Summary
Eine Technik zum Trans "Extreme Anterior Domain" Gesichtsgewebe zwischen Xenopus laevis-Embryonen entwickelt. Tissue kann von einem Gen-Expression Hintergrund in eine andere verschoben werden, so dass die Untersuchung der lokalen Anforderungen für kraniofaziale Entwicklung und zur Signalisierung von Wechselwirkungen zwischen Gesichtsregionen.
Abstract
Craniofacial Geburtsschäden treten in 1 aus jeden 700 Lebendgeburten, aber Ätiologie wird selten aufgrund der begrenzten Verständnis der kraniofazialen Entwicklung bekannt. Um festzustellen, wo Signalwege und Gewebe während der Strukturierung der Entwicklungs Gesicht handeln, hat eine "Gesichtstransplantation"-Technik in Embryonen von dem Frosch Xenopus laevis entwickelt. Eine Region der vermutlichen Gesichtstücher (die "Extreme Anterior Domain" (EAD)) von einem Spender an Schwanzknospen-Embryonen Stufe entfernt und auf eine Wirtsembryo der gleichen Stufe, aus dem die äquivalenten Bereich entfernt wurde transplantiert. Dies kann verwendet werden, um einen chimären Gesicht, wo der Host-oder Spendergewebe hat einen Verlust oder Gewinn von Funktion in einem Gen, und / oder enthält einen Label-Linie zu erzeugen. Nach der Heilung wird das Ergebnis der Entwicklung überwacht und anzeigt Rollen der Signalweg innerhalb des Spenders oder des umgebenden Wirtsgewebe. Xenopus ist ein wertvolles Modell für die Entwicklung Fläche, wie der Gesichtsbereich groß ist und leicht eineccessible für die Mikromanipulation. Viele Embryonen untersucht werden können, die über einen kurzen Zeitraum, da die Entwicklung rasch erfolgt. Ergebnisse in der Frosch sind relevant für die menschliche Entwicklung, da craniofacial Prozesse erscheinen zwischen Xenopus und Säugetieren konserviert.
Introduction
Um Mechanismen bei kraniofazialen Entwicklung zugrunde liegenden Gesichtsschädelfehlbildungen 1-2, wichtige Gewebe und deren Signalbeiträge zu verstehen, müssen identifiziert werden. In dem Frosch Xenopus laevis, Teil des Gesichts, einschließlich der Mund-und Nasenlöcher Form aus der "Extreme Anterior Domain" (EAD), wo Ektoderm und Endoderm direkt nebeneinander 3-4. Der EAD dient auch als Signalzentrum, um das umliegende Gewebe, einschließlich der Schädel Neuralleiste, die die Kiefer und andere Gesichtsbereiche 5 bildet beeinflussen. Um Gene, die EAD-Funktion beitragen zu identifizieren, wurde eine "Gesichtstransplantation"-Technik entwickelt, bei der Gewebe wird von einem Spender in eine Wirts Embryo verpflanzt, nach dem Entfernen der entsprechenden Host-Region. Nach der Transplantation, was Gesichtsentwicklung beurteilt. Somit werden die Auswirkungen der Funktionsverlust (LOF) oder Überfunktion (GOF) für ein spezifisches Gen in der EAD lokal analysiert, wobei der Rest der head und Körper von Wildtyp-Gewebe besteht. Die wechselseitige Transplantation durchgeführt werden kann, in dem Wildtyp-Gewebe wird in Embryonen mit globaler LOF oder GOF in bestimmten Genen transplantiert. Transplantation wurde häufig in Xenopus verwendet und Küken studiert 6. Zum Beispiel hat Xenopus Transplantation homo neurale Induktion, Objektiv und neuronalen Kompetenz und Neuralleiste Migration 7-10 gerichtet. Wachtel-Küken chimären Transplantation hat die Entwicklung der anterioren Neuralplatte vorderen neuronalen Grat, Neuralleiste und Schädelknochen 11-14 analysiert. Dies ist die erste Transplantation Technik für die Untersuchung der Schädelentwicklung in Xenopus. Diese Technik hat eine neue Rolle für den Wnt-Inhibitoren Frzb1 und Halbmond bei der Regulierung der Basalmembran Bildung im Mund mutmaßlichen 5 demonstriert. Xenopus laevis ist ein ideales Modell für die Untersuchung der Schädelentwicklung als Embryonen groß sind, entwickeln extern einnd das Gesicht ist gut sichtbar, so dass die Mikromanipulation und Bild der Entwicklung. Mechanismen, die Gesichtsentwicklung konserviert erscheinen, die anzeigt, dass Ergebnisse in der Frosch machte einen Einblick in die menschliche Entwicklung 4,15-16.
