Summary
Une technique de transplantation de "Extreme antérieur domaine" mouchoirs entre les embryons de Xenopus laevis a été développé. Tissu peut être déplacé d'un gène expression fond dans un autre, ce qui permet l'étude des besoins locaux pour le développement cranio-facial et d'interactions entre les régions du visage de signalisation.
Abstract
Malformations congénitales cranio-faciales se produisent dans 1 sur chaque 700 naissances vivantes, mais l'étiologie est rarement connus en raison de la compréhension limitée de développement cranio-facial. Pour déterminer où les voies de signalisation et les tissus agissent pendant la structuration de la face en développement, une technique «visage de transplantation» a été développé dans les embryons de la grenouille Xenopus laevis. Une région de tissu facial présomptif (le «extrême antérieure de domaine" (EAD)) est retiré d'un embryon donneur à l'étape du bourgeon caudal, et transplanté dans un embryon hôte de la même scène, à partir de laquelle la région équivalente a été éliminée. Ceci peut être utilisé pour générer une face chimérique où le tissu de l'hôte ou d'un donneur a subi une perte ou gain de fonction dans un gène, et / ou comprend une étiquette de lignage. Après la guérison, le résultat du développement est surveillé, et indique les rôles de la voie de signalisation dans le donateur ou tissus de l'hôte environnantes. Xenopus est un modèle précieux pour le développement de visage, comme la région du visage est large et facilement unccessible pour la micromanipulation. De nombreux embryons peuvent être analysés, sur une courte période de temps puisque le développement se fait rapidement. Les conclusions de la grenouille sont pertinents pour le développement humain, car les processus cranio-faciales semblent conservés entre Xenopus et les mammifères.
Introduction
Pour comprendre les mécanismes sous-jacents des défauts cranio-faciales congénitales 1-2, tissus importants et leurs contributions de signalisation au cours du développement cranio-facial doit être identifié. Dans la grenouille Xenopus laevis, une partie du visage, y compris la bouche et les narines forme de la "Extreme antérieure de domaine" (EAD), où l'ectoderme et l'endoderme sont directement juxtaposés 3-4. L'EAD agit également comme un centre de signalisation pour influencer les tissus environnants, y compris la crête neurale crânienne, qui forme des mâchoires et d'autres régions du visage 5. Pour identifier les gènes qui contribuent à la fonction de l'EAD, une technique «visage de transplantation» a été développé, où le tissu est transplanté d'un donneur dans un embryon hôte, après le retrait de la région d'hôte correspondant. Après la greffe, ce qui entraîne le développement du visage est évaluée. Ainsi, les effets de la perte de fonction (LOF) ou gain de fonction (GOF) pour un gène spécifique dans la EAD sont analysées localement, où le reste de l'hLire et corps est composé de tissus de type sauvage. La transplantation réciproque peut être effectuée, où le type sauvage tissu est transplanté dans des embryons avec LOF mondiale ou GOF dans les gènes spécifiques. Transplantation a été fréquemment utilisé dans Xenopus et étudie poussin 6. Par exemple, la transplantation de Xenopus a traité homogenetic induction neurale, la lentille et de la compétence de neurones, et la migration de la crête neurale 7-10. Caille-poulet greffe chimère a analysé le développement de la plaque neurale antérieure, crête neurale antérieure, la crête neurale, et les os crâniens 11-14. C'est la première technique de greffe pour l'étude du développement cranio-facial chez Xenopus. Cette technique a démontré un nouveau rôle pour les inhibiteurs de Wnt Frzb1 et du Croissant dans la régulation de la formation de la membrane basale dans la bouche présomptif 5. Xenopus laevis est un modèle idéal pour l'étude du développement cranio-facial que les embryons sont grandes, développer l'extérieur, une le visage est bien visible, ce qui permet la micromanipulation et de l'imagerie de développement. Mécanismes sous-jacents du développement du visage semblent conservés, ce qui indique que les constatations faites dans la grenouille permettent de mieux comprendre le développement humain 4,15-16.
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Protocol
Une. Réactifs Préparation
- 10x MBS: Préparer 1 L de 10x modification Saline de Barth (MBS) de la solution 17. Reportez-vous au tableau 1, les réactifs, les ingrédients et les instructions. Utilisez de l'eau distillée pour toutes les solutions. Mélanger dans un bol, à l'aide d'une barre d'agitation, jusqu'à complète dissolution. Toutes les solutions doivent être effectuées à température ambiante.
