Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Ansikts transplantasjoner i doi: 10.3791/50697 Published: March 26, 2014
* These authors contributed equally

Summary

En teknikk for å transplantere "Extreme Anterior Domain" ansikts vev mellom Xenopus laevis embryoer har blitt utviklet. Vev kan flyttes fra en genekspresjon bakgrunn inn i en annen, slik at undersøkelse av lokale krav til kraniofacial utvikling og for signalisering interaksjoner mellom ansikts regioner.

Abstract

Kraniofaciale misdannelser oppstår hos 1 av hver 700 levendefødte, men etiologi er sjelden kjent på grunn av begrenset forståelse av kraniofaciale utvikling. For å identifisere hvor signalveier og vev opptre under fordelingen av utviklings ansiktet, har en "ansiktstransplantasjon" teknikken er utviklet i embryoer fra frosken Xenopus laevis. En region av presumptive ansiktsservietter (det "Extreme Anterior Domain" (EAD)) blir fjernet fra en donor embryo ved tailbud stadium, og transplanteres til en verts embryo av samme fase, hvorfra det tilsvarende region er blitt fjernet. Dette kan brukes til å generere et kimært ansikt der verten eller donorvev har en tap eller vinning av funksjon i et gen, og / eller omfatter en avstamning etikett. Etter at helbredelse er resultatet av utviklingen overvåkes, og indikerer rollene til signalveien inne i donor-eller liggende vertsvevet. Xenopus er et verdifullt modell for ansikts utvikling, idet ansikts-området er stort og lett enccessible for micromanipulation. Mange embryoer kan analyseres i løpet av en kort tidsperiode, siden utviklingen skjer raskt. Funn i frosken er relevant for menneskelig utvikling, siden kraniofaciale prosesser vises konservert mellom Xenopus og pattedyr.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

For å forstå mekanismene bak kraniofaciale misdannelser 1-2, viktige vev og deres signal bidrag under kraniofaciale utvikling må identifiseres. I frosken Xenopus laevis, en del av ansiktet, inkludert munn og nesebor skjema fra "Extreme Anterior Domain" (EAD), hvor ektoderm og endoderm er direkte sammenstilt 3-4. Den EAD fungerer også som et signalsenter å påvirke omkringliggende vev, inkludert kranie neural crest, som danner kjevene og andre ansikts regioner fem. For å identifisere genene som bidrar til EAD funksjon, ble et "ansikt transplantasjon" teknikken utviklet, hvor vevet er transplantert fra en donor til en verts embryo, etter fjerning av de tilsvarende verts region. Etter transplantasjon, fører ansikts utvikling vurderes. Således er effekten av tap av funksjon (LOF) eller gevinst av funksjon (GOF) for et bestemt gen i EAD analysert lokalt, der resten av head og kropp er sammensatt av villtype vev. Den gjensidige transplantasjon kan utføres, hvor vill type vev er transplantert inn embryoer med global LOF eller GOF i bestemte gener. Transplantasjon har blitt hyppig brukt i Xenopus og dama studerer seks. For eksempel har Xenopus transplantasjon adressert homogenetic nevrale induksjon, linse og nevrale kompetanse, og neural crest migrasjon 7-10. Vaktel-chick kimert pode har analysert utviklingen av fremre nevrale plate, anterior neural rygg, neural crest, og kraniebein 11-14. Dette er den første transplantasjon teknikk for studier av kraniofaciale utvikling i Xenopus. Denne teknikken har vist en roman rolle for Wnt hemmere Frzb1 og Crescent i å regulere basalmembran formasjonen i presumptive munnen fem. Xenopus laevis er en ideell modell for studier av kraniofaciale utvikling som embryoer er store, utvikle eksternt, ennd ansiktet er lett synlig, slik at micromanipulation og avbildning av utvikling. Mekanismene bak ansikts utvikling vises bevart, noe som indikerer at funn som er gjort i frosken gi innsikt i menneskelig utvikling 4,15-16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En. Forbereder Reagenser

  1. 10x MBS: Forbered en L av 10x Modified Barth Saline (MBS) løsning 17. Se Tabell 1, reagenser, ingredienser og instruksjoner. Bruk destillert vann for alle løsninger. Bland i et begerglass under anvendelse av en rørestav, inntil fullstendig oppløsning. Alle løsningene bør bli gjort ved romtemperatur.
  2. 1x MBS: Fortynn 100 ml 10x MBS-løsning i 900 ml destillert vann for å lage en L av 1x MBS. Til 0,7 ml med 1 M CaCl 2 løsning.
  3. 0.1x MBS: Tynn 1x MBS å forberede en L av 0.5x MBS løsning og to L av 0.1x MBS løsning. Til 1 l av 0,1 x MBS løsning, tilsett 1 ml 10 mg / ml gentamycin løsning. Den 0.1x MBS løsning med gentamycin skal brukes til langsiktig embryo kultur.
  4. Ficoll / MBS: til 15 g Ficoll 400 til 500 ml av 0,5 x MBS-løsning. Bland kraftig. Legg oppsikt bar og bland til Ficoll er helt oppløst (flere timer).
  5. 70% etanol: Fortynn 100% etanol til 70% etanol ved hjelpdestillert vann.