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Protocol
1. Vorbereiten Reagenzien
- 10x MBS: Bereiten 1 l 10x Geändert Barths Saline (MBS)-Lösung 17. Siehe Tabelle 1, Reagenzien Bestandteile und Anweisungen. Verwenden Sie destilliertes Wasser für alle Lösungen. Mischen Sie in einem Becherglas mit einem Rührstab, bis zur vollständigen Auflösung. Alle Lösungen sollten bei Raumtemperatur durchgeführt werden.
- 1x MBS: Verdünnen Sie 100 ml 10x MBS-Lösung in 900 ml destilliertem Wasser auf 1 l 1x MBS zu machen. Hinzufügen von 0,7 ml 1 M CaCl 2-Lösung.
- 0,1 x MBS: 1x verdünnen MBS auf 1 L 0,5 x MBS-Lösung und 2 L 0,1 x MBS-Lösung herzustellen. Um 1 L 0,1 x MBS-Lösung, 1 ml 10 mg / ml Gentamycin-Lösung. Die MBS-Lösung mit 0,1 × Gentamycin wird für langfristige Embryokultur verwendet werden.
- Ficoll / MBS: In 15 g Ficoll 400 bis 500 ml 0,5 x MBS-Lösung. Gründlich mischen. Fügen Sie einen Rührstab und mischen, bis Ficoll vollständig aufgelöst ist (mehrere Stunden).
- 70% Ethanol: Verdünnung 100% Ethanol auf 70% Ethanol mitdestilliertes Wasser.
2. Vorbereiten Glas Betriebs Werkzeuge
- Nadel-Vorbereitung: Last Kapillarrohr in eine Nadel Magnet.
- Ziehen Sie die Nadeln nach den in Tabelle 2 gezeigten Einstellungen: Nadelzieher-Einstellungen. Die Einstellungen sind für eine Sutter Instrument Co. Modell P-80/PC Mikropipette Puller und Kapillar-Schläuche, wie in der Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräte beschrieben. Allerdings sind diese spezifischen Einstellungen der Sutter Nadel Puller, und müssen für andere Maschinen angepasst werden. Die Einstellungen können über eine Rampe Test bestimmt werden, wie von dem Hersteller der Maschine festgelegt.
- Ziehen 4-6 Nadeln in Vorbereitung für das Verfahren. Die Nadeln sollten gebrochen werden, so dass die flexible, haarähnlichen Abschnitt der Glasspitze vollständig entfernt wird, was typischerweise 2-3 mm lang ist. Die Spitze muß relativ starr, aber dennoch schmal genug ist, um als Schneidwerkzeug verwendet werden. Siehe Foto von einem idealen Nadel in 1A. Bewahren Sie die Nadeln in einer Petrischale mit einem Streifen aus Ton in der Mitte. Drücken Sie die Welle jeder Nadel in den Ton, um es in Position zu halten und die fragile scharfe Spitze aus dem Boden und die Seiten halten.
- Für weitere Tools, erhalten Glasplättchen, ein Paar lange Standardmuster Zangen, einem Bunsenbrenner, und 3-4 Glaspasteurpipetten (Größe 5 ¾ in).
- Pipette-Werkzeug: Um eine Pipette-Werkzeug machen, Licht der Bunsenbrenner und legen Sie die Spitze einer Glaspasteurpipette in den blauen Teil der Flamme, während Drehen, so dass die Spitze schmilzt und das Loch vollständig Dichtungen, die einen geschlossenen, abgerundeten Ende . Die abgerundete, versiegelte Spitze wird später verwendet, um Vertiefungen im Tontopf, der die Embryonen während der Operation hält zu machen. Siehe Abbildung 1B.
- Glas-Brücken: Um Glasbrücken zu machen, verwenden lange Standardmuster Pinzette vorsichtig abbrechen 3 mm und 3 mm Stücke von Deckglas Glas. Halten Sie das Stück des Deckglases mit tweezers, legen Sie das Glas in der Flamme, bis alle vier Kanten weicher und die Kurve nach unten und bildet eine kleine Glaskuppel. Die Kanten sollten nicht mehr scharf sein. Siehe Abbildung 1C.
- Bewahren Sie die Deckglas Brücken, indem Sie sie, Kanten nach unten in Modelliermasse, Futter den Boden einer Petrischale. Stecken Sie die Brücken, so dass die Oberseite der Brücke über der Ton-Oberfläche bleibt. Drücken Sie nicht zu hart, so dass die Brücke bricht, und nicht ganz die Brücke in den Ton einbetten, weil es schwer zu entfernen sein. Nach der Sterilisation mit einer Flamme oder 70% Ethanol, können die Brücken aus dem Experiment wiederverwendet, um zu experimentieren.
3. Vorbereitung für den Embryo Betrieb
- Richten einen kleinen 60 mm Kunststoff-Petrischale mit Knetmasse. Zwischen den Anwendungen, die Schale und Ton Oberfläche gründlich mit destilliertem Wasser mit 70% Ethanol gewaschen und dann.