- 1x MBS: Diluer 100 ml de solution 10x MBS dans 900 ml d'eau distillée pour obtenir 1 L de 1x MBS. Ajouter 0,7 ml de solution M CaCl 2 1.
- 0,1 x MBS: Diluer 1x MBS pour préparer 1 L de solution 0.5x MBS et 2 L de 0,1 x MBS solution. Pour 1 L de 0,1 x MBS solution, ajouter 1 ml de 10 mg / ml solution de gentamicine. La solution de MBS de 0,1 x la gentamicine sera utilisé pour la culture d'embryons à long terme.
- Ficoll / MBS: Ajouter 15 g de Ficoll 400 à 500 ml d'une solution 0,5 x MBS. Mélanger vigoureusement. Ajouter une barre d'agitation et mélanger jusqu'à dissolution complète du Ficoll (plusieurs heures).
- 70% d'éthanol: Diluer à 100% d'éthanol à 70% d'éthanol à l'aidede l'eau distillée.
2. Préparation de verre Outils d'exploitation
- préparation de l'aiguille: Charge tube capillaire dans un extracteur d'aiguilles.
- Tirez les aiguilles selon les paramètres indiqués dans le tableau 2: les paramètres de traction aiguilles. Les réglages sont pour une micropipette extracteur Sutter Instrument Co. Modèle P-80/PC et tubes capillaires, comme décrit dans le tableau de réactifs et d'équipements spécifiques. Cependant, ces paramètres sont spécifiques à l'aiguille extracteur Sutter, et devront être ajustés pour les autres machines. Les paramètres peuvent être déterminées en utilisant un test de rampe, comme spécifié par le fabricant de la machine.
- Tirer 4-6 aiguilles en vue de la procédure. Les aiguilles doivent être répartis de telle sorte que la partie flexible, les cheveux en forme de l'embout de verre est complètement retiré, ce qui est typiquement de 2 à 3 mm de long. La pointe doit être relativement rigide, mais tout de même suffisamment étroit pour être utilisé comme un outil de coupe. Voir photo d'une aiguille idéal à la figure 1A. Stocker les aiguilles dans une boîte de Pétri avec une bande de terre le long du centre. Appuyez sur l'arbre de chaque aiguille dans l'argile, pour le maintenir en place et de tenir le bout pointu fragile loin du fond et les côtés.
- Pour les outils supplémentaires, obtenir une couverture lames de verre, une paire de longues pinces standards de modèle, d'un bec Bunsen, et 3-4 pipettes Pasteur en verre (taille 5 ¾ po).
- outil Pipette: Pour faire un outil de pipette, allumer le brûleur Bunsen et placer la pointe d'une pipette Pasteur en verre dans la partie bleue de la flamme tout en le tournant, de telle sorte que la pointe fond et complètement le trou joints, formant une, extrémité fermée arrondie . Le arrondie, pointe scellée est ensuite utilisé pour faire des dépressions dans le plat en argile qui contient les embryons pendant l'opération. Voir la figure 1B.
- ponts en verre: Pour faire des ponts en verre, utiliser des pinces de modèle à long standard pour rompre avec précaution 3 mm par 3 mm des morceaux de verre lamelle. Tout en maintenant le morceau de lamelle avec tweezers, placer le verre dans la flamme jusqu'à ce que tous les quatre bords et adoucir la courbe vers le bas, formant un dôme de verre minuscule. Les bords ne doivent plus être pointu. Voir la figure 1C.
- Conserver les ponts de glissement de couverture de verre en les insérant, bords vers le bas, en pâte à modeler, recouvrant le fond d'une boîte de Pétri. Insérer les ponts de telle sorte que la partie supérieure du pont reste au-dessus de la surface de l'argile. Ne poussez pas trop dur de sorte que les ruptures de pont, et ne pas intégrer totalement le pont dans l'argile, parce qu'il peut être difficile à enlever. Après la stérilisation à la flamme ou à l'éthanol 70%, les ponts peuvent être réutilisées d'une expérience à.
