Summary
Xenopus के बीच चेहरे ऊतक "चरम पूर्वकाल डोमेन" रोपाई के लिए एक तकनीक भ्रूण विकसित किया गया है laevis. ऊतक craniofacial विकास के लिए और चेहरे क्षेत्रों के बीच बातचीत के संकेत के लिए स्थानीय आवश्यकताओं के अध्ययन की अनुमति, दूसरे में एक जीन की अभिव्यक्ति पृष्ठभूमि से ले जाया जा सकता है.
Abstract
Craniofacial जन्म दोष 1 700 हर के बाहर जीवित जन्मों में होते हैं, लेकिन एटियलजि शायद ही कभी कारण craniofacial विकास की सीमित समझ के लिए जाना जाता है. संकेत दे रास्ते और ऊतकों के विकास के चेहरे की patterning के दौरान कार्य की पहचान जहां, एक 'चेहरा प्रत्यारोपण' तकनीक मेंढक Xenopus laevis की भ्रूण में विकसित किया गया है. प्रकल्पित चेहरे ऊतक ("चरम पूर्वकाल डोमेन" (ई.)) के एक क्षेत्र tailbud चरण में एक दाता भ्रूण से हटा दिया, और बराबर क्षेत्र हटा दिया गया है, जिसमें से एक ही मंच से एक मेजबान भ्रूण को प्रत्यारोपित किया जाता है. यह मेजबान या दाता ऊतक एक जीन में एक हानि या समारोह के लाभ है, और / या एक वंश लेबल भी शामिल है जहां एक chimeric चेहरा उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. चेहरे क्षेत्र में आसानी से बड़ी है और के रूप में उपचार के बाद, विकास के परिणाम पर नजर रखी, और दाता या आसपास के मेजबान के ऊतकों के भीतर संकेतन मार्ग की भूमिका को इंगित करता है. Xenopus, चेहरा विकास के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल है एकmicromanipulation के लिए ccessible. विकास तेजी से होता है के बाद से कई भ्रूण एक कम समय की अवधि में, assayed किया जा सकता है. Craniofacial प्रक्रियाओं Xenopus और स्तनधारियों के बीच संरक्षित दिखाई देते हैं मेंढक में निष्कर्ष, मानव विकास के लिए प्रासंगिक हैं.
Introduction
Craniofacial विकास के दौरान craniofacial जन्म दोष 1-2, महत्वपूर्ण ऊतकों और उनके संकेत योगदान अंतर्निहित तंत्र को समझने की पहचान की जानी चाहिए. मेंढक Xenopus laevis, बाह्य त्वक स्तर और अन्तर्जनस्तर सीधे 3-4 juxtaposed हैं, जहां "चरम पूर्वकाल डोमेन" (ई.), से मुंह और नाक के फार्म सहित चेहरे का हिस्सा, में. EAD भी जबड़े और चेहरे अन्य क्षेत्रों 5 रूपों जो कपाल तंत्रिका शिखा, सहित आसपास के ऊतकों को प्रभावित करने के लिए एक संकेत केंद्र के रूप में कार्य करता है. ऊतक इसी मेजबान क्षेत्र को हटाने के बाद, एक मेजबान भ्रूण में एक दाता से प्रत्यारोपित किया जाता है जहां EAD समारोह में योगदान देने वाले जीन की पहचान करने के लिए, एक 'चेहरा प्रत्यारोपण' तकनीक विकसित की गई थी. प्रत्यारोपण के बाद, चेहरे का विकास परिणामस्वरूप मूल्यांकन किया है. इस प्रकार, समारोह के नुकसान (LOF) या ई. में एक विशेष जीन के लिए समारोह (GOF) के लाभ के प्रभाव, स्थानीय स्तर पर विश्लेषण कर रहे हैं, जहां घंटे का आरामEAD और शरीर जंगली प्रकार के ऊतकों से बना है. जंगली प्रकार के ऊतकों विशिष्ट जीन में वैश्विक LOF या GOF के साथ भ्रूण में प्रत्यारोपित किया जाता है जहां पारस्परिक प्रत्यारोपण, प्रदर्शन किया जा सकता है. ट्रांसप्लांटेशन अक्सर Xenopus में इस्तेमाल किया गया है और लड़की 6 अध्ययन करता है. उदाहरण के लिए, Xenopus प्रत्यारोपण स्वजातीय तंत्रिका प्रेरण, लेंस और तंत्रिका क्षमता, और तंत्रिका शिखा प्रवास 7-10 संबोधित किया गया है. बटेर चिकी कैमेरिक ग्राफ्टिंग पूर्वकाल तंत्रिका प्लेट, पूर्वकाल तंत्रिका रिज, तंत्रिका शिखा, और कपाल हड्डियों 11-14 के विकास का विश्लेषण किया गया है. इस Xenopus में craniofacial विकास के अध्ययन के लिए पहला प्रत्यारोपण तकनीक है. इस तकनीक प्रकल्पित मुंह 5 में तहखाने झिल्ली गठन को विनियमित करने में Wnt inhibitors Frzb1 और वर्धमान के लिए एक उपन्यास भूमिका का प्रदर्शन किया है. Xenopus laevis craniofacial विकास के अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल है भ्रूण बड़े हैं, के रूप में, बाहर से विकसित एकएन डी चेहरे की अनुमति, दिखाई आसानी micromanipulation और विकास की इमेजिंग. चेहरे का विकास अंतर्निहित तंत्र मेंढक में किए गए निष्कर्षों मानव विकास 4,15-16 में अंतर्दृष्टि प्रदान का संकेत है कि संरक्षित दिखाई देते हैं.
