tommer).
- Pipette værktøj: At gøre en pipette værktøj, tænde bunsenbrænder og placer spidsen af en glas Pasteur pipette i den blå del af flammen, mens du roterer det, sådan at spidsen smelter og hullet helt sæler, der danner en lukket, afrundet ende . Den afrundede, forseglet spids senere bruges til at lave fordybninger i leret fad, der holder embryoner under operationen. Se Figur 1B.
- Glas broer: At gøre glas broer, bruger lang standard mønster pincet til forsigtigt at brække 3 mm 3 mm bidder af dækglas glas. Mens du holder stykke dækglas med tweezers placere glasset i flammen, indtil alle fire kanter blødgøre og kurve nedad, danner en lille glaskuppel. Kanterne bør ikke længere være skarpe. Se figur 1C.
- Opbevar dækglas broer ved at indsætte dem, kanter ned, i modellervoks, foring i bunden af en petriskål. Sæt broerne sådan, at toppen af broen forbliver over leret overflade. Skub ikke for hårdt, således at broen brydes, og ikke fuldt ud integrere broen i leret, fordi det kan være vanskeligt at fjerne. Efter sterilisering med en flamme eller 70% ethanol, kan broerne genbruges fra eksperiment til eksperiment.
3. Forberedelse til Embryo Operation
- Beklæd en lille 60 mm plastik petriskål med modellervoks. Mellem brugere, er skålen og ler overfladen grundigt vasket med destilleret vand og derefter med 70% ethanol.
BEMÆRK: Brug rød, hvid eller gul, Van Aken Plastalina modellervoks, som kan købes på en lokal tily eller kunst butik. Sort ler ikke anbefales, da det frigiver en rest. - Fyld skålen med 3% Ficoll 0.5x MBS løsning. Jo højere saltkoncentration forhindrer væv dissociation og polysaccharidet Ficoll hjælper til at fortykke opløsningen, som hjælper med at holde ansigtet i position.
- Brug flamed Pasteur-pipette redskab (se figur 1) for at gøre lavvandede, 2-3 mm fordybninger i leret, om dybden af et trin 20 embryo krop. Gør 20-30 depressioner, 1-2 mm fra hinanden, på hver side af skålen, så der er i alt 40-60 depressioner. Mærk den ene side LOF / GOF, og den anden side vildtype udelader initialer i leret med en pincet.
4.. Preoperation Embryo Forberedelse
- Anskaf og kultur Xenopus laevis embryoner ved hjælp af standard metoder 17. For en detaljeret beskrivelse af frøen dyrehold, se Sive et al. 17.
- Otteogfyrre timer før eksperimentet SKAFFESi æg fra kvindelige frøer og udføre in vitro-befrugtning.
- Injicer 0,5-1 ng af det udjævnede membran GFP mRNA, plus eventuelle ønskede mRNA eller anti-sense morpholino-modificerede antisense-oligonukleotider ("morpholinos") på den ene celle scenen eller i 2 celler på det 2-celle stadie. Den ene celle fase varer ca 70-90 min. Indsprøjtes et samlet volumen på 1-3 nl. I stedet for RNA, der koder for et fluorescerende protein (såsom GFP eller RFP RNA), kan man injicere FITC-mærket morpholino-eller fluorescensmærket dextran. Fluorescens er vigtig for at fastslå, om det transplanterede væv heler og forbliver i hovedet.
- Capped mRNA kan fremstilles ud fra et lineariseret plasmid under anvendelse af en mMessage mMachine SP6 eller T7 kit. Morpholinos kan designes og bestilles gennem Gene Tools LLC. Mængden af morpholino kræves til en ønsket effekt skal bestemmes for hvert gen 18.
- Opbevar de injicerede embryoner ved 15 ° C i 48 timer, indtil de når stadie 19-20. (Feller alle efterfølgende trin, embryoer i henhold til den normale tabel over Xenopus laevis af Nieuwkoop og Faber 19..)