3. Préparation de l'opération d'embryons
- Tapisser un petit 60 mm boîte de Petri en plastique de pâte à modeler. Entre deux utilisations, la surface de la boîte et de l'argile est soigneusement lavé avec de l'eau distillée, puis avec 70% d'éthanol.
REMARQUE: Utilisez le rouge, blanc ou jaune, Van Aken Plastalina pâte à modeler, qui peut être acheté à un localy ou magasin d'art. Argile noire n'est pas recommandé, car il libère un résidu. - Remplissez le plat avec 3% de solution de Ficoll 0.5x MBS. La concentration en sel plus élevée empêche la dissociation du tissu, et le Ficoll polysaccharide permet d'épaissir la solution, ce qui contribue à la face de fixation en position.
- Utilisez l'outil de pipette Pasteur flambé (voir la figure 1) de faire peu profondes, 2-3 mm dépressions dans l'argile, de la profondeur d'un corps stade 20 de l'embryon. Assurez 20-30 dépressions, 1-2 mm, de chaque côté de la boîte, il ya donc un total de 40-60 dépressions. Étiqueter un côté LOF / GOF, et l'autre de type sauvage de côté, par la sculpture initiales dans l'argile avec une pince.
4. Préparation Preoperation d'embryons
- Obtenir et de la culture de Xenopus laevis embryons utilisant des méthodes standards 17. Pour une description détaillée de la grenouille élevage, s'il vous plaît voir Sive et al. 17
- Quarante-huit heures avant l'expérimentation bénéficier du droit d'dans les œufs de grenouilles femelles et effectuer la fécondation in vitro.
- Injecter 0,5-1 ng de membrane coiffé GFP ARNm, ainsi que toute l'ARNm désiré ou anti-sens oligonucléotides antisens morpholino modifié ("Morpholinos») au stade d'une cellule ou dans deux cellules au stade 2 cellules. L'un stade cellulaire dure environ 70-90 min. Injecter un volume total de 1-3 nl. A la place de l'ARN codant pour une protéine fluorescente (GFP tel que l'ARN ou DP), on peut injecter FITC dextran marqué ou morpholino marqué par fluorescence. La fluorescence est important pour déterminer si la transplantation de tissus et guérit reste dans la tête.
- Plafonné de l'ARNm peut être préparé à partir d'un plasmide linéarisé à l'aide d'un SP6 mMessage mMachine ou kit T7. Morpholinos peut être conçu et commandé par Gene Tools LLC. La quantité de morpholino requise pour un effet désiré doit être déterminée pour chaque gène 18.
- Stocker les embryons injectés à 15 ° C pendant 48 heures, jusqu'à ce qu'ils atteignent le stade 19-20. (Fou toutes les étapes ultérieures, des embryons de stade selon la table normale de Xenopus laevis par Nieuwkoop et Faber 19.)
NOTE: Le jour de la chirurgie, les deux embryons donateurs et bénéficiaires doivent être dans un stade de l'autre pour les greffes de travailler de manière optimale. Cependant, les embryons injectés avec morpholinos ("morphants») développent parfois plus lentement que le type sauvage ou contrôlent embryons morphant, ce qui rend nécessaire de coordonner les expériences afin que les deux morphant et embryons de type sauvage sont au même stade. Peuvent avoir besoin d'être maintenue à une température plus élevée pendant 12 à 24 heures avant la procédure morphants. Pour augmenter la probabilité que les embryons peuvent être trouvés à des stades correspondants, les embryons peuvent être maintenus à différentes températures. Vingt-quatre heures avant l'expérience, il faut diviser les embryons dans une plusieurs plats, et placer morphants à 18-20 ° C et les embryons de type sauvage à 15-18 ° C.
- Le jour de l'expérience de transplantation, remOve les embryons de the15 ° C incubateur et organiser eux selon Nieuwkoop et Faber 19. Si elles sont plus jeunes que la fin neurula (étape 19), les laisser à température ambiante pendant 1-2 heures, jusqu'à ce qu'ils atteignent le stade 19.
- Tamiser les embryons injectés sous un microscope à fluorescence. Sélectionner des embryons qui montrent uniforme, vive fluorescence pour l'expérience.
- Supprimer l'encombrement et les contaminants possibles à proximité de la zone d'exploitation. Essuyez la surface d'exploitation, stéréoscopique et tous les outils avec 70% d'éthanol.