2. Klarglassdriftsverktøy

  1. Needle forberedelse: Load kapillarrør inn en nål avtrekker.
    1. Trekk nålene i henhold til innstillingene som er vist i Tabell 2: Nål avtrekker innstillinger. Innstillingene er for en Sutter Instrument Co Modell P-80/PC mikropipette avtrekker og kapillær produksjonsrør, som beskrevet i tabellen over spesifikke reagenser og utstyr. Men disse innstillingene er spesifikke for Sutter nål avtrekker, og må justeres for andre maskiner. Innstillinger kan bestemmes ved hjelp av en rampe test, som angitt av maskinprodusenten.
    2. Trekk 4-6 nåler i forberedelse for prosedyren. Nålene skal brytes, slik at den fleksible, hår-lignende del av glasset spissen er helt fjernet, som vanligvis er 2-3 mm lange. Spissen må være forholdsvis stivt, men likevel er smalt nok til å brukes som et skjæreverktøy. Se bilde av en ideell nål i figur 1A. Oppbevar nålene i en petriskål med en strimmel av leire i midten. Trykk på akselen av hver nål inn i leire, for å holde den på plass, og for å holde den skjøre skarpe spissen bort fra bunnen og sidene.
  2. For flere verktøy, skaffe glass dekkglass, et par lange standardmønster tang, en gassbrenner, og 3-4 glass Pasteur pipetter (str. 5 ¾ tommer).
  3. Pipette-verktøyet vil foreta en pipette verktøyet, tenne Bunsen-brenner og plassere spissen av en glass Pasteur-pipette inn i den blå del av flammen samtidig som roterer den, slik at spissen smelter og hullet helt tetninger, og danner en lukket, avrundet ende . Den avrundede, forseglede spiss blir senere brukt til å lage fordypninger i leire fatet som holder embryoene under operasjonen. Se figur 1B.
  4. Glass broer: Å lage glass broer, bruker lang standardmønster pinsett til å nøye bryte av 3 mm ved 3 mm biter av dekkglass glass. Mens du holder planken av dekkglass med tweezers, plasserer glasset i flammen til alle fire kanter mykne og kurve nedover, danner en liten glasskuppel. Kantene skal ikke lenger være skarp. Se figur 1C.
  5. Oppbevar glassdekselstrimmel broer ved å sette dem, kanter ned, til modellering leire, fôr bunnen av en petriskål. Sett broene slik at toppen av broen forblir over leireoverflaten. Ikke dytt for hardt slik at brua pauser, og ikke fullt legge brua inn i leire, fordi det kan være vanskelig å fjerne. Etter sterilisering med en flamme eller 70% etanol, kan broene brukes på nytt fra eksperiment til eksperiment.

Tre. Forberedelse til Embryo Operation

  1. Linje en liten 60 mm plast petriskål med modelleire. Mellom anvendelser, er fatet og leire overflaten grundig vasket med destillert vann og deretter med 70% etanol.
    MERK: Bruk rød, hvit eller gul, Van Aken Plastalina modellering leire, som kan kjøpes på et lokale tily eller kunst butikken. Svart leire anbefales ikke fordi det frigjør en rest.
  2. Fyll formen med 3% Ficoll 0.5x MBS løsning. Jo høyere saltkonsentrasjon hindrer vev dissosiasjon, og polysakkaridet Ficoll bidrar til å fortykkes oppløsningen, noe som hjelper til å holde ansikts i posisjon.
  3. Bruk flammet Pasteur pipette verktøy (se figur 1) for å gjøre grunne, 2-3 mm forsenkninger i leire, omtrent dybden av en scene 20 embryo legeme. Kontroller 20-30 depresjoner, 1-2 mm fra hverandre, på hver sin side av skålen, slik at det er en total av 40 til 60 fordypninger. Merk av et side LOF / GOF, og den andre siden villtype, med å riste initialer inn i leire med pinsett.