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Protocol
1. तैयारी अभिकर्मकों
- 10x एमबीएस: बार्थ खारा (एमबीएस) समाधान 17 संशोधित 10x का 1 एल तैयार करें. तालिका 1, अभिकर्मकों, सामग्री, और निर्देशों को देखें. सभी समाधान के लिए आसुत जल का उपयोग करें. पूरा विघटन तक, एक हलचल पट्टी का उपयोग कर, एक बीकर में मिलाएं. सभी समाधान कमरे के तापमान पर बनाया जाना चाहिए.
- 1x एमबीएस: 1x एमबीएस की 1 एल बनाने के लिए आसुत पानी की 900 मिलीलीटर में 10x एमबीएस समाधान के 100 मिलीलीटर पतला. एम 1 2 CaCl समाधान के 0.7 मिलीलीटर जोड़ें.
- 0.1x एमबीएस: पतला 1x एमबीएस 0.5x एमबीएस समाधान के 1 एल और 0.1x एमबीएस समाधान के 2 एल तैयार करने के लिए. 0.1x एमबीएस समाधान के 1 एल करने के लिए, 10 मिलीग्राम / एमएल gentamycin समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें. Gentamycin साथ 0.1x एमबीएस समाधान लंबे समय तक भ्रूण संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
- Ficoll / एमबीएस: 0.5x एमबीएस समाधान की 500 मिलीलीटर Ficoll 400 की 15 ग्राम जोड़ें. सख्ती मिश्रण. एक हलचल बार जोड़ें और Ficoll पूरी तरह से (कई घंटे) को भंग कर दिया है जब तक मिश्रण.
- 70% इथेनॉल: उपयोग कर 70% इथेनॉल के लिए 100% इथेनॉल पतलाआसुत जल.
2. ग्लास ऑपरेटिंग उपकरण तैयारी
- सुई तैयारी: एक सुई खींचने में लोड केशिका टयूबिंग.
- सुई खींचने सेटिंग्स: 2 तालिका में दिखाया सेटिंग्स के अनुसार सुई खींचो. विशिष्ट अभिकर्मकों और उपकरणों की तालिका में वर्णित के रूप में सेटिंग्स, एक Sutter साधन कं मॉडल P-80/PC micropipette खींचने और केशिका tubings के लिए कर रहे हैं. हालांकि, इन सेटिंग्स सूटर सुई खींचने के लिए विशिष्ट हैं, और अन्य मशीनों के लिए समायोजित करने की आवश्यकता होगी. मशीन के निर्माता द्वारा निर्दिष्ट के रूप में सेटिंग्स, एक रैंप परीक्षण का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है.
- प्रक्रिया के लिए तैयार करने में 4-6 सुइयों खींचो. सुई आम तौर पर लंबे समय तक 2-3 मिमी है, जो कांच टिप का लचीला, बालों की तरह भाग पूरी तरह से हटा दिया जाता है कि इस तरह टूट जाना चाहिए. टिप अपेक्षाकृत कठोर, लेकिन एक काटने के उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए अभी भी काफी संकीर्ण होना चाहिए. चित्रा 1 ए में एक आदर्श सुई के फोटो देखें. केन्द्र नीचे मिट्टी का एक पट्टी के साथ एक पेट्री डिश में सुई स्टोर. , मिट्टी में प्रत्येक सुई के शाफ्ट प्रेस जगह में पकड़ करने के लिए और दूर नीचे और पक्षों से कमजोर तेज टिप रखने के लिए.
- अतिरिक्त उपकरणों के लिए, लंबे समय से मानक पैटर्न संदंश, एक लेम्प बर्नर, और 3-4 गिलास पाश्चर pipettes (आकार में 5 ¾) की एक जोड़ी कांच कवर फिसल जाता है प्राप्त करते हैं.
- पिपेट उपकरण: एक पिपेट उपकरण बनाने के लिए, लेम्प बर्नर प्रकाश और टिप पिघला देता है और छेद पूरी तरह से सील, एक बंद, गोल अंत बनाने ऐसा है कि, यह घूर्णन जबकि लौ के नीले भाग में एक गिलास पाश्चर पिपेट की नोक जगह . गोल, सील टिप बाद में आपरेशन के दौरान भ्रूण मानती है कि मिट्टी पकवान में गड्ढों बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है. चित्रा 1B देखें.
- ग्लास पुल:, कांच पुल बनाने के ध्यान से कवर पर्ची कांच की 3 मिमी मात्रा से 3 मिमी दूर तोड़ने के लिए लंबे समय से मानक पैटर्न संदंश का उपयोग करें. टी के साथ कवर पर्ची का टुकड़ा धारण करते हुएसभी चार किनारों नीचे नरम और वक्र तक weezers, एक छोटे से गिलास गुंबद के गठन, लौ में कांच जगह है. किनारों को अब तेज किया जाना चाहिए. चित्रा 1C देखें.
- उन्हें डालने से गिलास को कवर पर्ची पुलों की दुकान, एक पेट्री डिश के नीचे अस्तर, क्ले मॉडलिंग में, नीचे किनारों. पुल के ऊपर मिट्टी की सतह से ऊपर बनी हुई है कि इस तरह के पुलों डालें. इसे हटाने के लिए मुश्किल हो सकता है, क्योंकि पुल टूट जाता है, और पूरी तरह से मिट्टी में पुल एम्बेड नहीं है कि मुश्किल भी ऐसे धक्का नहीं है. एक लौ या 70% इथेनॉल के साथ नसबंदी के बाद, पुलों प्रयोग करने के लिए प्रयोग से पुन: उपयोग किया जा सकता है.
3. भ्रूण ऑपरेशन के लिए तैयारी
- क्ले मॉडलिंग के साथ एक छोटे से 60 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश लाइन. उपयोगों के बीच, पकवान और मिट्टी की सतह पूरी तरह आसुत जल से धोया और फिर 70% इथेनॉल के साथ है.