- Une fois que les embryons sont au stade 19, retirer la membrane vitelline utilisant # 5/45 pince Dumont sous un stéréomicroscope.
- Retirer la membrane vitelline de 20 à 30 de chacun des donneurs et des embryons hôtes.
- Pour les premières expériences de transplantation de visage, il faut pratiquer avec quelques embryons pour chaque condition. La méthode est difficile et exige de la pratique prudent avant il peut être utilisé sur une plus grande échelle, rapidement et avec succès. On peut u travailp pour faire 20 greffes / expérience.
- Déplacer embryons hôtes dans le plat de fonctionnement en utilisant une pipette de transfert en plastique gradué avec l'extrémité coupée de telle sorte que l'ouverture est bien plus large que l'embryon (au moins quelques millimètres). Soyez prudent pour éviter de toucher les embryons de bulles ou de la surface de l'eau, comme les embryons vont exploser dans la tension de surface.
- Utilisation # 5/45 une pince pour insérer les embryons dans les creux en argile, avec la partie postérieure de l'embryon dans l'argile. Fermez doucement l'argile autour des bases de l'embryon à l'aide des pinces, laissant le quart supérieur de l'embryon, la tête, dépassant de la dépression.
- Une fois que tous les embryons hôtes sont fixées dans leurs renfoncements, se déplacer vers l'autre côté de la plaque et commence à insérer les embryons donneurs dans leurs cavités. Répétez le processus de fixation des embryons dans leurs puits.
5. Exécution de la chirurgie de greffe de visage
- Couteau de coupe: En tant que lame de coupe pour l'enlèvementdu tissu EAD donateurs, utiliser une aiguille capillaire de verre brisé de manière appropriée (voir l'étape 2.3 et la figure 1).
NOTE: On peut détenir directement le capillaire entre les doigts (ce qui fonctionne bien pour les personnes ayant de petites mains) ou l'on peut monter l'aiguille dans un porte-broche insecte. Des aiguilles de tungstène Electrosharpened 17 chargés dans un support de broche peuvent être utilisés à la place d'une aiguille de tube capillaire. S'il vous plaît voir supports de quilles proposées et les aiguilles de tungstène dans le tableau des réactifs et des équipements spécifiques. - Sous un microscope stéréoscopique, insérer l'aiguille dans la tête de l'embryon à la gauche de la glande de ciment. L'aiguille doit être insérée en profondeur, de sorte qu'il passe à l'extérieur à partir de l'embryon, à travers la tête, et dans l'intestin antérieur. Pour transplanter l'ensemble EAD, coupes devraient s'étendre à l'extérieur de l'embryon à l'intestin antérieur. Pour les transplantations de l'ectoderme seule, coupes devraient être moins profonde et étendre seulement par l'ectoderme.
- Flick l'aiguille à partir de la gauche à la droite de l'diriger, sur toute la largeur de la glande de ciment. La pichenette est important que le mouvement donne une coupe nette. Reportez-vous à la figure 2A pour un résumé de la technique et la figure 2B pour une démonstration des réductions. La glande de ciment et les yeux sont des repères importants pour les coupes. L'ordre des coupes n'affecte pas le résultat et peut varier en fonction de la préférence ou l'impartialité de l'utilisateur.
- Placer l'aiguille au début de la coupe précédente, à la frontière gauche de la glande de ciment, et actionner le pointeau vers le haut jusqu'à ce qu'il atteigne le fond de l'oeil gauche. Ceci créera une coupe verticale de la bordure gauche de la glande de ciment vers le bas de l'oeil gauche.
- Placer l'aiguille à la frontière droite de la glande de ciment, et actionner le pointeau vers le haut jusqu'à ce qu'il atteigne le fond de l'oeil droit. Ceci créera une coupe verticale de la bordure droite de la glande de ciment vers le bas de l'oeil droit.