HINWEIS: rot, weiß oder gelb, Van Aken Plastalina Modelliermasse, die in einem lokalen zu kaufen kanny-oder Kunstspeicher. Schwarz-Ton ist nicht zu empfehlen, weil es einen Rückstand Mitteilungen. - Füllen Sie die Schale mit 3% Ficoll 0,5 x MBS-Lösung. Der höhere Salzkonzentration verhindert Gewebedissoziation und das Polysaccharid Ficoll hilft, die Lösung, die in das Gesicht halten in Position unterstützt verdicken.
- Verwenden Sie die geflammt Pasteur-Pipette-Werkzeug (siehe Abbildung 1), um flache, 2-3 mm Vertiefungen im Ton zu machen, über die Tiefe der Bühne 20 Embryo Körper. Machen 20-30 Vertiefungen, 1-2 mm voneinander auf jeder Seite der Schale, so dass es insgesamt 40-60 Vertiefungen. Beschriften einer Seite LOF / GOF, und die andere Seite Wildtyp, durch das Schnitzen Initialen in den Ton mit einer Pinzette.
4. Preoperation Embryo Vorbereitung
- Erhalten und Kultur Xenopus laevis Embryonen mit Standardverfahren 17. Für eine detaillierte Beschreibung der Froschhaltung, finden Sie Sive et al. 17.
- Achtundvierzig Stunden vor dem Experiment obtain Eiern von weiblichen Frösche und durchzuführen, in-vitro-Fertilisation.
- Injizieren 0,5-1 ng Membran verschlossen GFP mRNA sowie beliebige mRNA oder Antisense-Morpholino-modifizierten Antisense-Oligonukleotiden ("Morpholino") an der einen Zellen-Stadium oder in 2-Zellen in 2-Zellen-Stadium. Die eine Zelle Stufe dauert etwa 70-90 min. Spritzen Sie ein Gesamtvolumen von 3.1 nl. Anstelle von RNA, codierend für ein Fluoreszenzprotein (wie GFP oder RFP RNA), einen Morpholino-oder FITC fluoreszenzmarkierten Dextran injizieren. Die Fluoreszenz ist wichtig zu bestimmen, ob das transplantierte Gewebe heilt und bleibt im Kopf.
- Capped-mRNA kann von einer linearisierte Plasmid mit einem mMessage mMachine SP6 oder T7 Kit vorbereitet werden. Morpholinos gestaltet werden kann und durch Gene Werkzeuge LLC bestellt werden. Die Menge an Morpholin für eine gewünschte Wirkung erforderlich ist für jedes Gen 18 bestimmt werden.
- Bewahren Sie die injizierten Embryonen bei 15 ° C für 48 Stunden, bis sie Stufe 19-20 zu erreichen. (Foder alle nachfolgenden Schritte, Embryonen nach der Normal-Tabelle von Xenopus laevis durch Nieuwkoop Faber und 19).
HINWEIS: Am Tag der Operation, müssen beide Empfänger und Spender Embryonen in einem Stadium der jeweils anderen für die Transplantate, um optimal arbeiten zu können. Allerdings, Embryonen mit Morpholinos ("morphants") injiziert entwickeln manchmal langsamer als Wildtyp-oder steuern morphanten Embryonen, die es erforderlich machen Experimente so zu koordinieren, sowohl morphanten und Wildtyp-Embryonen sind auf der gleichen Stufe. Morphants müssen möglicherweise bei einer höheren Temperatur für 12-24 Stunden vor dem Eingriff gehalten werden. Um die Wahrscheinlichkeit, dass Embryonen können bei passenden Stufen gefunden werden zu erhöhen, können Embryonen bei verschiedenen Temperaturen gehalten werden. Vierundzwanzig Stunden vor dem Experiment, sollte man die Embryonen in einer mehrere Gerichte und morphants Ort bei 18-20 ° C und Wildtyp-Embryonen bei 15-18 ° C teilen
- Am Tag der Transplantation Experiment remove die Embryonen aus the15 ° C Inkubator und inszenieren sie nach Nieuwkoop und Faber 19. Wenn sie jünger als spät neurula (Stufe 19), lassen Sie sie bei Raumtemperatur für 1-2 Stunden, bis sie Stufe 19 zu erreichen.
- Bildschirm des injizierten Embryonen unter einem Fluoreszenzmikroskop. Wählen Embryonen, die gleichmäßige, helle Fluoreszenz für das Experiment zeigen.
- Entfernen Sie Unordnung und mögliche Verunreinigungen in der Nähe der Arbeitsbereich. Wischen Sie die Arbeitsfläche, Stereomikroskop und alle Werkzeuge mit 70% Ethanol.
- Sobald die Embryonen im Stadium 19, entfernen Sie die Dotterhaut mit # 5/45 Dumont Pinzette unter einem Stereomikroskop.