BEMÆRK: På dagen for operationen, skal begge modtager og donor embryoner være inden for en fase af hinanden for transplantationer til at arbejde optimalt. Men embryoner injiceret med morpholinos ("morphants") undertiden udvikler sig langsommere end vildtype eller kontrollere morphant embryoner, hvilket gør det nødvendigt at koordinere eksperimenter så både morphant og vildtype embryoner er på samme stadium. Muligvis holdes ved en højere temperatur for 12-24 hr forud for proceduren Morphants. For at øge sandsynligheden for, at embryoner kan findes på matchende stadier kan embryoner holdes ved flere temperaturer. Fireogtyve timer før forsøget, bør man opdele embryoner i en flere retter, og placere morphants ved 18-20 ° C og vildtype embryoer ved 15-18 ° C.
- På dagen for transplantationen eksperiment remove embryoner fra the15 ° C inkubator og iscenesætte dem i henhold til Nieuwkoop og Faber 19. Hvis de er yngre end sent neurula (trin 19), lad dem ved stuetemperatur i 1-2 timer, indtil de når stadie 19.
- Screen de injicerede embryoner under en fluorescerende mikroskop. Vælg embryoner, der viser ensartet, lyse fluorescens til eksperimentet.
- Fjern rod og eventuelle forureninger i nærheden af arbejdsområdet. Tør operativsystemet overflade, stereomikroskop, og alle værktøjer med 70% ethanol.
- Når embryonerne er i stadie 19, fjerne vitellinmembranen hjælp # 5/45 Dumont pincet under et stereomikroskop.
- Fjern vitellinmembranen 20-30 af hver af donor og vært embryoner.
- For de første adskillige ansigt transplantation eksperimenter, bør man øve med et par embryoner til hver tilstand. Metoden er udfordrende og kræver omhyggelig praksis, før det kan anvendes på en større skala, hurtigt og med succes. Man kan arbejde up til at gøre 20 transplantationer / eksperiment.
- Flyt vært embryoner ind på operationsstuen fad med en plastik gradueret overførselspipette med spidsen skåret sådan, at åbningen er meget bredere end et foster (mindst et par millimeter). Vær omhyggelig med at undgå at røre embryoner til bobler eller vandoverfladen, da embryoner vil eksplodere i overfladespænding.
- Brug # 5/45 pincet til at indsætte embryoer ind i ler depressioner, med den bageste af embryoet i leret. Luk forsigtigt leret omkring baser af foster ved hjælp af tangen, der forlader den øverste fjerdedel af embryonet, hovedet, stikker ud af depression.
- Når alle host embryoner er sikret i deres depressioner, flytte til den anden side af pladen og begynder at indsætte donorembryoner i deres depressioner. Gentag processen for at sikre de embryoner i deres brønde.
5.. Udførelse af Face Transplant Surgery
- Skære kniv: Som en skærende kniv til fjernelsedonor EAD væv, bruge en passende glasskår kapillar nål (se trin 2.3 og figur 1).
BEMÆRK: Man kan direkte holde kapillarrøret mellem fingrene (dette fungerer godt for folk med små hænder), eller man kan montere nålen i et insekt ben holder. Electrosharpened wolfram nåle 17 indlæses i en stiftholder kan anvendes i stedet for et kapillarrør nål. Se venligst foreslåede kegleholderne og wolfram nåle i Tabel over specifikke reagenser og udstyr. - Under et stereomikroskop, indfør kanylen ind i hovedet på embryonet til venstre for cement kirtel. Nålen skal indsættes dybt, så den passerer udefra embryonet, gennem hovedet, og ind i foregut. At omplante hele EAD skal snit strækker sig fra ydersiden af embryonet til foregut. For ektoderm kun transplantationer bør udskæringer være fladere og strækker sig kun gennem ectoderm.
- Flick nålen fra venstre til højre side afhovedet, på tværs af hele bredden af cement kirtel. Det svirpe er vigtig, da bevægelsen giver et rent snit. Der henvises til figur 2A for et resumé af teknik og figur 2B for en demonstration af nedskæringerne. Cementen kirtel og øjnene er vigtige pejlemærker for nedskæringerne. Rækkefølgen af de nedskæringer ikke påvirker resultatet og kan variere baseret på brugerens præferencer eller håndethed.