- Pour exciser complètement le tissu, flick l'aiguille à partir du fond de l'oeil gauche de la partie inférieure de l'oeil droit, la création d'une coupure horizontale qui va libérer le tissu. Coupes peuvent s'étendre à l'extérieur de l'embryon à l'intestin antérieur, y compris à la fois l'ectoderme et l'endoderme dans l'expiant EAD. Sinon, des coupes peu profondes peuvent être utilisés pour ectoderme uniquement greffes EAD. Une fois que le tissu est enlevé EAD, il devrait y avoir un trou rectangulaire de l'extérieur de l'embryon dans l'intestin antérieur, qui s'étend à partir de la glande de ciment à juste au-dessous des yeux (de haut en bas). Le trou devrait s'étendre de la frontière à l'intérieur de l'œil gauche à la frontière à l'intérieur de l'œil droit (côté à l'autre). Voir la figure 2Bb.
- Poussez délicatement le tissu excisé à la pointe de l'aiguille, et soulever à travers le tampon de la partie de la boîte contenant les embryons d'accueil. Ne pas exposer le tissu à l'air à la surface ou il sera endommagé.
- Exciser le même tissu à partir de l'embryon hôte, comme pour le donneur. Jeter l'expiant EAD hôte ou l'enregistrer sur insertiont dans la face des bailleurs de fonds, pour les transplantations réciproques.
- Insérez le explantation des bailleurs de fonds dans le trou de l'hôte résultant en utilisant # 5/45 forceps.
- Une fois le tissu du donneur est correctement positionné et bien insérée, placer soigneusement un pont de verre (voir la figure 1 et la figure 2bc) sur le visage de l'embryon de tenir la greffe en place. Les extrémités du pont doivent insérer dans l'argile, le maintenant en place. Le pont devrait appliquer doucement pression sur le tissu transplanté, tels que la greffe se trouve au ras de la tête de l'hôte, sans coller sur la tête ou se trouvant au fond de la tête. La tête peut être légèrement aplatie par la lamelle, mais attention de ne pas endommager l'embryon avec trop de pression. Greffes doivent être effectués dans les 5 minutes.
REMARQUE: Un enquêteur expérimenté peut effectuer une vingtaine de greffes par expérience, plus de 2-3 heures. Pendant cette période, les embryons vont progresser du stade 20-22. Fin de la greffe du visages à l'étape 21 ou 22 n'affecte pas les résultats. Greffes plus tard (aux stades 22-26) peuvent être faites mais sont plus difficiles que la région médiane EAD libre-crête est restreinte comme mouvements de la crête neurale crânienne dans le visage. Cohérence entre les greffes est critique.
6. Greffe du visage de récupération post-opération
- La guérison prend généralement 2-3 heures. Laissez les embryons à la température ambiante sans être dérangés dans leurs dépressions d'argile avec les ponts de verre tenant le tissu du donneur en place.
- Une fois les greffes ont guéri, retirer soigneusement les ponts en verre, enlever l'argile autour de la base des embryons aide de pinces, et d'utiliser un plastique diplômé pipette de transfert pour aspirer délicatement les embryons de leurs dépressions.
- Mettez les embryons dans une boîte de Petri étiquetés de manière appropriée, à moitié rempli d'MBS 0.1x propres gentamicine.
- Cultiver les embryons à 15 ° C ou 18 ° C pendant plusieurs jours jusqu'à ce qu'ils atteignent l'alimentation stade de têtard à l'étape 40, wpoule phénotypes faciaux peuvent être marqués.
- La solution de MBS de 0,1 x la gentamicine doit être changé tous les jours, et les embryons morts doivent être retirés rapidement pour éviter la contamination et de la mort d'autres embryons.
- La bouche s'ouvre à l'étape 40. Au stade 40-41, il faut vérifier que le tissu transplanté reste guérie à la place en regardant sa fluorescence. Greffes de temps en temps tomber, donc il faut veiller à ce que tous les embryons marqués ont le tissu du donneur en place.