- Entfernen Sie die Dotterhaut von 20-30 von jedem Spender und Empfänger Embryonen.
- Für die ersten Gesichtstransplantation mehrere Experimente, sollte man mit ein paar Embryonen für jede Bedingung zu üben. Das Verfahren ist anspruchsvoll und erfordert eine sorgfältige Praxis, bevor es in einem größeren Maßstab verwendet werden, schnell und erfolgreich. Man kann u arbeitenp zu tun, 20 Transplantationen / Experiment.
- Bewegen Host Embryonen in die Betriebsschale mit einer Kunststoff abgestuften Führungspipette mit der Spitze abgeschnitten, daß die Öffnung ist viel breiter als ein Embryo (zumindest einige Millimeter). Seien Sie vorsichtig, nicht zu berühren Embryonen Blasen oder der Wasseroberfläche, als Embryonen werden in der Oberflächenspannung explodieren.
- Verwenden Sie # 5/45 Pinzetten, um die Embryonen in die Vertiefungen Ton einfügen, mit dem hinteren Teil des Embryos in der Lehm. Schließen Sie vorsichtig den Ton rund um die Grundlagen des Embryos mit der Zange, so dass die obere Viertel des Embryos, den Kopf aus der Depression herausragt.
- Sobald alle Host-Embryonen in ihren Depressionen gesichert ist, auf die andere Seite der Platte bewegen und beginnen, die Spender Embryonen in ihre Depressionen einfügen. Wiederholen Sie den Prozess der Sicherung der Embryonen in ihren Brunnen.
5. Durchführen der Gesichtstransplantation
- Schneidmesser: Als ein Schneidmesser zum Entfernenvon Spendergewebe EAD, verwenden Sie eine geeignete Glasscherben Kapillarnadel (siehe Schritt 2.3 und Abbildung 1).
HINWEIS: Man kann direkt halten die Kapillare zwischen den Fingern (dies funktioniert auch für Menschen mit kleinen Händen) oder ein in einer Insektenstifthalter die Nadel montieren. Electrosharpened Wolfram Nadeln 17 in einem Stifthalter geladen anstelle eines Kapillarrohrs Nadel verwendet werden. Bitte sehen Sie schlug vor, Stifthalter und Wolfram Nadeln in der Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräte. - Unter einem Stereomikroskop, legen Sie die Nadel in den Kopf des Embryos auf der linken Seite des Zementdrüse. Die Nadel sollte tief eingesetzt werden, so dass es geht von außerhalb der Embryo durch den Kopf, und in den Vorderdarm. Um die gesamte EAD verpflanzen, sollte Schnitte von der Außenseite des Embryos in die Vorderdarm verlängern. Für nur Ektoderm-Transplantationen sollten Schnitte flacher sein und sich nur durch das Ektoderm.
- Flick die Nadel von der linken zur rechten Seite derKopf, über die gesamte Breite der Zementdrüse. Das Schnippen ist wichtig, da die Bewegung gibt einen sauberen Schnitt. Siehe 2A für eine Zusammenfassung der Technik und 2B für eine Demonstration der Schnitte. Die Zementdrüse und Augen sind wichtige Meilensteine für die Schnitte. Die Reihenfolge der Schnitte hat keinen Einfluss auf das Ergebnis und kann basierend auf Vorlieben oder Händigkeit des Benutzers variieren.
- Platzieren der Nadel zu Beginn des vorigen Schnitt am linken Rand der Zementdrüse und den Fingern an die Nadel nach oben, bis es den Boden des linken Auges erreicht. Dies wird einen vertikalen Schnitt vom linken Rand der Zementdrüse auf der Unterseite des linken Auges zu schaffen.
- Stecken Sie die Nadel am rechten Rand des Zementdrüse, und Flick die Nadel nach oben, bis sie den Boden des rechten Auges erreicht. Dies wird einen vertikalen Schnitt vom rechten Rand der Zementdrüse an der Unterseite des rechten Auges zu schaffen.
- Um vollständig herauszuschneiden das Gewebe, flick die Nadel von der Unterseite des linken Auges auf der Unterseite des rechten Auges, wodurch ein horizontaler Schnitt, die das Gewebe frei werden. Cuts von außerhalb des Embryos an der Vorderdarm erweitern, einschließlich sowohl Ektoderm und Entoderm in der EAD Explantation. Alternativ können flache Schnitte für Ektoderm nur EAD Transplantationen verwendet werden. Sobald der EAD Gewebe entfernt wird, sollte es eine rechteckige Öffnung von der Außenseite des Embryos in den Vorderdarm zu sein, die sich von der Zementdrüse bis knapp unterhalb der Augen (von oben nach unten). Das Loch sollte vom inneren Rand des linken Auges auf den inneren Rand des rechten Auges (Seite zu Seite) zu erstrecken. Siehe Abbildung 2Bb.