4. Tidligere operasjon Embryo Forberedelse

  1. Få tak i og kultur Xenopus laevis embryoer ved hjelp av standard metoder 17. For en detaljert beskrivelse av frosk driften, kan du se Sive et al. 17
    1. Førti-åtte timer før forsøket obtai egg fra kvinnelige frosker og utføre in vitro fertilisering.
    2. Injiser 0,5-1 ng av avkortet membran GFP mRNA, samt hvilken som helst ønsket mRNA-eller anti-sense morfolino-modifiserte antisense oligonukleotider ("Morpholinos") ved en cellestadiet, eller i 2-celler ved 2-cellestadiet. Den ene celle stadiet varer ca 70-90 min. Injiser et totalt volum på 1-3 nl. I stedet for RNA som koder for et fluorescerende protein (for eksempel GFP eller RFP RNA), kan man injisere FITC-merket morfolino eller fluorescensmerkede dekstran. Fluorescens er viktig for å avgjøre om det transplanterte vevet helbreder og er fortsatt i hodet.
    3. Avkortet mRNA kan fremstilles fra et linearisert plasmid ved hjelp av en mMessage mMachine SP6-eller T7 kit. Morpholinos kan utformes og bestilles gjennom Gene Tools LLC. Mengden morfolino som kreves for en ønsket effekt, må bestemmes for hvert gen 18..
    4. Oppbevar de injiserte embryoer ved 15 ° C i 48 timer, før de når stadium 19-20. (Feller alle etterfølgende trinn, scene embryo i henhold til Normal tabell over Xenopus laevis av Nieuwkoop og Faber 19.)
      MERK: På dagen for operasjonen, må både mottaker-og giver embryoer være innenfor ett stadium av hverandre for transplantasjoner for å fungere optimalt. Men embryoer injisert med Morpholinos ("morphants") noen ganger utvikle saktere enn villtype eller kontrollere morphant embryo, noe som gjør det nødvendig å koordinere forsøkene så både morphant og villtype embryoer er på samme stadium. Morphants kan trenge å bli holdt ved en høyere temperatur i 12-24 timer før prosedyren. For å øke sannsynligheten for at embryoene kan bli funnet i det samsvarende fase, kan embryoene bli opprettholdt ved en rekke temperaturer. Tjuefire timer før forsøket, bør man dele embryoene inn en flere retter, og plassere morphants på 18-20 ° C og villtype embryoer ved 15-18 ° C.
  2. På dagen for transplantasjon forsøket, remove embryoene fra the15 ° C inkubator og iscenesette dem i henhold til Nieuwkoop og Faber 19. Hvis de er yngre enn sen neurula (trinn 19), la dem stå ved romtemperatur i 1-2 timer, inntil de når trinn 19..
  3. Screen injiserte embryoene i fluorescerende mikroskop. Velg embryoer som viser uniform, lyse fluorescens for forsøket.
  4. Fjern rot og mulige forurensninger i nærheten av betjeningsområdet. Tørke over betjeningsflate, stereomikroskop og alle verktøy med 70% etanol.
  5. Når embryoene er på scenen 19, fjerne vitelline membranen ved hjelp av # 5/45 Dumont tang under et stereomikroskop.
    1. Fjern vitelline membran av 20-30 av hver av donor-og vertsembryoer.
    2. For de første ansiktstransplantasjon eksperimenter, bør man øve med noen embryoer for hver tilstand. Denne metode er vanskelig og krever nøye praksis før den kan brukes i større skala, raskt og effektivt. Man kan arbeide up for å gjøre 20 transplantasjoner / eksperiment.
  6. Beveg vertsembryoer inn i operasjons fatet ved hjelp av en plast gradert overføringspipetten med spissen avskåret slik at åpningen er mye større enn et embryo (minst noen få millimeter). Vær nøye med å unngå å berøre embryoer til bobler eller vannoverflaten, som embryo vil eksplodere i overflatespenningen.
  7. Bruk # 5/45 pinsett til å sette inn embryoene inn i leire depresjoner, med den bakre av embryoet i leire. Lukke forsiktig leire rundt flere forskjellige embryoet ved hjelp av tenger, slik at den øverste fjerdedel av embryoet, hodet, som stikker ut av depresjon.
  8. Når alle verts embryoer er sikret i sine depresjoner, flytte til den andre siden av platen og begynne å sette inn donor embryoer i sine depresjoner. Gjenta prosessen med å sikre embryoene i sine brønner.