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Representative Results
Tissu transplanté doit être complètement insérée dans la tête de l'hôte après transplantation, comme indiqué sur la figure 3A, et avoir un pont de verre placée de façon appropriée sur le visage de l'embryon, comme le montre la Figure 2bc. Le tissu du donneur transplanté doit être correctement dimensionné pour l'ouverture de l'hôte, pour la transplantation, pour réussir. Le tissu EAD ne doit pas dépasser de la tête, en aucune façon, comme on le voit sur les figures 3B et 3C. De plus, la greffe du visage ne doit pas être tourné par rapport à sa position dans le corps du donneur, comme le montre la Figure 3D. Après plusieurs heures, le tissu greffé et le visage environnante devraient guérir, et le lendemain, l'embryon doit apparaître comme l'exemple représenté sur les figures 4A et 4A. On peut observer, en fluorescence, que la greffe reste en place dans la figure 4B. A l'étape 41, le tissu de contrôle transplantés contribute à la bouche, et restera fluorescente verte, vu sur la figure 4B. Tissu EAD de type sauvage transplanté dans des hôtes de type sauvage devrait donner lieu à des visages normaux, par rapport aux non perturbés embryons de type sauvage. Cependant, avec le tissu du donneur LOF ou GOF, visages devrait guérir et rester dans la tête, mais ceux-ci peuvent ou ne peuvent pas donner lieu à des structures cranio-faciales normales, comme le montre la figure 3 de Dickinson et Sive 5.
| Réactif | Ingrédients | Instructions |
| 1 M de CaCl2 Solution | 111 g de CaCl2 par litre, | Autoclave et magasin en aliquotes de 1 ml à -20 ° C ou 4 |
| 10x modification Saline (MBS) de la solution de Barth | 880 mM de NaCl, 51,4 g | Réglez le volume à 1 L avec de l'eau distillée. Ajuster le pH final à 7,8 avec du NaOH etalors l'autoclave. |
| 10 mM de KCl, 745,5 mg | ||
| MM MgSO 4 10, 1,2 g | ||
| HEPES 50 mM (pH 7,8), 11,9 g | ||
| 25 mM NaHCO 3, 2,1 g | ||
| 1x MBS Solution | Les concentrations finales: | Préparer la solution MBS 1x en mélangeant 100 ml de 10x sels MBS solution avec 0,7 ml de CaCl2 1 M solution. Réglez le volume à 1 L avec de l'eau distillée. Diluer cette solution pour faire MBS 0.5x et 0.1x MBS. |
| 88 mM de NaCl, | ||
| 1 mM KCl | ||
| MM CaCl 2 0,7 | ||
| 1 mM de MgSO 4, | ||
| HEPES 5 (pH 7,8) | ||
| MM NaHCO 3 2,5 |
Tableau 1. Réactifs, les ingrédients et les instructions.
| Chaleur | Tirer | Vel. | Temps |
| 800 | 70 | 40 | 50 |
Tableau 2. Paramètres Puller aiguille *.
* Les paramètres aiguille de traction varient de machine à machine de sorte que chaque laboratoire devra probablement optimiser leurs propres paramètres aiguille de traction.
Figure 1. Outils utilisés. A) montre, une aiguille intacte intacte et une aiguille brisée après la pointe flexible a été supprimé. B) dépeint deux outils de pipettes avec leurs extrémités parfaitement étanches et arrondis. C) affiche trois ponts en verre de l'échantillon. Barres d'échelle = 1,000 mm.
.. Figure 2 Synthèse de la méthode de greffe du visage A) Transplant Schéma général:.. Schématique de la méthode de greffe d'un visage Les embryons sont injectés avec un agent fluorescent et un oligonucléotide antisens morpholino à l'étape 1 de la cellule. L'agent fluorescent peut être soit GFP ARNm, morpholino FITC-étiqueté, ou le dextran fluorescent. B. Bouche présomptif est retirée à l'étape 22 à partir d'un hôte de type sauvage embryon et un donneur d'embryon morphant. Le tissu transplanté peut également être élargi pour inclure le nez présomptif, qui se trouve au dessus de la région de la bouche. Le tissu morphant donneur est transplanté à l'hôte de type sauvage, et est maintenu en place par un pont de verre. Arc gris: glande éclosion.