- Schieben Sie das ausgeschnitten Gewebe auf der Spitze der Nadel, und heben Sie durch den Puffer, um den Teil der Schale mit Host-Embryonen. Sie nicht das Gewebe an der Oberfläche Luft auszusetzen oder es wird beschädigt werden.
- Zuschneiden elbe Gewebe vom Wirtsembryo, wie für den Spender. Entsorgen Sie die Host-EAD Explantat oder speichern Sie es auf Insertiont in den Spender Gesicht, für die gegenseitige Transplantationen.
- Legen Sie die Geber Explantation in die resultierenden Host-Loch mit # 5/45 Pinzette.
- Sobald das Spendergewebe richtig positioniert ist und vollständig eingeführt ist, sorgfältig einen Glasbrücke (siehe Abbildung 1 und Abbildung 2Bc) über das Gesicht des Embryos, das Transplantat in Position zu halten. Die Enden der Brücke soll in den Ton einfügen, an Ort und Stelle hält. Die Brücke sollte sanft Druck auf das transplantierte Gewebe, so dass die Transplantation bündig mit der Host-Kopf, ohne ihn aus dem Kopf heraus oder liegend tief im Kopf. Der Kopf kann leicht durch das Deckglas abgeflacht werden, aber darauf achten, nicht den Embryo mit zu viel Druck beschädigt werden. Transplantationen sollten innerhalb von 5 Minuten durchgeführt werden.
HINWEIS: Ein erfahrener Ermittler rund zwanzig Transplantationen pro Experiment über 2-3 Stunden durchführen können. Während dieser Zeit werden die Embryonen von Stufe 20-22 Fortschritte. Abschluss der Gesichtstransplantations in der Stufe 21 oder 22 hat keinen Einfluss auf die Ergebnisse. Später Transplantation (in den Stufen 22-26) kann getan werden, sind schwieriger als das Wappen frei EAD Mittellinienbereich wird als Schädel Neuralleiste bewegt sich in das Gesicht, aber verengt. Konsistenz über Transplantationen ist kritisch.
6. Gesichts-Transplantation nach der Operation Wiederherstellung
- Heilung dauert in der Regel 2-3 Stunden. Lassen Sie die Embryonen bei Raumtemperatur in ihrem Ton Vertiefungen mit den Glasbrücken hält die Spendergewebe an Ort ungestört.
- Sobald die Transplantationen geheilt werden vorsichtig die Glasbrücken, entfernen Sie den Ton aus um die Basis der Embryonen mit einer Pinzette, und verwenden Sie absolvierte ein Kunststofftransferpipette vorsichtig absaugen die Embryonen aus ihren Depressionen.
- Setzen Sie die Embryonen in eine entsprechend beschriftete Petrischale, die Hälfte mit sauberem 0,1 x MBS gefüllt mit Gentamicin.
- Wachsen die Embryonen bei 15 ° C oder 18 ° C für mehrere Tage bis zum Erreichen Zuführen Kaulquappenstadium bei Stufe 40, wHenne Gesichts Phänotypen erzielt werden.
- Der 0,1 x MBS-Lösung mit Gentamicin sollte täglich gewechselt werden, und alle toten Embryonen sollten sofort entfernt werden, um Verunreinigung und Tod anderer Embryonen zu verhindern.
- Der Mund öffnet um Stufe 40. In der Stufe 40-41, muss man überprüfen, dass das transplantierte Gewebe bleibt an Ort und Stelle verheilten, indem Sie seine Fluoreszenz. Transplantate gelegentlich fallen aus, so muss man sicherstellen, dass alle Embryonen hat die Spendergewebe an Ort und Stelle.
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Representative Results
Transplantierte Gewebe sollten vollständig nach der Transplantation in die Wirtskopf eingesetzt werden, wie in 3A gezeigt, und haben eine Glasbrücke entsprechend auf dem Gesicht des Embryos platziert, wie in Abbildung 2Bc gezeigt. Das transplantierte Spendergewebe muss korrekt für die Host-Öffnung bemessen sein, für die Transplantation erfolgreich zu sein. Die EAD Gewebe nicht aus dem Kopf herausragen, in irgendeiner Weise, wie in den 3B und 3C zu sehen. Zusätzlich sollte das Gesicht Transplantation nicht relativ zu seiner Position in dem Spenderkörper gedreht werden, wie in 3D gezeigt. Nach einigen Stunden ist das transplantierte Gewebe und umgebende Fläche zu heilen, und am nächsten Tag sollte der Embryo erscheinen als das Beispiel in Fig. 4A und 4A gezeigt. Man kann unter dem Fluoreszenz beobachten, dass die Transplantation bleibt an Ort und Stelle in der 4B. In der Stufe 41 wird das transplantierte Kontrollgewebe contribute auf den Mund, und wird grün fluoreszierenden bleiben, in 4B gesehen. Wildtyp EAD Gewebe in Wildtyp-Hosts transplantiert sollte Anlass zu normalen Gesichter geben, wenn sie mit ungestörten Wildtyp-Embryonen verglichen. Doch mit LOF oder GOF Spendergewebe, Gesichter sollten heilen und bleiben im Kopf, aber diese kann oder kann nicht dazu führen, normale Gesichtsschädelstrukturen, wie in Abbildung 3 von Dickinson und Sive 5 dargestellt.