नोट: का प्रयोग, लाल, सफेद या पीले, एक स्थानीय पर खरीदा जा सकता है जो वान Aken Plastalina क्ले मॉडलिंग,वाई या कला की दुकान. यह एक अवशेषों विज्ञप्ति क्योंकि काले मिट्टी की सिफारिश नहीं है. - 3% Ficoll 0.5x एमबीएस समाधान के साथ पकवान भरें. उच्च नमक एकाग्रता ऊतक हदबंदी से बचाता है, और polysaccharide Ficoll स्थिति में चेहरे को धारण करने में सहायता समाधान है, जो और अधिक मोटा होना करने में मदद करता है.
- एक चरण में 20 भ्रूण शरीर की गहराई के बारे में, मिट्टी में उथले, 2-3 मिमी गड्ढों बनाने के लिए flamed पाश्चर पिपेट उपकरण (चित्रा 1 देखें) का प्रयोग करें. पकवान के प्रत्येक पक्ष पर, अलग 20-30 depressions, 1-2 मिमी है, तो 40-60 गड्ढों की कुल रहे है. संदंश के साथ मिट्टी में पहले अक्षर नक्काशी करके, एक तरफ LOF / GOF, और दूसरी तरफ जंगली प्रकार लेबल.
4. Preoperation भ्रूण तैयारी
- प्राप्त और संस्कृति Xenopus मानक विधियों 17 का उपयोग भ्रूण laevis. मेंढक पशुपालन का एक विस्तृत वर्णन के लिए निर्णायक एट अल. 17 कृपया देखें
- पूर्व प्रयोग obta को अड़तालीस घंटेमहिला मेंढ़क से अंडे में और इन विट्रो निषेचन में प्रदर्शन करते हैं.
- एक सेल मंच पर या 2 सेल चरण में 2 कोशिकाओं में 0.5-1 छाया हुआ झिल्ली GFP mRNA की एनजी, के अलावा किसी भी वांछित mRNA या विरोधी भावना morpholino संशोधित antisense oligonucleotides ("morpholinos") इंजेक्षन. एक सेल चरण में लगभग 70-90 मिनट तक रहता है. 1-3 नाथन की कुल मात्रा इंजेक्षन. (जैसे GFP या आरएफपी शाही सेना के रूप में) एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए शाही सेना कोडिंग की जगह में, एक FITC लेबल morpholino या fluorescently लेबल dextran इंजेक्षन कर सकते हैं. प्रतिदीप्ति ऊतक भर देता है प्रतिरोपित और सिर में रहता है कि क्या निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है.
- छाया mRNA एक mMessage mMachine SP6 या T7 किट का उपयोग कर एक linearized प्लाज्मिड से तैयार किया जा सकता है. Morpholinos बनाया गया और जीन उपकरण LLC के माध्यम से आदेश दिया जा सकता है. एक वांछित प्रभाव के लिए आवश्यक morpholino की राशि प्रत्येक जीन 18 के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए.
- वे मंच 19-20 पहुँचने तक, 48 घंटा के लिए 15 डिग्री सेल्सियस पर इंजेक्शन भ्रूण स्टोर. (एफया बाद के सभी चरणों, मंच भ्रूण Nieuwkoop और फैबर 19 से Xenopus laevis की सामान्य तालिका के अनुसार.)
नोट: सर्जरी के दिन, दोनों प्राप्तकर्ता और दाता भ्रूण प्रत्यारोपण बेहतर काम करने के लिए एक दूसरे से एक मंच के भीतर होना चाहिए. हालांकि, morpholinos ("morphants") के साथ इंजेक्शन भ्रूण कभी कभी अधिक धीरे जंगली प्रकार से विकसित या morphant भ्रूण को नियंत्रित, तो morphant और जंगली प्रकार भ्रूण दोनों एक ही मंच पर हैं यह आवश्यक प्रयोगों समन्वय करने के लिए कर रही है. Morphants प्रक्रिया से पहले 12-24 घंटे के लिए एक उच्च तापमान पर रखा जाना पड़ सकता है. भ्रूण मिलान चरणों में पाया जा सकता है कि संभावना बढ़ाने के लिए, भ्रूण कई तापमान पर रखा जा सकता है. प्रयोग करने से पहले चौबीस घंटे, एक 15-18 डिग्री सेल्सियस पर 18-20 डिग्री सेल्सियस और जंगली प्रकार भ्रूण में कई व्यंजन, और जगह morphants में भ्रूण विभाजित करना चाहिए
- प्रत्यारोपण के प्रयोग, रेम के दिनthe15 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से भ्रूण ove और Nieuwkoop और फैबर 19 के अनुसार उन्हें मंच. वे देर neurula (चरण 19) की तुलना में छोटी हैं, तो वे चरण 19 तब पहुंचें, 1-2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर उन्हें छोड़ दें.
- एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे इंजेक्शन भ्रूण स्क्रीन. प्रयोग के लिए वर्दी, उज्ज्वल प्रतिदीप्ति चलता है कि भ्रूण का चयन करें.
- परिचालन क्षेत्र के आसपास अव्यवस्था और संभव को दूर. 70% इथेनॉल के साथ परिचालन सतह, stereomicroscope और सभी उपकरण नीचे साफ कर लें.
- भ्रूण चरण 19 पर एक बार, एक stereomicroscope के तहत # 5/45 Dumont संदंश का उपयोग पीतक झिल्ली को हटा दें.
- दाता और मेजबान भ्रूण में से प्रत्येक का 20-30 का पीतक झिल्ली निकालें.