- Anbring kanylen ved starten af den foregående snit ved venstre kant af cementen kirtel og svirp nålen opad, indtil den når bunden af det venstre øje. Dette vil skabe et lodret snit fra venstre kant af cementen kirtel til bunden af det venstre øje.
- Anbring kanylen på højre kant af cement kirtel og svirp nålen opad, indtil den når bunden af det højre øje. Dette vil skabe et lodret snit fra den højre kant af cement kirtel til bunden af det højre øje.
- For fuldt ud at udskære væv, flick nålen fra bunden af det venstre øje til bunden af det højre øje, hvilket skaber et vandret snit, der vil frigøre vævet. Cuts kan strække sig fra kanten af embryonet til foregut, herunder både ektoderm og endoderm i EAD eksplantation. Alternativt kan lave udskæringer bruges til ektoderm-only EAD transplantationer. Når EAD væv fjernes, bør der være et rektangulært hul udefra af embryoet i foregut, der strækker sig fra cement kirtel til lige under øjnene (top til bund). Hullet skal strække sig fra den indvendige kant af den venstre øje til den indvendige kant af det højre øje (side til side). Se figur 2BB.
- Skub forsigtigt udskårne væv på spidsen af nålen, og løft den gennem buffer til del af skålen, der indeholder værten embryoner. Udsæt ikke vævet til overfladen luft eller det vil blive beskadiget.
- Udskære samme væv fra værtsembryo som for donoren. Kassér vært EAD eksplantatet eller gemme den til isætningt ind i donor ansigt, for gensidige transplantationer.
- Sæt donor eksplantatet i den resulterende vært hullet med # 5/45 pincet.
- Når donorvævet er korrekt placeret og indsættes helt, anbring forsigtigt et glas bro (se figur 1 og figur 2BC) over fosterets ansigt for at holde transplantatet på plads. Enderne af broen skal indsætte i ler, holder den på plads. Broen skal tryk forsigtigt på det transplanterede væv, således at transplantationen flugter med værten hovedet, uden at det stikker ud af hovedet eller liggende dybt inde i hovedet. Hovedet kan være en smule ødelagt af dækglasset, men pas på ikke at beskadige foster med for meget pres. Transplantationer bør udføres inden for 5 minutter.
BEMÆRK: En erfaren efterforsker kan udføre omkring tyve transplantationer per eksperiment over 2-3 timer. I denne periode embryonerne kommer videre fra trin 20-22. Fuldfører ansigt transplantations ved trin 21 eller 22 ikke påvirker resultater. Senere transplantationer (i trin 22-26) kan gøres, men er mere vanskeligt, da toppen-fri EAD midterlinjen region er indsnævret som kranielle neurale crest bevæger sig ind i ansigtet. Sammenhæng på tværs af transplantationer er kritisk.
6.. Face Transplant Post-operation Recovery
- Healing tager typisk 2-3 timer. Lad embryoner ved stuetemperatur uforstyrret i deres ler fordybninger med glas broer holder donor væv på plads.
- Når transplantationer er helet, fjernes forsigtigt glas broer fjerne leret fra omkring bunden af embryonerne med pincet og bruge en plastic gradueret overførselspipetten til forsigtigt at støvsuge embryoner ud af deres depressioner.
- Sæt embryoner i en passende mærket petriskål, halvt fyldt med rene 0.1x MBS med gentamycin.
- Grow embryoner ved 15 ° C eller 18 ° C i flere dage, indtil de når fodring haletudse stadium stadie 40, whøne facial fænotyper kan scores.
- Den 0.1x MBS løsning med gentamycin bør ændres dagligt, og eventuelle døde fostre bør fjernes straks for at undgå forurening og død for andre embryoner.