| Reagens | Zutaten | Anleitung |
| 1 M CaCl 2 Lösung | 111 g CaCl 2 pro Liter | Autoklav und Speicher in 1 ml Aliquots bei -20 ° C oder 4 |
| 10x Geändert Barths Saline (MBS) Lösung | 880 mM NaCl, 51,4 g | Stellen Sie die Lautstärke auf 1 L mit destilliertem Wasser. Einstellen endgültigen pH-Wert auf 7,8 mit NaOH unddann im Autoklaven. |
| 10 mM KCl, 745,5 mg | ||
| 10 mM MgSO 4, 1,2 g | ||
| 50 mM HEPES (pH 7,8), 11,9 g | ||
| 25 mM NaHCO 3, 2,1 g | ||
| 1x MBS-Lösung | Schluss Konzentrationen: | Bereiten 1x MBS-Lösung durch Mischen von 100 ml 10x MBS Salzlösung mit 0,7 ml 1 M CaCl 2-Lösung. Stellen Sie die Lautstärke auf 1 L mit destilliertem Wasser. Verdünnen Sie diese Lösung auf 0,5 x 0,1 x MBS und MBS zu machen. |
| 88 mM NaCl | ||
| 1 mM KCl | ||
| 0,7 mM CaCl 2 | ||
| 1 mM MgSO 4 | ||
| 5 mM HEPES (pH 7,8) | ||
| 2,5 mM NaHCO 3 |
Tabelle 1. Reagenzien, Zutaten und Anweisungen.
| Wärme | Ziehen | Vel. | Zeit |
| 800 | 70 | 40 | 50 |
Tabelle 2. Needle Puller Einstellungen *.
* Nadelzieher Einstellungen variieren von Maschine zu Maschine, so dass jedes Labor müssen wahrscheinlich ihre eigenen Nadelzieher-Einstellungen zu optimieren.
Abbildung 1. Verwendet Tools. A) zeigt eine intakte, ungebrochen Nadel und eine gebrochene Nadel nach der flexiblen Spitze entfernt wurde B.) Zeigt zwei Pipettenwerkzeuge mit ihren Enden vollständig versiegelt und gerundet. C) zeigt drei Beispielglasbrücken. Maßstabsbalken = 1,000 mm.
.. Abbildung 2 Zusammenfassung der Gesichtstransplantation Methode A) Allgemeine Transplant Schema:.. Schematische Darstellung der Gesichtstransplantation ein Verfahren Embryonen werden mit einem Fluoreszenzmittel und ein Antisense-Oligonukleotid Morpholino an der 1-Zell-Stadium injiziert. Die Leuchtstoffmittel können entweder GFP mRNA, FITC-markierten Morpholino, oder fluoreszierenden Dextran. B. Mutmaßlicher Mund auf Stufe 22 von einem Host-Wildtyp-Embryo und einem Spender morphanten Embryo entfernt. Das transplantierte Gewebe können auch erweitert werden, um den mutmaßlichen Nase, die direkt über der Mundregion liegt gehören. Der Spender morphanten Gewebe wird mit dem Wildtyp-Host transplantiert und dann an Ort und Stelle mit einer Glasbrücke gesichert. Grau Bogen: Brutdrüse.