Figure 3. Schéma d'embryons peu de temps après la transplantation. Vues frontales sont présentés. Le tissu transplanté est décrit dans les points rouges. A et A 'représentent un résultat idéal à l'étape 22. Le tissu est complètement inséré et correctement positionné dans la tête. B et B 'montrent une greffe incorrecte, avec le tissu partiellement insérée dans la tête C. C et' show une transplantation incorrecte avec la plupart des tissus inséré dans la tête, mais le excès région est en saillie à partir du site de la cicatrisation. Ce tissu se nécroser, et inhiber la guérison des régions environnantes, bien insérées. D et D 'un spectacle de transplantation mauvaise, où le visage a été tourné dans l'hôte, par rapport à sa position dans le donneur. Le tquestion va guérir dans la tête, mais le visage ne se développera pas normalement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Des embryons âgés avec des résultats idéaux. Vues frontales sont présentés. cg: glande de ciment; mo:.. bouche A) Affiche un embryon un jour après la transplantation, montrant une greffe guéri correctement à l'étape 32 A ') montre ce même embryon avec un recouvrement fluorescent, confirmant que le tissu transplanté reste en place B. ) montre le même embryon au stade 42 qui avait un morpholino de contrôle, la GFP + greffe plusieurs jours avant. Le visage a bien développé. B ')Indique le même embryon avec un recouvrement fluorescent, confirmant que le tissu transplanté reste dans la tête et a contribué normalement aux structures du visage. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Étapes critiques et les limites: La procédure de greffe du visage EAD est temps et un travail intensif. Il exige de la pratique, les mains stables, et la dextérité pour se perfectionner. Le protocole de greffe de la face repose sur la capacité des chercheurs à éliminer efficacement et le tissu de greffe. Si l'on prend trop de temps pour insérer la greffe dans le visage de l'hôte, le visage de l'hôte va commencer à se contracter et à guérir. Pinces peuvent être utilisés pour étendre délicatement la région faciale. Toutefois, si la plaie importante contraction a eu lieu, la greffe ne guérira pas aussi bien et peut-être besoin d'être réduite en taille pour s'adapter dans le trou du visage de l'hôte. La taille et la forme de la transplantation doivent correspondre à peu près la taille et la forme de la cavité du visage du destinataire, afin de permettre une insertion réussie.
greffes de visage sont les plus efficaces lorsqu'ils sont effectués entre les étapes 19-22, avec des embryons qui sont appariés par étape. Âgés greffes de visage, entre les étapes 22 à 26, sont possibles, mais sont plus difficiles und peut perturber la migration de la crête neurale dans les côtés du visage depuis la région médiane libre de crête devient beaucoup plus étroite de l'étape 22-26.
Tant le receveur et le donneur doit être au même stade de la greffe de travailler de manière optimale. Idéalement, ils devraient être la même scène, et ont très peu d'être à quelques heures d'intervalle. Embryons injectés avec des oligonucléotides ARN antisens morpholino ("morphants») développent parfois plus lentement que le type sauvage ou contrôlent embryons morphant, exigeant que morphants être cultivées à une température supérieure à correspondre aux stades les embryons de type sauvage de.
Le tissu de la surface de donneur ne doit pas être mis en rotation dans le corps de l'hôte par rapport à sa position d'origine dans l'embryon de donneur, sinon le visage ne se développera pas normalement. La glande de ciment n'a pas besoin d'être inclus dans la greffe de visage pour la procédure fonctionne, le visage se développe normalement sans elle. Cependant, la glande de ciment est souvent inclus dans til disparu mouchoirs, car il sert de marqueur pour indiquer distinct et placer le bas de la greffe. Ce marqueur permettra d'éviter accidentellement tourner le tissu pendant le transfert du tissu visage au destinataire. Si la greffe a été insérée de manière incorrecte dans le visage de l'hôte, le tissu du donneur peut être enlevé et jeté. On peut essayer d'insérer une nouvelle transplantation dans le même hôte, si l'ouverture n'a pas encore commencé à se contracter. Cependant, si l'ouverture de l'hôte a sensiblement diminué, puis jetez l'hôte et recommencer.
Il est essentiel de placer le pont de verre directement sur le visage transplanté, de sorte que la greffe est tenu à la tête de l'hôte lors de la cicatrisation. Si la greffe n'est pas maintenu en place, la greffe peut être extrudé sur le visage de l'hôte. Greffes qui ne sont pas entièrement insérée dans le visage ou qui apparaissent pendant la guérison feront l'objet d'une nécrose. Même dans les greffes parfaites, de petites quantités de la mort des tissus peuvent se produire sur les bords of la transplantation. Habituellement, cela ne provoque pas d'effets indésirables et un visage tout à fait normal peut encore être formé. Dans les contrôles réussis, nous n'avons pas observé de malformation après quatre semaines de développement suggèrent que les cartilages formés normalement et que le rejet du tissu est rare.