- Munden åbner på trin 40.. På trin 40-41, må man kontrollere, at det transplanterede væv forbliver helbredt på plads ved at se dens fluorescens. Transplantationer lejlighedsvis falde ud, så man skal sikre, at alle scorede embryoner har donorvævet på plads.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Transplanteret væv skal sættes helt ind i værten hovedet efter transplantation som vist i figur 3A, og har et glas bro passende placeret på fosterets ansigt, som vist i figur 2bc. Det transplanterede donor væv skal være korrekt dimensioneret til værten åbning for transplantation at være vellykket. EAD-vævet rager ud fra hovedet, på nogen måde, som det ses i figur 3B og 3C. Desuden bør ansigt transplantation ikke drejes i forhold til dens position i donor organ, som vist i figur 3D. Efter flere timer, bør det transplanterede væv og omgivende flade helbrede, og den næste dag, bør fosteret vises som eksempel er vist i figur 4A og 4A. Man kan iagttage under fluorescens, at transplantationen forbliver på plads i figur 4B. På trin 41, vil det transplanterede kontrol væv contribute til munden, og vil forblive fluorescerende grøn, ses i figur 4B. Vildtype EAD væv transplanteret ind vildtype værter bør give anledning til normale ansigter, når man sammenligner med uforstyrrede vildtype embryoner. , Står imidlertid med LOF eller GOF donor væv helbrede og forblive i hovedet, men disse kan eller ikke kan give anledning til normale kraniofaciale strukturer, som vist i figur 3 i Dickinson og Sive 5..
| Reagens | Ingredienser | Instruktioner |
| 1 M CaCl2 opløsning | 111 g CaCl2 pr liter | Autoklave og opbevares i 1 ml portioner ved -20 eller 4 ° C. |
| 10x Modificeret Barths Saline (MBS) Løsning | 880 mM NaCl, 51,4 g | Juster lydstyrken op til 1 l med destilleret vand. Indstil endelig pH til 7,8 med NaOH ogderefter autoklaveres. |
| 10 mM KCI, 745,5 mg | ||
| 10 mM MgSO4, 1,2 g | ||
| 50 mM HEPES (pH 7,8), 11,9 g | ||
| 25 mM NaHCO3, 2,1 g | ||
| 1x MBS Løsning | Endelige koncentrationer: | Forbered 1x MBS opløsning ved at blande 100 ml 10x MBS saltopløsning med 0,7 ml 1 M CaCl2-opløsning. Juster lydstyrken op til 1 l med destilleret vand. Denne løsning fortyndes til lave 0,5 X MBS og 0.1x MBS. |
| 88 mM NaCI | ||
| 1 mM KCI | ||
| 0,7 mM CaCl2 | ||
| 1 mM MgSO4 | ||
| 5 mM HEPES (pH 7,8) | ||
| 2,5 mM NaHCO3 |
Tabel 1. Reagenser, ingredienser, og instruktioner.
| Hede | Træk | Vel. | Tid |
| 800 | 70 | 40 | 50 |
Tabel 2. Needle Puller Indstillinger *.
* Needle puller indstillinger varierer fra maskine til maskine, så hver lab vil sandsynligvis nødt til at optimere deres egne nål puller indstillinger.
Fig. 1. Værktøjer anvendes. A) viser en intakt, ubrudt nål og en knækket kanyle efter den fleksible spids er blevet fjernet. B) viser to pipette værktøj med deres ender fuldstændig forseglet og afrundet. C) Viser tre prøver glas broer. Skalapanelerne = 1,000 mm.
.. Figur 2. Resumé af ansigt transplantation metode A) Generelt Transplant Ordning:.. Skematisk af ansigt transplantation metode en Fostre injiceres med et fluorescerende middel og et antisenseoligonukleotid morpholino på 1 celle scenen. Den fluorescerende middel kan enten være GFP mRNA, FITC-mærkede morpholino, eller fluorescerende dextran. B.. Formodet mund fjernes ved trin 22 fra et væld vildtype foster og en donor morphant foster. Det transplanterede væv kan også udvides til at omfatte den formodede næse, som ligger direkte over mundingen. Donoren morphant væv transplanteres til vildtype vært, og derefter holdes på plads med et glas bro. Grå bue: hatching kirtel.