Abbildung 3. Schematische Darstellung des Embryos kurz nach der Transplantation. Frontalansichten gezeigt. Das transplantierte Gewebe in rote Punkte dargestellt. A und A 'stellen eine ideale Ergebnis der Stufe 22. Das Gewebe wird vollständig eingeführt und korrekt positioniert in den Kopf. B und B 'zeigen eine falsche Transplantation, mit dem Gewebe teilweise in den Kopf. C und C' eingeführt Show eine falsche Transplantation mit den meisten der Gewebe in den Kopf eingesetzt, aber die Überschussbereich von der Heilungsstelle vorsteht. Dieses Gewebe wird nekrotisieren, und hemmen die Heilung von den umliegenden, richtig eingesetzt Regionen. D und D 'zeigen eine unsachgemäße Transplantation, wo das Gesicht in dem Host gedreht wurde, in Bezug auf seine Position in den Spender. Die tThema wird in den Kopf zu heilen, aber das Gesicht nicht normal entwickeln. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Ältere Embryonen mit idealen Ergebnisse. Frontalansichten gezeigt. cg: Zementdrüse, mo:.. Mund A) Zeigt ein Embryo einen Tag nach der Transplantation, die eine richtig verheilt Transplantation bei Stufe 32 A ') Zeigt diese gleichen Embryo mit einer Leuchtstofflagerung, die bestätigt, dass das transplantierte Gewebe an Ort und Stelle bleibt, B. ) zeigt die gleichen Embryo im Stadium 42, die eine Steuer Morpholino, GFP + einige Tage vor der Transplantation hatte. Das Gesicht richtig. B 'entwickelt)Zeigt die gleichen Embryo mit einer Leuchtstofflagerung, die bestätigt, dass das transplantierte Gewebe bleibt im Kopf und hat in der Regel, um Gesichtsstrukturen beigetragen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Kritische Schritte und Einschränkungen: Der EAD Gesichtstransplantation Verfahren ist zeit-und arbeitsintensiv. Es erfordert Übung, ruhige Hände und Fingerfertigkeit zu perfektionieren. Die Gesichtstransplantation Protokoll beruht auf der Fähigkeit des Forschers, um effizient zu entfernen und Transplantatgewebe. Wenn man zu lange braucht, um die Transplantation in das Wirts Gesicht einfügen, wird der Host Gesicht beginnen, sich zusammenzuziehen und zu heilen. Pinzetten können verwendet werden, um den Gesichtsbereich zart zu erweitern. Allerdings, wenn erhebliche Wundkontraktion stattgefunden hat, das Transplantat wird nicht so gut heilen und müssen in der Größe reduziert werden, in Gesichtsloch des Hosts passen. Größe und Form der Transplantation muss sich in etwa die Größe und Form der Gesichtshöhle des Empfängers ein, um erfolgreiche Einführen zu ermöglichen.
Gesichtstransplantationen sind am erfolgreichsten, wenn zwischen den Stufen 19 bis 22 durchgeführt, mit Embryonen, die von der Bühne abgestimmt sind. Ältere Gesicht Transplantationen, zwischen den Stufen 22 bis 26, sind möglich, aber sind schwieriger eind kann Neuralleiste Migration in die Seiten des Gesichts zu stören, da das Wappen freien Mittellinienbereich wird deutlich schmaler aus der Stufe 22-26.
Sowohl der Empfänger und Spender müssen bei ähnlichen Stufen für die Transplantation, um optimal zu arbeiten. Idealerweise sollte sie die gleichen Stufe sein, und minimal müssen innerhalb weniger Stunden von einander sein. Embryonen mit Antisense-RNA-Morpholino Oligonukleotiden ("morphants") injiziert entwickeln manchmal langsamer als Wildtyp-oder steuern morphanten Embryonen, zu verlangen, dass morphants bei einer höheren Temperatur gezüchtet, um den Wildtyp-Embryonen "Stufen angepasst werden.
Der Spender Gesicht Gewebe sollte nicht in den Wirtskörper relativ zu seiner ursprünglichen Position in der Spenderembryo gedreht werden, sonst wird das Gesicht nicht normal entwickeln. Die Zementdrüse muss nicht in der Gesichtstransplantation für das Verfahren einbezogen werden, um zu arbeiten, das Gesicht entwickelt sich normalerweise ohne sie. Jedoch wird der Zementdrüse oft in t enthaltener ausgerottet Gesichtstücher, weil es dient als eine deutliche Markierung, um anzuzeigen, und positionieren Sie den Boden der Transplantation. Dieser Marker wird Ihnen helfen zu vermeiden, versehentlich Drehen des Gewebes während der Übertragung von Gewebe im Gesicht an den Empfänger. Wenn die Transplantation wurde falsch in der Host-Gesicht eingesetzt wird, kann das Spendergewebe entfernt und entsorgt werden. Man kann versuchen, eine neue Transplantation in den gleichen Wirt einzufügen, wenn die Öffnung nicht begonnen hat zu verengen. Allerdings, wenn der Host-Eröffnung hat sich merklich geschrumpft ist, dann werfen Sie die Host-und neu beginnen.
Es ist entscheidend, um die Glasbrücke direkt an der transplantierten Gesicht zu platzieren, dass das Transplantat in den Kopf des Wirtes während der Heilung statt. Wenn die Transplantation ist nicht an Ort und Stelle gehalten wird, kann die Transplantation von Host Gesicht extrudiert werden. Transplantate, die nicht vollständig in das Gesicht eingesetzt werden, oder dass aus Pop während der Heilung wird Nekrose. Auch in perfekter Transplantationen, können geringe Mengen von Gewebe Tod um die Kanten o auftretenf die Transplantation. Normalerweise ist dies nicht dazu führen, Nebenwirkungen und ein ganz normales Gesicht noch gebildet werden. In erfolgreichen Kontrollen haben wir keine Fehlbildung nach vier Wochen der Entwicklung darauf hindeutet, dass der Knorpel in der Regel gebildet und die Abstoßung des Gewebes ist selten beobachtet.