5. Utføre Face Transplant Surgery

  1. Cutting kniv: Som en skjærekniv for fjerningav donor EAD vev, bruke en hensiktsmessig knust glass kapillær nål (se trinn 2.3 og figur 1).
    MERK: Man kan direkte holde kapillær mellom fingrene (dette fungerer godt for folk med små hender), eller man kan montere nålen i et insekt pinneholderen. Electrosharpened wolfram nåler 17 som er lagt inn i en pinneholderen kan brukes i stedet for et kapillarrør nål. Vennligst se foreslåtte pinneholdere og tungsten nåler i tabellen over spesifikke reagenser og utstyr.
  2. Under et stereomikroskop, stikk nålen inn i hodet på fosteret til venstre for sement kjertel. Kanylen bør være satt dypt, slik at den passerer fra utenfor fosteret, gjennom hodet og inn i det forutgående. For å transplantere hele EAD, bør kutt strekker seg fra utsiden av embryoet til forutgående. For ektoderm-bare transplantasjoner, bør kuttene være grunnere og utvide bare gjennom Ektoderm.
    1. Flikk nålen fra venstre til høyre side avhodet, over hele bredden av sementkjertel. Den flicking er viktig som bevegelse gir et rent kutt. Se figur 2A for en oppsummering av teknikk og Figur 2B for en demonstrasjon av kuttene. Sementen kjertel og øynene er viktige landemerker for kuttene. Rekkefølgen av kuttene ikke påvirke utfallet og kan variere basert på brukerens preferanser eller handedness.
  3. Plasser nålen ved begynnelsen av den foregående snitt ved den venstre kant av sementkjertel, og sveip nålen oppover til den når bunnen av det venstre øyet. Dette vil skape et vertikalt snitt av den venstre kant av sementkjertel til bunnen av det venstre øyet.
  4. Plasser nålen i rett kant av sementkjertel, og sveip nålen oppover til den når bunnen av høyre øye. Dette vil skape et vertikalt snitt fra høyre kant av sementkjertel til bunnen av det høyre øye.
  5. For å få fullt avgiftsdirektoratet vevet, Flick nålen fra bunnen av det venstre øyet til bunnen av det høyre øye, og skaper et horisontalt snitt som vil frigjøre vevet. Kutt kan strekke seg fra utsiden av embryoet til forutgående, inkludert både ektoderm og endoderm på EAD eksplantering. Alternativt kan grunt kutt benyttes til ektoderm-bare EAD transplantasjoner. Når EAD vev er fjernet, bør det være et rektangulært hull fra utsiden av embryoet inn i forutgående, som strekker seg fra sement kjertel til rett under øynene (topp til bunn). Hullet bør strekke seg fra den innvendige kanten av den venstre øyet til den innvendige kanten av den høyre øye (side til side). Se figur 2BB.
  6. Skyv excised vev på spissen av nålen, og løfte den gjennom buffer til den delen av fatet som inneholder vertsembryoer. Ikke utsett vevet til overflaten luft eller det vil bli skadet.
  7. Avgifts samme vevet fra verten embryo, som for donoren. Kast verts EAD eksplantering eller lagre det på innrykkett inn i donor ansiktet, for gjensidige transplantasjoner.
  8. Sett donor eksplantering inn den resulterende verts hullet med # 5/45 tang.
  9. Når donorvevet blir riktig plassert og satt helt inn, omhyggelig plassere en glassbroen (se figur 1 og figur 2BC) over fosteret ansikt for å holde transplantatet på plass. Endene av broen skal sette inn i leire, som holder den på plass. Broen bør forsiktig legge trykk på det transplanterte vev, slik at transplantasjon ligger i flukt med vertshodet, uten at det stikker ut av hodet eller ligger dypt inne i hodet. Hodet kan være litt flat etter dekkglass, men vær forsiktig så du ikke skader fosteret med for mye press. Transplantasjoner bør utføres innen fem minutter.
    MERK: En erfaren etterforsker kan utføre rundt tjue transplantasjoner per forsøk, over 2-3 timer. I denne perioden embryoene vil fremgangen fra fasen 20-22. Fullføre ansiktstransplantasjons på scenen 21 eller 22 påvirker ikke resultatene. Senere transplantasjoner (på etapper 22-26) kan gjøres, men er mer vanskelig som crest-fri EAD midtlinjen regionen er redusert som kranie neural crest flytter inn i ansiktet. Konsistens på tvers transplantasjoner er kritisk.