Figur 3.. Skematisk af embryoner kort efter transplantation. Er Frontal synspunkter vist. Det transplanterede væv er skitseret i røde prikker. A og A 'skildrer et ideelt resultat på trin 22.. Vævet er fuldt indsat og korrekt placeret i hovedet. B og B 'viser en forkert transplantation, med vævet delvist indsat i hovedet. C og C' viser en forkert transplantation med de fleste af vævet indsættes i hovedet, men overskydende region stikker fra den helbredende site. Dette væv vil necrose, og hæmme heling af de omkringliggende, korrekt indsatte regioner. D og D 'Vis en forkert transplantation, hvor ansigtet er blevet drejet i værten i forhold til dens position i donoren. Tspørgsmål vil helbrede ind i hovedet, men ansigtet vil ikke udvikle sig normalt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4.. Ældre fostre med ideelle resultater. Er Frontal synspunkter vist. cg: cement kirtel, MO:.. mund A) Viser et foster en dag efter transplantation, viser en ordentligt helet transplantation på trin 32 A ') Viser det samme foster med en fluorescerende overlay, der bekræfter, at det transplanterede væv forbliver på plads B. ) Viser den samme embryo på trin 42, som havde en kontrol morpholino, GFP + transplantation flere dage før. Ansigtet har udviklet sig ordentligt. B ')Viser samme foster med en fluorescerende overlay, der bekræfter, at det transplanterede væv forbliver i hovedet og har bidraget normalt til ansigtet strukturer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske stadier og Begrænsninger: EAD ansigt transplantation procedure er tid og arbejde intensivt. Det kræver praksis, konstant hænder, og fingerfærdighed at perfektionere. Ansigtet transplantation protokol bygger på forskerens evne til at fjerne effektivt og transplantation af væv. Hvis man tager for lang tid at indsætte transplantation i værtens ansigt, vil værten ansigt begynde at kontrakten og helbrede. Tang kan bruges til forsigtigt udvide ansigtet regionen. Men hvis betydelige sår sammentrækning har fundet sted, transplantationen vil ikke helbrede så godt og måske skal reduceres i størrelse til at passe ind i værtens ansigtsudtryk hul. Transplantationen størrelse og form skal omtrent svarer til størrelsen og formen af modtagerens facial hulrum, for at muliggøre en vellykket indføring.
Face transplantationer er mest vellykket, når de udføres mellem trin 19-22, med embryoner, der bliver matchet af scenen. Det er muligt Ældre ansigt transplantationer, mellem trin 22-26,, men er mere udfordrende end kan forstyrre neuralkam migration ind i siderne af ansigtet, da kam-fri midterlinjen region bliver væsentligt smallere fra stadie 22-26.
Både modtager og donor skal være på samme trin til transplantation til at arbejde optimalt. Ideelt set bør de være de samme trin og minimalt at være inden for et par timer efter hinanden. Embryoner injiceret med antisense-RNA-morpholino oligonukleotider ("morphants") somme tider udvikler sig langsommere end vildtype eller kontrollere morphant embryoner, der kræver, morphants dyrkes ved en højere temperatur, der passer til vildtype fostrenes faser.
Donoren ansigt væv ikke bør drejes i værtskroppen i forhold til sin oprindelige position i donor embryo, ellers ansigt vil ikke udvikle sig normalt. Cementen kirtel behøver ikke at indgå i ansigt transplantation for den procedure til at arbejde, ansigtet udvikler normalt uden. Men cement kirtel indgår ofte i than udryddet ansigtsservietter, fordi det fungerer som en særskilt markør til at angive og placere bunden af transplantation. Denne markør vil hjælpe med at undgå uheld roterende vævet under overførslen af ansigtet væv til modtageren. Hvis transplantation er blevet sat forkert i værten ansigt, kan donor væv fjernes og kasseres. Man kan forsøge at indsætte en ny transplantation ind i den samme vært, hvis åbningen ikke er begyndt at snøre. Men hvis værten åbning mærkbart er skrumpet, så kassere værten og begynde forfra.