- पहले कई चेहरा प्रत्यारोपण प्रयोगों के लिए, एक हर हालत के लिए कुछ भ्रूण के साथ अभ्यास करना चाहिए. विधि चुनौती दे रहा है और इसे जल्दी और सफलतापूर्वक एक बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया जा सकता से पहले सावधान अभ्यास की आवश्यकता है. एक यू काम कर सकते हैं/ प्रयोग 20 प्रत्यारोपण कर पी.
- एक प्लास्टिक का उपयोग ऑपरेटिंग डिश में मेजबान भ्रूण हटो उद्घाटन एक भ्रूण (कम से कम कुछ मिलीमीटर) से ज्यादा व्यापक है कि इस तरह के कट ऑफ टिप के साथ हस्तांतरण विंदुक स्नातक किया. भ्रूण सतह तनाव में विस्फोट हो जाएगा, के रूप में बुलबुले या पानी की सतह के लिए भ्रूण को छू से बचने के लिए सावधान रहें.
- मिट्टी में भ्रूण के पीछे के साथ, मिट्टी गड्ढों में भ्रूण सम्मिलित करने के लिए # 5/45 संदंश का प्रयोग करें. धीरे अवसाद से फैला हुआ, भ्रूण के ऊपर तिमाही, सिर, जा संदंश का उपयोग भ्रूण के ठिकानों के आसपास मिट्टी को बंद करें.
- सभी मेजबान भ्रूण उनके गड्ढों में सुरक्षित कर रहे हैं एक बार, थाली के दूसरी तरफ ले जाने और उनके गड्ढों में दाता भ्रूण डालने लगते हैं. उनके कुओं में भ्रूण हासिल करने की प्रक्रिया को दोहराएँ.
5. चेहरा प्रत्यारोपण सर्जरी प्रदर्शन
- चाकू काटना: हटाने के लिए एक काटने चाकू के रूप मेंदाता ई. ऊतक की, एक उचित टूट गिलास केशिका सुई (2.3 कदम और चित्रा 1 देखें) का उपयोग करें.
ध्यान दें: एक सीधे उंगलियों के बीच केशिका (इस छोटे हाथों से लोगों के लिए अच्छी तरह से काम करता है) या एक एक कीट पिन धारक में सुई माउंट कर सकते हैं पकड़ कर सकते हैं. एक पिन धारक में लोड Electrosharpened टंगस्टन सुई 17 के बजाय एक केशिका ट्यूब सुई का इस्तेमाल किया जा सकता है. विशिष्ट अभिकर्मकों और उपकरणों की तालिका में सुझाव दिया पिन धारकों और टंगस्टन सुई देखें. - एक stereomicroscope के तहत, सीमेंट ग्रंथि के बाईं ओर भ्रूण के सिर में सुई डालने. यह सिर के माध्यम से, भ्रूण के बाहर से होकर गुजरता है, और अग्रांत्र में इतना है कि सुई, गहरा डाला जाना चाहिए. पूरे ई. प्रत्यारोपण, कटौती अग्रांत्र को भ्रूण के बाहर से विस्तार करना चाहिए. बाहरी झिल्ली केवल प्रत्यारोपण के लिए, कटौती shallower होना चाहिए और केवल बाहरी झिल्ली के माध्यम से विस्तार.
- के दाएं बाएं से सुई झटकासीमेंट ग्रंथि की पूरी चौड़ाई में, सिर. प्रस्ताव एक साफ काट देता flicking महत्वपूर्ण है. कटौती के एक प्रदर्शन के लिए तकनीक और चित्रा 2 बी के एक सारांश के लिए चित्रा 2A को देखें. सीमेंट ग्रंथि और आंखों में कटौती के लिए महत्वपूर्ण स्थलों हैं. कटौती का आदेश परिणाम को प्रभावित नहीं करता है और उपयोगकर्ता की पसंद या मनमानी के आधार पर भिन्न हो सकती हैं.
- सीमेंट ग्रंथि के बाएँ बॉर्डर पर, पिछले कटौती के शुरू में सुई प्लेस, और यह बाईं आंख के नीचे तक पहुँच जाता है जब तक ऊपर की ओर सुई झटका. इस बाईं आंख के नीचे करने के लिए सीमेंट ग्रंथि के छोड़ सीमा से एक ऊर्ध्वाधर कटौती बनाएगा.
- सीमेंट ग्रंथि के दाहिने सीमा पर सुई प्लेस, और यह सही आंख के नीचे तक पहुँच जाता है जब तक ऊपर की ओर सुई झटका. इस दाहिनी आंख के नीचे करने के लिए सीमेंट ग्रंथि के दाहिने सीमा से एक ऊर्ध्वाधर कटौती बनाएगा.
- पूरी तरह से ऊतक, Flic उत्पाद शुल्क के लिएऊतक मुक्त होगा कि एक क्षैतिज कट बनाने, दाहिनी आंख के नीचे करने के लिए बाईं आंख के नीचे से सुई k. कटौती ई. explant में बाह्य त्वक स्तर और अन्तर्जनस्तर दोनों सहित अग्रांत्र को भ्रूण के बाहर से विस्तार कर सकते हैं. वैकल्पिक रूप से, उथले कटौती बाहरी झिल्ली केवल ई. प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ई. ऊतक निकाले जाने के बाद, सीमेंट ग्रंथि से खींच, अग्रांत्र में भ्रूण के बाहर से एक आयताकार छेद होना चाहिए करने के लिए बस आँखें (ऊपर से नीचे) नीचे. छेद सही नज़र (पक्ष की ओर) के अंदर सीमा के बाईं आंख के अंदर सीमा से विस्तार करना चाहिए. चित्रा 2BB देखें.
- धीरे सुई की नोक पर excised ऊतक धक्का, और मेजबान भ्रूण युक्त पकवान के हिस्से के लिए बफर के माध्यम से इसे उठा. सतह से हवा करने के लिए ऊतक का पर्दाफाश नहीं है या यह क्षतिग्रस्त हो जाएगा.