6. Face Transplant Post-drift Recovery

  1. Healing tar vanligvis 2-3 timer. La embryoene ved romtemperatur uforstyrret i sine forsenkninger leire med glass broer holder donorvev på plass.
  2. Når transplantasjoner har helbredet, forsiktig fjerne glassbroer, fjerne leire fra rundt bunnen av embryoene som bruker pinsett, og bruk en plast uteksaminert overføringspipetten å forsiktig støvsuge embryoene ut av sine depresjoner.
  3. Sett embryoene til en hensiktsmessig merket petriskål, halvveis fylt med rene 0.1x MBS med gentamycin.
  4. Grow embryoene ved 15 ° C eller 18 ° C i flere dager før de når fôring rumpetroll scenen på scenen 40, whøne ansikts fenotyper kan scores.
    1. Den 0,1 x MBS løsning med gentamycin bør skiftes daglig og noen døde fostre bør fjernes raskt for å unngå forurensning og døde av andre embryoer.
    2. Munnen åpnes på scenen 40. På scenen 40-41, må man sjekke at det transplanterte vevet forblir helbredet på plass ved å vise sin fluorescens. Transplantasjoner og til faller ut, så man må sørge for at alle scoret embryoer har donor vev på plass.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Transplantert vev skal settes helt inn i vertshodet etter transplantasjon, som vist i figur 3A, og har en glass-broen hensiktsmessig plassert på embryo ansikt, som vist i figur 2BC. Den transplanterte donorvevet må være riktig dimensjonert for verten åpning, for transplantasjon for å være vellykket. Den EAD vevet bør ikke stikker ut fra hodet, i en hvilken som helst måte, som vist i figurene 3B og 3C. I tillegg bør ansikt transplantasjon ikke roteres i forhold til sin posisjon i giverkroppen, slik det er vist i figur 3D. Etter flere timer, bør det transplanterte vev og omkringliggende ansikt leges, og ved neste dag, bør embryoet vises som eksempel vist i figurene 4A og 4A '. Man kan observere, i henhold til fluorescens, at transplantatet holder seg på plass i figur 4B. Ved stadium 41, vil det transplanterte vev styre Contribute i munnen, og vil forbli fluorescerende grønt, sett i figur 4B ". Villtype EAD vev transplantert inn i villtype verter bør gi opphav til normale flater, sammenlignet med uaffisert villtype embryoer. Men med LOF eller GOF donorvev, vender skal gro og forbli i hodet, men dette kan eller ikke kan gi opphav til normale craniofacial strukturer, slik som vist i figur 3 av Dickinson and Sive 5.

Reagens Ingredienser Instruksjoner
1 M CaCl 2 Solution 111 g CaCl 2 per liter Autoklav og oppbevar i en ml deler på -20 eller 4 ° C.
10x Modifisert Barth Saline (MBS) Løsning 880 mM NaCl, 51,4 g Juster volumet opp til 1 liter med destillert vann. Juster endelige pH til 7,8 med NaOH ogderetter autoklav.
10 mM KCl, 745,5 mg
10 mM MgSo4, 1,2 g
50 mM HEPES (pH 7,8), 11,9 g
25 mM NaHCO3, 2,1 g
1x MBS Solution Endelige Konsentrasjoner: Forbered 1x MBS-løsning ved å blande 100 ml av 10x MBS salter løsningen med 0,7 ml av 1M CaCl 2 løsning. Juster volumet opp til 1 liter med destillert vann. Fortynn denne løsningen for å gjøre 0.5x MBS og 0.1x MBS.
88 mM NaCl
1 mM KCl
0,7 mM CaCl 2
1 mM MgSO 4
5 mM HEPES (pH 7,8)
2,5 mM NaHCO3

Tabell 1. Reagenser, ingredienser og instruksjoner.

Hete Trekk Vel. Tid
800 70 40 50

Tabell 2. Needle Puller Innstillinger *.

* Needle avtrekker innstillinger varierer fra maskin til maskin, så hver lab vil sannsynligvis trenge å optimalisere sine egne nål avtrekker innstillinger.

Figur 1
Figur 1. Verktøy som brukes. A) viser et intakt, ubrutt nål og en ødelagt nålen etter den fleksible spissen har blitt fjernet. B) skildrer to pipetter verktøy med sine ender fullstendig forseglet og avrundet. C) Viser tre eksempelglassbroer. Scale barer = 1,000 mm.