Det er afgørende at placere glasset broen direkte på transplanteret ansigtet, så transplantationen holdes i værtens hoved under heling. Hvis transplantation ikke holdes på plads, kan transplantatet ekstruderes fra værtens ansigt. Transplantationer, der ikke er sat helt ind i ansigtet eller der springer ud under helingen vil undergå nekrose. Selv i perfekt transplantationer, kan der forekomme mindre mængder af vævsdød i kanterne of transplantationen. Normalt er dette ikke forårsage uønskede virkninger, og en helt normal ansigt stadig kan dannes. I vellykkede kontroller har vi ikke observeret nogen misdannelser efter fire ugers udvikling tyder på, at brusken dannes normalt, og at afvisningen af vævet er sjældne.
Endelig, hvis en morpholino perturbs et protein der kræves for normal sårheling, denne teknik kan ikke arbejde, da det transplanterede LOF væv kan ikke indlægges i værtens hoved.
Mulige ændringer og Trouble Shooting: Ændringer kan foretages til proceduren. Med praksis, kan forskeren lære at omplante mindre regioner, for eksempel halvdelen af EAD. Shallow indsnit tillader ektodermal transplantationer, forlader dybere endoderm uforstyrret. Andre områder af fostervæv kan transplanteres, brug af lignende metoder.
Hvis det transplanterede væv dør efter indsættelse, der er et par af possible årsager. Transplanteret væv, som ikke er sat helt ind i værten eller hensigtsmæssigt holdt på plads med et glas bro, vil dø, og forhindrer ordentlig heling. Sørg for fuldt ud at indsætte det transplanterede væv og fastgør det på plads med et glas bro. Hvis transplantatet er afledt af en morpholino-eller RNA injiceres donor, så vævet kan dø på grund af toksicitet fra injicerede midler. Tilsvarende, hvis værten embryonerne morphants eller RNA-indsprøjtning og ofte dør, så mængden af morpholino-eller RNA skal reduceres. For at løse disse problemer, titreres den indsprøjtede RNA eller morpholino og bestemme en sikker beløb for vellykkede ansigt transplantationer. Endelig kan øge saltkoncentrationen MBS opløsning ovenfor 0.1x også hjælpe heling.
Betydning: Den ansigt transplantation beskrevne teknik muliggør analyse af de lokale krav og aktiviteten af genprodukter under kraniofaciale udvikling. Denne fremgangsmåde kan afklare signaling mellem udviklingslandene noncrest, neurale våbenskjold, og de omkringliggende strukturer. Det tillader en at undersøge LOF eller GOF (ved hjælp af en strategi) i alle EAD-afledte væv, hvilket ikke er muligt med en enkelt promotordrevet konstruktion. Selv om der er en lang tradition for vævstransplantation i udviklingsmæssige biologi dette er den første anvendelse af transplantation til studiet af kraniofaciale udvikling i frøer og er afgørende for mekanistiske undersøgelser 7. Således teknik kan hjælpe til at opklare de komplekse mekanismer, der kontrollerer mønsterdannelse og dannelse af hvirveldyr ansigt og for at afklare årsagerne kraniofaciale udviklingsmæssige defekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Radek Sindelka for hans hjælp, og Cas Bresilla for at bistå med frø dyrehold og forberedelse foster. Dette arbejde blev finansieret af NIH via tilskud R01DE021109 til HLS Laura Jacox blev finansieret af Herschel Smith Graduate Fellowship på Harvard University og en F30 individuel stipendium F30DE022989-01 gennem NIDCR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pasteur pipette | VWR | 14672-400 | Lime Glass |
| Size 5 3/4 in | Cotton Plugged | ||
| Graduated Transfer Pipette | VWR | 16001-180 | Disposable |
| #5/45 forceps | Fine Science Tools by Dupont medical | 11251-35 | Angled 45° |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-20 | Straight; serrated tip; stainless steel |
| Capillary Tubing (for needles) | FHC | 30-30-1 | Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID/Fiber |
| Cover slip | VWR | 48393 252 | 24 x 60 mm micro cover glass; |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 | |
| Needle Puller | Sutter Instrument Co | Needle Puller: discontinued Filament: FB300B | The most similar, currently available needle puller is the P-97. For filaments, use Sutter 3.00 mm square box filaments, 3.0 mm wide. |
| Model P-80 | Flaming / Brown micropipette puller | ||
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Stereomicroscope Lighting by Fostec | Fostec | Use a light box with 2 fiberoptic arms. | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | Jaw Opening Diameter: 0-1 mm |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Jaw opening Diameter: 0-1 mm |
| Tungsten Needles | Fine Science Tools | 10130-05 | 0.125 mm Rod diameter |
| Van Aken Plastalina | Blick | #33268-2981 | |
| Modeling Clay- white, red, or yellow | |||
| mMessage mMashine SP6 or T7 Kit | Ambion | AM1340 |
References
- Gorlin, R. J., Cohen, M., Levin, L. Syndromes of the head and neck. , Oxford University Press. UK. (1990).