- दाता के रूप में, मेजबान भ्रूण से एक ही ऊतक आबकारी. मेजबान ई. explant त्यागें या INSER को बचाने के लिएपारस्परिक प्रत्यारोपण के लिए, दाता चेहरे में टी.
- # 5/45 संदंश का उपयोग परिणामस्वरूप मेजबान छेद में दाता explant डालें.
- दाता ऊतक सही ढंग से तैनात है और पूरी तरह से डाला जाता है एक बार, ध्यान से जगह में प्रत्यारोपण धारण करने के लिए भ्रूण के चेहरे पर (चित्रा 1 और चित्रा 2Bc देखें) एक गिलास पुल जगह है. पुल के छोर जगह में पकड़े, मिट्टी में डालने चाहिए. पुल धीरे प्रत्यारोपण यह सिर के बाहर चिपके हुए या गहरी सिर के भीतर झूठ बोल के बिना, मेजबान सिर के साथ फ्लश निहित है जैसे कि प्रतिरोपित ऊतकों, के लिए दबाव लागू करना चाहिए. सिर थोड़ा कवर पर्ची से चपटा, लेकिन बहुत ज्यादा दबाव के साथ भ्रूण को नुकसान नहीं सावधान किया जा सकता है. प्रत्यारोपण 5 मिनट के भीतर किया जाना चाहिए.
ध्यान दें: एक अनुभवी अन्वेषक 2-3 घंटे से अधिक प्रयोग के अनुसार लगभग बीस प्रत्यारोपण प्रदर्शन कर सकते हैं. इस अवधि के दौरान भ्रूण चरण 20-22 से प्रगति करेगा. चेहरा प्रत्यारोपण को पूरा करनेचरण 21 या 22 पर है परिणामों को प्रभावित नहीं करता है. (चरणों 22-26 पर) बाद प्रत्यारोपण किया लेकिन शिखा से मुक्त ई. midline क्षेत्र चेहरे में कपाल तंत्रिका शिखा कदम के रूप में संकुचित है के रूप में और अधिक मुश्किल हो जाता है किया जा सकता है. प्रत्यारोपण भर में स्थिरता के लिए महत्वपूर्ण है.
6. चेहरा प्रत्यारोपण के बाद आपरेशन वसूली
- हीलिंग आम तौर पर 2-3 घंटे लगते हैं. कांच पुलों जगह में दाता ऊतक रखने के साथ उनकी मिट्टी गड्ढों में undisturbed कमरे के तापमान पर भ्रूण छोड़ दें.
- प्रत्यारोपण चंगा कर लें, ध्यान से, कांच पुलों को निकालने संदंश का उपयोग भ्रूण के आधार पर चारों ओर से मिट्टी हटाने, और एक प्लास्टिक धीरे उनके depressions के बाहर भ्रूण निर्वात हस्तांतरण विंदुक स्नातक की उपाधि प्राप्त का उपयोग करें.
- आधा gentamycin साथ स्वच्छ 0.1x एमबीएस से भरा एक उचित लेबल पेट्री डिश में भ्रूण रखो.
- वे w, चरण 40 में मेढक मंच खिला पहुँचने तक कई दिनों के लिए 15 डिग्री सेल्सियस या 18 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण बढ़ोमुर्गी चेहरे phenotypes रन बनाए जा सकते हैं.
- Gentamycin साथ 0.1x एमबीएस समाधान दैनिक परिवर्तित किया जाना चाहिए, और किसी भी मृत भ्रूण अन्य भ्रूण के प्रदूषण और मृत्यु को रोकने के लिए तुरंत हटाया जाना चाहिए.
- मुंह चरण 40 बजे खुलता है. चरण 40-41 में, एक प्रतिरोपित ऊतकों इसके प्रतिदीप्ति देखने के द्वारा जगह में चंगा रहता है कि जांच होगी. प्रत्यारोपण कभी कभी बाहर आते हैं, तो एक सब रन भ्रूण जगह में दाता ऊतक है कि यह सुनिश्चित करना चाहिए.
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Representative Results
चित्रा 2Bc रूप में दिखाया गया प्रतिरोपित ऊतकों पूरी तरह से, चित्रा 3 में दिखाया गया है प्रत्यारोपण के बाद मेजबान सिर में डाला, और उचित रूप से भ्रूण के चेहरे पर रखा एक गिलास पुल है किया जाना चाहिए. प्रत्यारोपण सफल होने के लिए प्रतिरोपित दाता ऊतक सही ढंग से, मेजबान खोलने के लिए आकार की जानी चाहिए. आंकड़े 3 बी और 3 सी के रूप में देखा ई. ऊतक, किसी भी तरह से, सिर से बहर नहीं होना चाहिए. चित्रा 3 डी में दिखाया गया है इसके अतिरिक्त, चेहरा प्रत्यारोपण, दाता शरीर में इसकी स्थिति के सापेक्ष घुमाया नहीं किया जाना चाहिए. कई घंटे के बाद, प्रत्यारोपित ऊतक और आसपास के चेहरे चंगा करना चाहिए, और उदाहरण के आंकड़े -4 ए और 4 ए में दिखाया गया है कि अगले दिन से, भ्रूण 'दिखाई देनी चाहिए. एक प्रत्यारोपण 4B चित्रा में जगह में रहता है, प्रतिदीप्ति के तहत, निरीक्षण कर सकते हैं. मंच पर 41, प्रत्यारोपित नियंत्रण ऊतक contr होगामुंह को ibute, और '4B चित्रा में देखा, हरी फ्लोरोसेंट रहेगा. बेफिक्र जंगली प्रकार भ्रूण की तुलना में जंगली प्रकार मेजबान टीम में प्रत्यारोपित जंगली प्रकार EAD ऊतक, सामान्य चेहरे को जन्म देना चाहिए. डिकिंसन और निर्णायक 5 के 3 चित्र में दिखाया गया है हालांकि, LOF या GOF दाता ऊतक के साथ, ठीक है और सिर में रहना चाहिए चेहरे, लेकिन इन या सामान्य craniofacial संरचनाओं को जन्म दे सकता है और नहीं.