Fig. 2
.. Figur 2 Sammendrag av ansiktstransplantasjon metode A) Generelt Transplant Scheme:.. Skjematisk av ansiktet transplantasjon metoden et embryo blir injisert med en fluoriserende middel og en anti oligonukleotid morpholino ved en cellestadiet. Den fluorescerende agent kan enten være GFP mRNA, FITC-merket morpholino, eller fluorescerende dekstran. B.. Presumptive munn er fjernet på scenen 22 fra en rekke villtype embryo og en donor morphant embryo. Den transplanterte vev kan også bli utvidet til å omfatte den presumptive nese, som ligger rett ovenfor munningen region. Donor morphant vev transplantert til villtype-vert, og deretter festes på plass med en glass-broen. Grey arch: klekking kjertel. B) Eksperimentelle Betraktninger. en. Oppsummering av snittene som brukes til å fjerne ansiktet fra en donor embryo. For kirurgi i ansiktet, lage snitt en gjennom fire i orden. Dette er den foretrukne rekkefølge av kutt, men rekkefølgen av snittene kan variere. B.. Den resulterende donor er vist med ektoderm og endoderm fjernes fra forsiden, slik at det finnes en åpning fra utsiden av embryoet til forutgående. C.. Diagrammet viser ideelle plassering av glassbroen. Glass kontakter både transplantasjon og vert ansikt, trykke på EAD vevet inn i hodet til å motsette extrusive styrker fra sår sammentrekning under healing. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3 Figur 3. Skjematisk av embryoer kort tid etter transplantasjon. Visninger Frontal vises. Den transplanterte vev er beskrevet i røde prikker. A og A 'fremstiller det ideelle resultat at fasen 22.. Vevet blir riktig satt inn og riktig plassert i hodet. B og B 'viser feil transplantasjon, med vevet delvis satt inn i hodet. C og C' viser et uriktig transplantasjon med de fleste av vevet inn i hodet, men overflødig regionen stikker ut fra healing nettstedet. Dette vevet blir necrose og hemme helbredelse av de omkringliggende, riktig innsatt regioner. D og D 'viser en utilbørlig transplantasjon, hvor forsiden har blitt rotert i verten, i forhold til sin posisjon i donoren. Den tproblemet vil gro inn i hodet, men ansiktet vil ikke utvikle seg normalt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4 Eldre embryoer med ideelle utfall.. Visninger Frontal vises. CG: sement kjertel; mo:.. munnen A) Viser et embryo en dag etter transplantasjon, viser en skikkelig leget transplantasjon på scenen 32 A ') viser samme embryo med et fluorescerende overlegg, noe som bekrefter at det transplanterte vevet er fortsatt på plass B. ) Viser det samme embryo ved trinn 42 som hadde en styre morfolino, GFP + transplantasjon flere dager før. Ansiktet har utviklet skikkelig. B ')Viser samme embryo med et fluorescerende overlegg, noe som bekrefter at det transplanterte vevet forblir i hodet og har bidratt normalt til ansikts strukturer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kritiske trinn og begrensninger: Den EAD ansikt transplantasjon prosedyren er tid og arbeidsintensivt. Det krever øvelse, stødige hender, og fingerferdighet å perfeksjonere. Ansiktet transplantasjon protokollen er avhengig av forskerens evne til effektivt å fjerne og transplantasjon vev. Hvis man tar for lang tid å sette transplantasjon inn i vertens ansikt, vil verts ansiktet begynner å trekke seg sammen og helbrede. Tang kan brukes til å delikat utvide ansiktsregionen. Imidlertid, hvis større sår sammentrekning har funnet sted, transplantasjon vil ikke gro i tillegg, og kan ha behov for å bli redusert i størrelse til å passe inn i vertens ansikts hullet. Transplantasjonen størrelse og form må omtrent stemme overens med størrelsen og formen på mottakerens fasiale fordypning, for å tillate vellykket innsetting.

Face transplantasjoner er mest vellykket når utført mellom etapper 19-22, med embryoer som velges ut av scenen. Eldre ansikt transplantasjoner, mellom etapper 22-26, er mulig, men er mer utfordrende end kan forstyrre neural crest migrering inn i sidene av ansiktet fordi kam-fri midtlinjen regionen blir vesentlig smalere fra trinn 22-26.

Både mottaker og donor må være tilsvarende stadier for transplantasjon for å fungere optimalt. Ideelt sett bør de være av samme scene, og minimalt må være innen et par timer med hverandre. Embryoet injisert med anti-RNA morfolino oligonukleotider ("morphants") noen ganger utvikle saktere enn villtype eller kontrollere morphant embryoer, som krever at morphants dyrkes på en høyere temperatur for å matche de villtype embryo 'etapper.