Enfin, si un morpholino perturbe une protéine nécessaire à une cicatrisation normale, cette technique ne fonctionne pas, que le tissu transplanté LOF peut pas être intégré dans la tête de l'hôte.
Modifications possibles et Dépannage: modifications peuvent être apportées à la procédure. Avec la pratique, le chercheur peut apprendre à transplanter des régions plus petites, par exemple, la moitié de l'EAD. Incisions peu profondes permettent greffes ectodermiques, laissant l'endoderme profondément dérangé. D'autres régions du tissu embryonnaire peuvent être transplantés, en utilisant des approches similaires.
Si le tissu transplanté meurt après l'insertion, il ya un couple de ples causes POSSIBLES. Tissu transplanté qui n'est pas complètement insérée dans l'hôte ou tenue appropriée en place d'un pont de verre, va mourir et empêcher une bonne cicatrisation. Veillez à insérer complètement le tissu transplanté et le fixer en place avec un pont de verre. Si la greffe est dérivé d'un donneur morpholino ou ARN injecté, puis le tissu risque de mourir en raison de la toxicité des agents injectés. De même, si les embryons hôtes sont morphants ou ARN injecté et meurent souvent, puis la quantité d'ARN ou morpholino devra être réduite. Pour résoudre ces problèmes, titrer la quantité d'ARN ou morpholino injecté et déterminer une quantité sûre pour les greffes de visage succès. Enfin, l'augmentation de la concentration en sel de la solution au-dessus de 0,1 x MBS peut aussi aider la guérison.
Signification: La technique de greffe de visage décrit permet l'analyse des besoins locaux et de l'activité de produits de gènes au cours du développement cranio-facial. Cette approche peut préciser signaling entre le noncrest développement, la crête neurale, et les structures environnantes. Il permet d'examiner LOF ou GOF (en utilisant une stratégie) dans tous les tissus EAD dérivés, ce qui n'est pas possible avec n'importe quel promoteur entraîné construction unique. Bien qu'il y ait une longue histoire de la greffe de tissus en biologie du développement, c'est la première application de la transplantation à l'étude du développement cranio-facial chez les grenouilles et est cruciale pour des études mécanistiques 7. Ainsi, la technique peut aider à élucider les mécanismes complexes qui contrôlent la structuration et la formation de la face de vertébrés et de clarifier les causes de défauts de développement cranio-faciales.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous remercions Radek Šindelka pour son aide, et Cas Bresilla pour aider avec la grenouille élevage et la préparation de l'embryon. Ce travail a été financé par le NIH via le R01DE021109 de subvention à HLS Laura Jacox a été financé par le Herschel Smith bourse d'études supérieures à l'Université de Harvard et une subvention F30 bourse individuelle F30DE022989-01 à la NIDCR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pasteur pipette | VWR | 14672-400 | Lime Glass |
| Size 5 3/4 in | Cotton Plugged | ||
| Graduated Transfer Pipette | VWR | 16001-180 | Disposable |
| #5/45 forceps | Fine Science Tools by Dupont medical | 11251-35 | Angled 45° |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-20 | Straight; serrated tip; stainless steel |
| Capillary Tubing (for needles) | FHC | 30-30-1 | Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID/Fiber |
| Cover slip | VWR | 48393 252 | 24 x 60 mm micro cover glass; |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 | |
| Needle Puller | Sutter Instrument Co | Needle Puller: discontinued Filament: FB300B | The most similar, currently available needle puller is the P-97. For filaments, use Sutter 3.00 mm square box filaments, 3.0 mm wide. |
| Model P-80 | Flaming / Brown micropipette puller | ||
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Stereomicroscope Lighting by Fostec | Fostec | Use a light box with 2 fiberoptic arms. | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | Jaw Opening Diameter: 0-1 mm |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Jaw opening Diameter: 0-1 mm |
| Tungsten Needles | Fine Science Tools | 10130-05 | 0.125 mm Rod diameter |
| Van Aken Plastalina | Blick | #33268-2981 | |
| Modeling Clay- white, red, or yellow | |||
| mMessage mMashine SP6 or T7 Kit | Ambion | AM1340 |
References
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