| अभिकर्मक | सामग्री | निर्देश |
| एम 1 2 CaCl समाधान | प्रति लीटर 2 CaCl की 111 ग्राम | -20 या 4 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव और 1 मिलीलीटर aliquots में दुकान |
| 10x बार्थ खारा (एमबीएस) समाधान संशोधित | 880 मिमी NaCl, 51.4 ग्राम | आसुत जल के साथ 1 एल मात्रा समायोजित करें. NaOH के साथ 7.8 करने के लिए अंतिम पीएच को समायोजित करें औरफिर आटोक्लेव. |
| 10 मिमी KCl, 745.5 मिलीग्राम | ||
| 10 मिमी MgSO 4, 1.2 जी | ||
| 50 मिमी HEPES (पीएच 7.8), 11.9 ग्राम | ||
| 25 मिमी 3 NaHCO, 2.1 जी | ||
| 1x एमबीएस समाधान | अंतिम सांद्रता: | 1M 2 CaCl समाधान के 0.7 मिलीलीटर के साथ 10x एमबीएस लवण समाधान के 100 मिलीलीटर के मिश्रण से 1x एमबीएस समाधान तैयार करें. आसुत जल के साथ 1 एल मात्रा समायोजित करें. 0.5x एमबीएस और 0.1x एमबीएस बनाने के लिए इस समाधान पतला. |
| 88 मिमी NaCl | ||
| 1 मिमी KCl | ||
| 0.7 मिमी 2 CaCl | ||
| 1 मिमी 4 MgSO | ||
| 5 मिमी HEPES (पीएच 7.8) | ||
| 2.5 मिमी 3 NaHCO |
तालिका 1. अभिकर्मकों, सामग्री, और निर्देश.
| गर्मी | खींच | वेल. | समय |
| 800 | 70 | 40 | 50 |
तालिका 2. सुई खींचने सेटिंग्स *.
* सुई खींचने सेटिंग्स ताकि प्रत्येक प्रयोगशाला शायद अपने स्वयं सुई खींचने सेटिंग्स का अनुकूलन करने की आवश्यकता होगी मशीन से मशीन के लिए अलग अलग.
चित्रा 1. उपकरणों का इस्तेमाल किया. ए) लचीला टिप हटा दिया गया है के बाद). बी एक अक्षुण्ण, अखंड सुई और एक टूटी हुई सुई दिखाता है उनके सिरों को पूरी तरह सील कर दिया और गोल के साथ दो पिपेट उपकरण दर्शाया गया है. सी) तीन नमूना कांच पुलों दिखाता है. स्केल सलाखों = 1,000 मिमी.
.. चेहरा प्रत्यारोपण विधि का चित्रा 2 सारांश ए) जनरल प्रत्यारोपण योजना:.. चेहरा प्रत्यारोपण विधि का योजनाबद्ध एक भ्रूण 1 सेल मंच पर एक फ्लोरोसेंट एजेंट और एक antisense oligonucleotide morpholino इंजेक्शन के साथ कर रहे हैं. फ्लोरोसेंट एजेंट GFP mRNA, FITC टैग morpholino, या फ्लोरोसेंट dextran. बी हो सकते हैं. प्रकल्पित मुँह एक मेजबान जंगली प्रकार भ्रूण और एक दाता morphant भ्रूण से चरण 22 पर हटा दिया जाता है. प्रतिरोपित ऊतकों को भी सीधे मुंह क्षेत्र के ऊपर स्थित है जो प्रकल्पित नाक, शामिल करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है. दाता morphant ऊतक जंगली प्रकार मेजबान को प्रत्यारोपित किया जाता है, और फिर एक गिलास पुल के साथ जगह में सुरक्षित है. ग्रे आर्क: ग्रंथि अंडे सेने.