Schließlich, wenn ein Morpholino stört ein Protein für die normale Wundheilung erforderlich ist, kann diese Technik nicht, da das transplantierte Gewebe LOF kann nicht in das Wirtskopf eingearbeitet werden.
Mögliche Änderungen und Fehlersuche: Änderungen können dem Verfahren hergestellt werden. Mit etwas Übung kann der Forscher lernen, kleineren Regionen, beispielsweise die Hälfte des EAD zu verpflanzen. Shallow Einschnitte ermöglichen ektodermalen Transplantationen, so dass die tieferen Endoderm ungestört. Andere Regionen der embryonalen Gewebe transplantiert werden, die ähnliche Ansätze.
Wenn das transplantierte Gewebe stirbt nach Insertion, gibt es Paare von pÖGLICHE Ursachen. Transplantierte Gewebe, die nicht vollständig in den Wirt eingelegt oder entsprechend an Ort und Stelle mit einer Glasbrücke stattfand, wird sterben, und die richtige Heilung behindern. Stellen Sie sicher, dass die transplantierte Gewebe vollständig einfügen und befestigen Sie sie mit einer Glasbrücke. Wenn das Transplantat von einem Morpholino-oder RNA injiziert Spender stammt, dann kann das Gewebe aufgrund der Toxizität von Mittel injiziert sterben. In ähnlicher Weise, wenn die Host-Embryonen morphants oder RNA-injizierten und sterben häufig, dann die Menge der Morpholino-oder RNA müssen reduziert werden. Um diese Probleme zu beheben, titriert die Menge des eingespritzten RNA oder Morpholino und bestimmen einen sicheren Betrag für eine erfolgreiche Transplantation Gesicht. Schließlich Erhöhung der Salzkonzentration der Lösung über 0,1 × MBS helfen auch Heilung.
Bedeutung: Die beschriebene Gesichtstransplantation Technik ermöglicht die Analyse der lokalen Anforderungen und der Aktivität der Genprodukte bei kraniofazialen Entwicklung. Dieser Ansatz kann si klärengnaling zwischen der Entwicklungs noncrest, Neuralleiste, und der umgebenden Strukturen. Er erlaubt es, LOF oder GOF (mit jeder Strategie) in allen EAD-abgeleitete Gewebe zu untersuchen, die nicht mit einem einzigen Promotor angetrieben Konstrukt ist möglich. Zwar gibt es eine lange Geschichte der Gewebetransplantation in der Entwicklungsbiologie ist dies die erste Anwendung der Transplantation auf das Studium der Schädelentwicklung in Frösche und ist entscheidend für mechanistische Studien 7. So kann die Technik helfen, die komplexen Mechanismen, die die Musterbildung und die Bildung der Wirbeltier-Gesicht zu entwirren und zu Ursachen von kraniofazialen Entwicklungsstörungen zu klären.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken Radek Sindelka für seine Hilfe und Cas Bresilla für die Unterstützung mit Froschhaltung und Embryo Vorbereitung. Diese Arbeit wurde durch die NIH über die Erteilung R01DE021109 zu HLS Laura Jacox finanziert wurde von der Herschel Smith Graduiertenstipendium an der Harvard University und einen F30 einzelner Stipendien Zuschuss F30DE022989-01 durch die NIDCR finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pasteur pipette | VWR | 14672-400 | Lime Glass |
| Size 5 3/4 in | Cotton Plugged | ||
| Graduated Transfer Pipette | VWR | 16001-180 | Disposable |
| #5/45 forceps | Fine Science Tools by Dupont medical | 11251-35 | Angled 45° |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-20 | Straight; serrated tip; stainless steel |
| Capillary Tubing (for needles) | FHC | 30-30-1 | Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID/Fiber |
| Cover slip | VWR | 48393 252 | 24 x 60 mm micro cover glass; |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 | |
| Needle Puller | Sutter Instrument Co | Needle Puller: discontinued Filament: FB300B | The most similar, currently available needle puller is the P-97. For filaments, use Sutter 3.00 mm square box filaments, 3.0 mm wide. |
| Model P-80 | Flaming / Brown micropipette puller | ||
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Stereomicroscope Lighting by Fostec | Fostec | Use a light box with 2 fiberoptic arms. | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | Jaw Opening Diameter: 0-1 mm |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Jaw opening Diameter: 0-1 mm |
| Tungsten Needles | Fine Science Tools | 10130-05 | 0.125 mm Rod diameter |
| Van Aken Plastalina | Blick | #33268-2981 | |
| Modeling Clay- white, red, or yellow | |||
| mMessage mMashine SP6 or T7 Kit | Ambion | AM1340 |
References
- Gorlin, R. J., Cohen, M., Levin, L. Syndromes of the head and neck. , Oxford University Press. UK. (1990).
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