Donoransiktsvevet ikke bør roteres i vertskroppen i forhold til dens opprinnelige posisjon i donor embryo, ellers ansiktet ikke vil utvikle seg normalt. Sementen kjertel trenger ikke å bli inkludert i ansiktet transplantasjon for prosedyren for å jobbe, ansiktet utvikler seg normalt uten. Imidlertid er sementkjertel ofte inkludert i tHan utryddet ansikts vev, fordi det fungerer som en tydelig markør for å indikere og posisjonere bunnen av transplantasjon. Denne markør vil bidra til å unngå uhell roterende vevet under overføringen av ansiktsvevet til mottakeren. Dersom transplantasjonen er blitt satt inn feil i verts ansikt, kan donorvevet blir fjernet og kastet. Man kan forsøke å sette inn en ny transplantasjon i samme vert, hvis åpningen ikke har begynt å innsnevre. Men hvis verten åpningen har merkbart krympet, deretter kaste verten og begynne på nytt.

Det er viktig å plassere glass-broen direkte på transplanterte side, slik at transplantasjon holdes i vertens hodet under helbredelsen. Ved transplantasjon ikke holdes på plass, kan transplantasjonen ekstruderes fra vertens ansikt. Transplantasjoner som ikke satt helt inn i ansiktet eller som dukker opp under healing vil gjennomgå nekrose. Selv i perfekt transplantasjoner, kan det forekomme små mengder vevsdød rundt kantene of transplantasjon. Vanligvis er dette ikke medfører skadevirkninger og en helt normal ansikt kan fortsatt bli dannet. I vellykkede kontroller har vi ikke observert noen misdannelser etter fire uker med utvikling tyder på at brusk dannet normalt og at avvisning av vev er sjeldne.

Til slutt, hvis en morfolino perturbs et protein som kreves for normal sårheling, denne teknikken kan ikke arbeide, da det transplanterte LOF vevet ikke kan bli inkorporert inn i vertshodet.

Mulige Modifikasjoner og feilsøking: Endringer kan gjøres til prosedyren. Med praksis, kan forskeren lære å transplantere mindre regioner, for eksempel halvparten av EAD. Grunne snitt tillate ectodermal transplantasjoner, forlater dypere endoderm uforstyrret. Andre regioner i embryonale vev kan transplanteres, med lignende tilnærminger.

Hvis den transplanterte vevet dør etter innsetting, er det et par av possible årsaker. Transplantert vev som ikke er helt inn i verten eller hensiktsmessig holdes på plass med en glassbro, vil dø og hindre riktig healing. Sørg for å fullt ut sette inn transplantert vev og fest den på plass med en glassbro. Ved transplantasjon er avledet fra en morfolino-eller RNA injisert donor, og deretter vevet kan dø på grunn av giftigheten av injiserte midler. Tilsvarende, hvis vertsembryoer er morphants eller RNA-injisert og ofte dør, da mengden av morfolino-eller RNA må bli redusert. For å løse disse problemene, titrere mengden injisert RNA eller morfolino og finne et trygt beløp for vellykkede ansiktstransplantasjoner. Til slutt, noe som øker saltkonsentrasjonen av løsningen MBS over 0,1 x kan også hjelpe helbredelse.

Betydning: Den ansiktstransplantasjon teknikken beskrevet tillater analyse av de lokale krav og aktivitet av genprodukter under kraniofaciale utvikling. Denne tilnærmingen kan avklare signaling mellom utviklings noncrest, neural crest, og omkringliggende strukturer. Det gjør det mulig å undersøke LOF eller GOF (ved hjelp av en strategi) på alle EAD-avledet vev, noe som ikke er mulig med en enkelt promoter drevet konstruere. Selv om det er en lang historie av vev transplantasjon i utviklingsbiologi dette er den første anvendelsen av transplantasjon til studiet av kraniofaciale utvikling i frosker og er avgjørende for mekanistiske studier syv. Således teknikken kan bidra til å løse de komplekse mekanismer som styrer fordelingen og dannelse av virveldyr ansiktet og for å klargjøre årsaker til craniofacial utviklingsdefekter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Radek Sindelka for hans hjelp, og Cas Bresilla for å bistå med frosk driften og embryo forberedelse. Dette arbeidet ble finansiert av NIH via tilskuddet R01DE021109 til HLS Laura Jacox ble finansiert av Herschel Smith Graduate Fellowship ved Harvard University og en F30 individuell stipendet F30DE022989-01 gjennom NIDCR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pasteur pipette VWR 14672-400 Lime Glass 
Size 5 3/4 in Cotton Plugged
Graduated Transfer Pipette VWR 16001-180 Disposable 
#5/45 forceps Fine Science Tools by Dupont medical 11251-35 Angled 45°
Standard Pattern Forceps Fine Science Tools 11000-20 Straight; serrated tip; stainless steel
Capillary Tubing (for needles) FHC 30-30-1 Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID/Fiber
Cover slip  VWR 48393 252 24 x 60 mm micro cover glass;
Ficoll 400 Sigma-Aldrich F9378
Needle Puller  Sutter Instrument Co Needle Puller: discontinued Filament: FB300B The most similar, currently available  needle puller is the P-97. For filaments, use Sutter 3.00 mm square box filaments, 3.0 mm wide.
Model P-80 Flaming / Brown micropipette puller
Stereomicroscope Zeiss
Stereomicroscope Lighting by Fostec Fostec Use a light box with 2 fiberoptic arms.  
Nickel Plated Pin Holder Fine Science Tools 26018-17 Jaw Opening Diameter: 0-1 mm
Moria Nickel Plated Pin Holder Fine Science Tools 26016-12 Jaw opening Diameter: 0-1 mm
Tungsten Needles Fine Science Tools 10130-05 0.125 mm Rod diameter
Van Aken Plastalina Blick #33268-2981
Modeling Clay- white, red, or yellow
mMessage mMashine SP6 or T7 Kit Ambion AM1340