- Trainor, P. Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention. Am. J. Med. Gen. A. 152, 2984-2994 (2010).
- Dickinson, A. J., Sive, H. L. Development of the primary mouth in Xenopus laevis. Dev. Bio. 295, 700-713 (2006).
- Dickinson, A. J., Sive, H. L. Positioning the extreme anterior in Xenopus: cement gland, primary mouth and anterior pituitary. Sem. Cell Dev. Bio. 18, 525-533 (2007).
- Dickinson, A. J., Sive, H. L. The Wnt antagonists Frzb-1 and Crescent locally regulate basement membrane dissolution in the developing primary mouth. Dev. 136, 1071-1081 (2009).
- Gilbert, S. F. Developmental Biology. , Sinauer Associates, Inc. Sunderland, MA. (2010).
- Borchers, A., Epperlein, H. H., Wedlich, D. An assay system to study migratory behavior of cranial neural crest cells in Xenopus. Dev. Genes Evol. 210, 217-222 (2000).
- Grunz, H. Homoiogenetic neural inducing activity of the presumptive neural plate of Xenopus laevis. Dev. Growth Differ. 32, 583-589 (1990).
- Servetnick, M., Grainger, R. M. Changes in neural and lens competence in Xenopus ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer. Dev. Bio. 112, 177-188 (1991).
- Servetnick, M., Grainger, R. M. Homeogenetic neural induction in Xenopus. Dev. Bio. 147, 73-82 (1991).
- Couly, G., Coltey, P., Le Douarin, N. The triple origin of skull in higher vertebrates: a study in quail-chick chimeras. Dev. 117, 409-429 (1993).
- Couly, G. F., Le Douarin, N. M. Mapping of the early neural primordium in quail-chick chimeras : I. Developmental relationships between placodes, facial ectoderm. 110, 422-439 (1985).
- Couly, G. F., Le Douarin, N. M. Mapping of the early neural primordium in quail-chick chimeras II. The prosencephalic neural plate and neural folds: Implications for the genesis of cephalic human congenital abnormalities. Dev. Bio. 120, 198-214 (1987).
- Lievre, A. L., Le Douarin, N. The early development of cranial sensory ganglia and the potentialities of their component cells studied in quail-chick chimeras. Dev. Bio. 94, 291-310 (1982).
- Kennedy, A., Dickinson, A. Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes. Dev. Bio. 365, 229-240 (2012).
- Trainor, P., Tam, P. Cranial paraxial mesoderm and neural crest of the mouse embryo- codistribution in the craniofacial mesenchyme but distinct segregation in the branchial arches. Dev. 121, 2569-2582 (1995).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
- Tandon, P., Showell, C., Christine, K., Conlon, F. Morpholino injection in Xenopus. Methods Mol. Biol. 843, 29-46 (2012).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , Garland Publishing. New York. (1994).