चित्रा 3. शीघ्र ही प्रत्यारोपण के बाद भ्रूण की योजनाबद्ध. ललाट दृश्य दिखाए जाते हैं. प्रतिरोपित ऊतकों लाल डॉट्स में उल्लिखित है. एक और एक 'चरण 22 पर एक आदर्श परिणाम को दर्शाती है. ऊतक पूरी तरह से डाला जाता है और सही ढंग से तैनात सिर में. बी और बी शो सिर में डाला ऊतक के अधिकांश के साथ कोई गलत प्रत्यारोपण 'आंशिक रूप से सिर. सी और सी में डाला ऊतक के साथ, एक गलत प्रत्यारोपण दिखाने', लेकिन है अतिरिक्त क्षेत्र चिकित्सा साइट से फैला हुआ है. इस ऊतक गल जाना, और आसपास, ठीक से डाला क्षेत्रों की चिकित्सा को रोकना. डी और डी 'शो दाता में अपनी स्थिति के सापेक्ष चेहरा मेजबान में घुमाया गया है, जहां एक अनुचित प्रत्यारोपण, करेंगे. टीइस मुद्दे को सिर में भर जाएगा, लेकिन चेहरे सामान्य रूप से विकास नहीं होगा. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 4. आदर्श परिणामों के साथ पुराने भ्रूण. ललाट दृश्य दिखाए जाते हैं. तटरक्षक: सीमेंट ग्रंथि, मो.:. मुंह ए)) चरण 32 ए 'में एक ठीक से चंगा प्रत्यारोपण दिखा, एक दिन प्रत्यारोपण के बाद एक भ्रूण प्रदर्शित करता है प्रतिरोपित ऊतकों जगह में रहता है, पुष्टि है कि एक फ्लोरोसेंट ओवरले के साथ इस एक ही भ्रूण दिखाता बी. ) कई दिन पहले एक नियंत्रण morpholino, GFP + प्रत्यारोपण किया था जो चरण 42 पर एक ही भ्रूण दिखाता है. चेहरा). बी 'ठीक से विकसित किया गया हैप्रतिरोपित ऊतकों सिर में रहता है और चेहरे की संरचना करने के लिए सामान्य रूप से योगदान दिया है कि इस बात की पुष्टि एक फ्लोरोसेंट ओवरले, साथ ही भ्रूण से पता चलता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
गंभीर कदम और सीमाएं: ई. चेहरा प्रत्यारोपण प्रक्रिया समय है और गहन काम करते हैं. यह सही करने के लिए अभ्यास, स्थिर हाथ, और निपुणता की आवश्यकता है. चेहरा प्रत्यारोपण प्रोटोकॉल कुशलता से हटाने और प्रत्यारोपण के ऊतकों को अनुसंधानकर्ता की क्षमता पर निर्भर करता है. एक मेजबान के चेहरे में प्रत्यारोपण डालने के लिए भी लंबे समय लेता है, तो मेजबान चेहरा अनुबंध और चंगा करने के लिए शुरू हो जाएगा. संदंश नाजुक चेहरे क्षेत्र का विस्तार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. महत्वपूर्ण घाव संकुचन आ गई है हालांकि, अगर प्रत्यारोपण के रूप में अच्छी तरह से ठीक नहीं होगा और मेजबान के चेहरे छेद में फिट करने के लिए आकार में कम होना पड़ सकता है. प्रत्यारोपण के आकार और आकार मोटे तौर पर सफल प्रविष्टि अनुमति देने के लिए, प्राप्तकर्ता के चेहरे गुहा के आकार के आकार से मेल खाना चाहिए.
मंच से मिलान कर रहे हैं कि भ्रूण के साथ, चरणों 19-22 के बीच प्रदर्शन किया जब अंकित प्रत्यारोपण सबसे सफल रहे हैं. चरणों 22-26 के बीच पुराने चेहरे प्रत्यारोपण, संभव हो रहे हैं, लेकिन और अधिक चुनौतीपूर्ण एक हैंशिखा मुक्त midline क्षेत्र चरण 22-26 से काफी संकरा हो जाता है के बाद से डी चेहरे के पक्ष में तंत्रिका शिखा प्रवास को बाधित कर सकते हैं.
प्रत्यारोपण के लिए बेहतर काम करने के लिए प्राप्तकर्ता और दाता दोनों समान चरणों में होना चाहिए. आदर्श रूप में, वे एक ही मंच होना चाहिए, और न्यूनतम एक दूसरे के कुछ ही घंटों के भीतर होना चाहिए. Antisense शाही सेना morpholino oligonucleotides ("morphants") के साथ इंजेक्शन भ्रूण कभी कभी अधिक धीरे जंगली प्रकार से विकसित या morphant भ्रूण को नियंत्रित, morphants जंगली प्रकार भ्रूण 'चरणों मिलान करने के लिए एक उच्च तापमान पर उगाया जा कि जरूरत पड़ेगी.
दाता चेहरे ऊतक अन्यथा चेहरा सामान्य रूप से विकास नहीं होगा, दाता भ्रूण में अपनी मूल स्थिति में मेजबान शरीर सापेक्ष में घुमाया नहीं किया जाना चाहिए. सीमेंट ग्रंथि काम करने के लिए प्रक्रिया के लिए चेहरा प्रत्यारोपण में शामिल होने की जरूरत नहीं है, यह चेहरा बिना सामान्य रूप से विकसित करता है. हालांकि, सीमेंट ग्रंथि अक्सर टी में शामिल हैयह प्रत्यारोपण के नीचे से संकेत मिलता है और स्थिति के लिए एक अलग मार्कर के रूप में कार्य करता है क्योंकि वह चेहरे ऊतक extirpated. इस मार्कर accidently प्राप्तकर्ता के लिए चेहरे के ऊतकों के स्थानांतरण के दौरान ऊतक घूर्णन से बचने में मदद मिलेगी. प्रत्यारोपण मेजबान चेहरे में गलत तरीके से डाला गया है, तो दाता ऊतक हटा दिया है और त्याग किया जा सकता है. उद्घाटन कसना शुरू नहीं हुई है, तो एक, एक ही मेजबान में एक नया प्रत्यारोपण सम्मिलित करने का प्रयास कर सकते हैं. मेजबान उद्घाटन काफ़ी सिकुड़ गई है हालांकि, अगर, तो मेजबान त्यागें और नए सिरे से शुरू करते हैं.
प्रत्यारोपण उपचार के दौरान मेजबान के सिर में आयोजित किया जाता है, ताकि यह प्रत्यारोपित चेहरे पर सीधे गिलास पुल स्थान के लिए महत्वपूर्ण है. प्रत्यारोपण के स्थान पर आयोजित नहीं किया जाता है, प्रत्यारोपण के मेजबान के चेहरे से extruded किया जा सकता है. पूरी तरह से चेहरे में डाला या कि उपचार के दौरान बाहर पॉप नहीं कर रहे हैं कि प्रत्यारोपण नेक्रोसिस से गुजरना होगा. यहां तक कि सही प्रत्यारोपण में, ऊतक मौत की थोड़ी मात्रा किनारों ओ आसपास घटित हो सकता हैच प्रत्यारोपण. आमतौर पर यह प्रतिकूल प्रभाव पैदा नहीं करता है और एक पूरी तरह से सामान्य चेहरा अभी भी गठित किया जा सकता है. सफल नियंत्रण में हम cartilages सामान्य रूप से गठन किया और ऊतकों की अस्वीकृति कि दुर्लभ है, सुझाव है कि विकास के चार सप्ताह बाद किसी भी कुरूपता नहीं मनाया है.
एक morpholino सामान्य घाव भरने के लिए आवश्यक एक प्रोटीन perturbs अगर प्रत्यारोपित LOF ऊतक मेजबान सिर में शामिल नहीं किया जा सकता है के रूप में अंत में, इस तकनीक काम नहीं कर सकते.
संभावित संशोधन और मुसीबत शूटिंग: संशोधन की प्रक्रिया को बनाया जा सकता है. अभ्यास के साथ, शोधकर्ता उदाहरण के लिए छोटे क्षेत्रों, ई. के आधा प्रत्यारोपण सीख सकते हैं. उथला चीरों अबाधित गहरी अन्तर्जनस्तर छोड़ने, बहिर्जनस्तरीय प्रत्यारोपण अनुमति देते हैं. भ्रूण ऊतक के अन्य क्षेत्रों के समान दृष्टिकोण का उपयोग कर, प्रत्यारोपित किया जा सकता है.
प्रतिरोपित ऊतकों प्रविष्टि के बाद मर जाता है, पी के एक जोड़े हैंossible कारण बनता है. पूरी तरह से मेजबान में डाला या उचित रूप से एक गिलास पुल के साथ जगह में आयोजित नहीं है कि प्रतिरोपित ऊतकों, समुचित उपचार मरने और रोकना होगा. पूरी तरह प्रत्यारोपित ऊतक डालने और एक गिलास पुल के साथ जगह में सुरक्षित करने के लिए सुनिश्चित करें. प्रत्यारोपण एक morpholino या शाही सेना इंजेक्शन दाता से ली गई है, तो ऊतक इंजेक्शन एजेंटों से कारण विषाक्तता से मर सकते हैं. मेजबान भ्रूण morphants या आरएनए इंजेक्ट कर रहे हैं और अक्सर मरने इसी प्रकार, यदि तब morpholino या शाही सेना की मात्रा कम करने की आवश्यकता होगी. इन समस्याओं को हल करने के लिए, इंजेक्शन शाही सेना या morpholino की राशि टाइट्रेट और सफल चेहरा प्रत्यारोपण के लिए एक सुरक्षित राशि का निर्धारण. अंत में, 0.1x ऊपर एमबीएस समाधान के नमक एकाग्रता बढ़ाने के भी चिकित्सा सहायता कर सकते हैं.
महत्व: वर्णित चेहरा प्रत्यारोपण तकनीक craniofacial विकास के दौरान स्थानीय आवश्यकताओं और जीन उत्पादों की गतिविधि का विश्लेषण की अनुमति देता है. इस दृष्टिकोण सी स्पष्ट कर सकते हैंविकासशील noncrest, तंत्रिका शिखा, और आसपास के ढांचे के बीच gnaling. यह एक किसी एक प्रमोटर संचालित निर्माण के साथ संभव नहीं है, जो सभी EAD व्युत्पन्न ऊतकों में LOF या (किसी भी रणनीति का प्रयोग करके) GOF की जांच करने के लिए अनुमति देता है. ऊतक प्रत्यारोपण का एक लंबा इतिहास विकासात्मक जीव विज्ञान में नहीं है हालांकि इस मेंढ़कों में craniofacial विकास का अध्ययन करने के लिए प्रत्यारोपण के पहले आवेदन है और यंत्रवत अध्ययनों 7 के लिए महत्वपूर्ण है. इस प्रकार की तकनीक हड्डीवाला चेहरे की patterning और गठन को नियंत्रित करने के जटिल तंत्र को जानने के लिए और craniofacial विकास संबंधी दोषों के कारणों को स्पष्ट करने में मदद कर सकते हैं.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम मेंढक पशुपालन और भ्रूण तैयार करने के साथ सहायता के लिए उनकी मदद के लिए Radek Sindelka, और कैस Bresilla धन्यवाद. इस काम एचएलएस लौरा Jacox को अनुदान R01DE021109 के माध्यम से NIH द्वारा वित्त पोषित किया गया हार्वर्ड विश्वविद्यालय में हर्शेल स्मिथ ग्रेजुएट फैलोशिप और एक F30 व्यक्ति फैलोशिप अनुदान F30DE022989-01 NIDCR के माध्यम से वित्त पोषित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pasteur pipette | VWR | 14672-400 | Lime Glass |
| Size 5 3/4 in | Cotton Plugged | ||
| Graduated Transfer Pipette | VWR | 16001-180 | Disposable |
| #5/45 forceps | Fine Science Tools by Dupont medical | 11251-35 | Angled 45° |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-20 | Straight; serrated tip; stainless steel |
| Capillary Tubing (for needles) | FHC | 30-30-1 | Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID/Fiber |
| Cover slip | VWR | 48393 252 | 24 x 60 mm micro cover glass; |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 | |
| Needle Puller | Sutter Instrument Co | Needle Puller: discontinued Filament: FB300B | The most similar, currently available needle puller is the P-97. For filaments, use Sutter 3.00 mm square box filaments, 3.0 mm wide. |
| Model P-80 | Flaming / Brown micropipette puller | ||
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Stereomicroscope Lighting by Fostec | Fostec | Use a light box with 2 fiberoptic arms. | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | Jaw Opening Diameter: 0-1 mm |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Jaw opening Diameter: 0-1 mm |
| Tungsten Needles | Fine Science Tools | 10130-05 | 0.125 mm Rod diameter |
| Van Aken Plastalina | Blick | #33268-2981 | |
| Modeling Clay- white, red, or yellow | |||
| mMessage mMashine SP6 or T7 Kit | Ambion | AM1340 |
References
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