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gorlin, R. J., Cohen, M., Levin, L. Syndromes of the head and neck. Oxford University Press. UK. (1990).
  2. Trainor, P. Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention. Am. J. Med. Gen. A. 152, 2984-2994 (2010).
  3. Dickinson, A. J., Sive, H. L. Development of the primary mouth in Xenopus laevis. Dev. Bio. 295, 700-713 (2006).
  4. Dickinson, A. J., Sive, H. L. Positioning the extreme anterior in Xenopus: cement gland, primary mouth and anterior pituitary. Sem. Cell Dev. Bio. 18, 525-533 (2007).
  5. Dickinson, A. J., Sive, H. L. The Wnt antagonists Frzb-1 and Crescent locally regulate basement membrane dissolution in the developing primary mouth. Dev. 136, 1071-1081 (2009).
  6. Gilbert, S. F. Developmental Biology. Sinauer Associates, Inc. Sunderland, MA. (2010).
  7. Borchers, A., Epperlein, H. H., Wedlich, D. An assay system to study migratory behavior of cranial neural crest cells in Xenopus. Dev. Genes Evol. 210, 217-222 (2000).
  8. Grunz, H. Homoiogenetic neural inducing activity of the presumptive neural plate of Xenopus laevis. Dev. Growth Differ. 32, 583-589 (1990).
  9. Servetnick, M., Grainger, R. M. Changes in neural and lens competence in Xenopus ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer. Dev. Bio. 112, 177-188 (1991).
  10. Servetnick, M., Grainger, R. M. Homeogenetic neural induction in Xenopus. Dev. Bio. 147, 73-82 (1991).
  11. Couly, G., Coltey, P., Le Douarin, N. The triple origin of skull in higher vertebrates: a study in quail-chick chimeras. Dev. 117, 409-429 (1993).
  12. Couly, G. F., Le Douarin, N. M. Mapping of the early neural primordium in quail-chick chimeras : I. Developmental relationships between placodes, facial ectoderm. 110, 422-439 (1985).
  13. Couly, G. F., Le Douarin, N. M. Mapping of the early neural primordium in quail-chick chimeras II. The prosencephalic neural plate and neural folds: Implications for the genesis of cephalic human congenital abnormalities. Dev. Bio. 120, 198-214 (1987).
  14. Lievre, A. L., Le Douarin, N. The early development of cranial sensory ganglia and the potentialities of their component cells studied in quail-chick chimeras. Dev. Bio. 94, 291-310 (1982).
  15. Kennedy, A., Dickinson, A. Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes. Dev. Bio. 365, 229-240 (2012).
  16. Trainor, P., Tam, P. Cranial paraxial mesoderm and neural crest of the mouse embryo- codistribution in the craniofacial mesenchyme but distinct segregation in the branchial arches. Dev. 121, 2569-2582 (1995).
  17. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
  18. Tandon, P., Showell, C., Christine, K., Conlon, F. Morpholino injection in Xenopus. Methods Mol. Biol. 843, 29-46 (2012).
  19. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). Garland Publishing. New York. (1994).
Ansikts transplantasjoner i<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryo
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jacox, L. A., Dickinson, A. J., Sive, H. Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos. J. Vis. Exp. (85), e50697, doi:10.3791/50697 (2014).More

Jacox, L. A., Dickinson, A. J., Sive, H. Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos. J. Vis. Exp. (85), e50697, doi:10.3791/50697 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter