Summary
Overview
Restriktionsenzyme oder Endonukleasen erkennen und schneiden spezifische DNA Sequenzen. Diese Enzyme treten in Bakterien als Abwehrsystem gegen Bakteriophagen auf – also Viren, die Bakterien infizieren. Restriktionsenzyme in Bakterien schneiden diese invasive Bakteriophagen-DNA, lassen aber die bakterielle DNA unangetastet weil dort Methylgruppen vorhanden sind.
Dieses Video erklärt die grundlegenden Prinzipien der Restriktionsenzyme, einschließlich der Nomenklatur von Restriktionsenzymen, der Art der Erkennungssequenzen und welche Überhangstrukturen vorkommen. Wir stellen auch eine allgemeine Schritt-für-Schritt Anleitung bereit wie man einen Verdau ansetzt, einschließlich der notwendigen Reagenzien, der Reihenfolge in der die Reaktion angesetzt werden soll, und die häufigsten Inkubationsdauern und Temperaturen. Wir erläutern außerdem, dass es wichtig ist die Reaktion zu inaktivieren um unspezifische Aktivität zu vermeiden. Außerdem geben wir Hinweise zu dem Ansetzen von Reaktionen mit mehreren Restriktionsenzymen und wie man Kontrollen in dem Verdau verwendet.
Procedure
Restriktionsenzyme, oder Restriktionsendonukleasen, werden in vielen verschiedenen molekularbiologischen Anwendungen benutzt. Diese Enzyme erkennen und schneiden eine spezifische DNA Sequenz, die auch Erkennungssequenz genannt wird. Dieses Video behandelt wie diese unglaublichen Moleküle funktionieren und wie man einen Verdau mit Restriktionsenzymen ansetzt.
Wo kommen Restriktionsenzyme eigentlich her? Diese Enzyme sind die Folge einer Anpassungsentwicklung von Bakterien und dienen der Abwehr von Viren, die auch Bakteriophagen genannt werden. Wegen den Methylgruppen, die an den Erkennungssequenzen der bakteriellen DNA angebracht sind, erkennen Restriktionsenzyme nur die Phagen-DNA und verhindern dadurch eine Infektion mit dem Virus.
Restriktionsenzyme haben komische Namen. Zum Beispiel HindIII, NotI, EcoRI und BamHI. Die ersten drei Buchstaben im Namen eines Restriktionsenzyms stehen für den Organismus von welchem es isoliert worden ist. Zum Beipiel wurde das Restriktionsenzym EcoRI von E.Coli isoliert. Der vierte Buchstabe, wenn er gebraucht wird, steht für den Bakterienstamm von welchem das Enzym isoliert worden ist. Die römischen Zahlen zeigen ob es das erste, zweite, dritte Enzym ist welches von dem Organismus isoliert worden ist.
Restriktionsenzyme erkennen eine Sequenz von Nukleotiden, die normalerweise vier bis acht Basenpaare lang sind und Erkennungssequenzen genannt werden. Das Enzym zerstört die Phosphodiesterbrücke im DNA Rückgrat an einer spezifischen Stelle in dieser Sequenz. Erkennungssequenzen sind normalerweise palindromisch, das heißt das die Sequenz die gleiche ist egal ob man sie von vorn oder hinten liest. Wenn sich die palindromische Sequenz auch auf dem komplementären DNA Strang befindet, nennt man es ein umgekehrt-wiederholtes palindromisches Element.
Das Schneiden mit Restriktionsenzymen kann in unterschiedliche DNA Endstrukturen resultieren: “klebrige Enden” haben 3’ und 5’ Überhänge, während “stumpfe” Enden keine Überhänge haben. Die Art der DNA Endstruktur bestimmt wie das DNA Fragment, das durch den Restriktionsverdau hergestellt wurde, mit anderen DNA Fragmenten zum Beispiel durch Ligation verbunden werden kann.
Ein Verdau mit einem Restriktionsenzym muss sorgfältig vorbereitet werden. Ein Verdau besteht normalerweise aus den folgenden Komponenten: destilliertem Wasser, der DNA die verdaut werden soll, dem Puffer den man für das Enzym braucht, und manchmal auch noch BSA oder Bovines Serumalbumin. BSA stabilisiert die Reaktion da es verhindert das das Enzym an dem Reaktionsgefäß kleben bleibt. Jedes Restriktionsenzym kann potentiell verschiedene Pufferbedingungen, Inkubationstemperaturen, und BSA Anforderungen haben. Die Hersteller von Restriktionsenzymen stellen normalerweise Informationen bereit, um die Reaktionsbedingungen zu überprüfen.
Um die Reaktion anzusetzen nimmt man das Restriktionsenzym aus dem Gefrierschrank oder dem Kühlschrank. Das Restriktionsenzym muss auf Eis oder in einem isolierten Behälter gelagert werden, um die optimale Aktivität für zukünftige Reaktionen zu erhalten. Nun pipettiert man die einzelnen Komponenten in folgender Reihenfolge in das Reaktionsgefäß: zuerst steriles, nukleasefreies Wasser, um ein Gesamtvolumen von 20 μl zu erreichen. Dann den 10X Restriktionsenzympuffer, BSA wenn es gebraucht wird, maximal 1 μg DNA und 2-10 Einheiten des Enzyms. Eine Einheit des Enzyms ist definiert als die Menge an Enzym, die man braucht um einen kompletten Verdau von 1 μg Kontroll-DNA in 60 min bei 37°C in einem 50 μl Reaktionsvolumen zu erreichen. Dann vermischt man die Reaktion mit dem Vortex und zentrifugiert sie kurz bei 12000g um den gesamten Inhalt am Boden des Reaktionsgefäßes zu konzentrieren. Dann inkubiert man die Reaktion in einem Heizblock bei der angegebenen Temperatur, normalerweise bei 37°C, für 1 bis 4 Stunden.
Wenn der Restriktionsverdau fertig ist, sollte man die Reaktion bei 65°C inkubieren, um das Restriktionsenzym durch Hitze zu deaktivieren. Restriktionsenzyme sind normalerweise sehr spezifisch, aber eine sehr lange Inkubationsdauer kann zu Starr-Aktivität führen, also dem Schneiden von Sequenzen, die nicht gleich, aber ähnlich wie die Erkennungssequenzen aussehen.
Nach der Inaktivierung sollte die DNA auf einem Agarosegel separiert werden, um zu schauen ob der Verdau funktioniert hat.
Hier sind eine Reihe von nützlichen Hinweisen für erfolgreiche Verdaue:
Manchmal kommt es vor das man mehrere Enzyme braucht um ein spezifisches DNA Fragment herzustellen. In diesem Fall muss man die Pufferbedingungen und Inkubationstemperaturen sorgfältig auf Kompatibilität überprüfen. Wenn ja, kann man den Verdau mit beiden Enzymen in einer Reaktion ansetzen. Manchmal jedoch sind die Reaktionsbedingungen nicht kompatibel und man muss die Verdaue sequentiell ansetzen. Der Verdau kann zum Beispiel mit einem Enzym zu erst gemacht werden. Danach kann man die Pufferzusammensetzung ändern um auch den zweiten Verdau unter optimalen Bedingungen anzusetzen. Ein anderer Weg um Pufferinkompatibilität aus dem Weg zu gehen ist das man die DNA nach dem ersten Verdau durch Gel-Aufreinigung isoliert und danach den zweiten Verdau ansetzt.
Kontrollen sollte man benutzen um zu verstehen weshalb ein Verdau nicht funktioniert. Zum Beispiel stellt man mit einer Kontrolle ohne Restriktionsenzym fest ob die DNA intakt ist oder Exonukleaseaktivität vorhanden ist. Mit Kontroll-DNA bestehend aus bekannten Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme prüft man die Aktivität des Enzyms.
Nun das wir gesehen haben wie man Verdaue ansetzt, schauen wir uns einige Anwendungen für Restriktionsenzyme an.
Restriktionsenzyme können diagnostisch verwendet werden um spezifische Proben zu identifizieren. Hier muss man den Verdau in einem spezialisierten Chip ansetzen und dann diesen Chip in eine Maschine, die Bioananalyzer genannt wird, platzieren. Forscher können anhand der Größe der DNA-Fragmente erkennen ob eine Fischprobe echt ist. Die verschiedenen Bandmuster des gleichen Gens von einer Art, oder hier von verschiedenen Arten, werden Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen genannt.
Restriktionsenzyme können auch für Subklonierungen benutzt werden, um DNA Fragmente von einem Plasmid in ein anderes Plasmid zu transferieren, so dass dieses Fragment in Bakterienzellen vermehrt werden kann.
Durch die Polymerasekettenreaktion, oder PCR, kann man Restriktionsenzyme an spezifischen Stellen eines Gens einfügen, um zu prüfen ob ein Einzelnukleotid-Unterschied in den verschiedenen Formen des gleichen Gens, auch Allel genannt, vorhanden ist. Es ist schwierig diese Einzelnukleotid-Polymorphismen, oder SNPs, nur durch PCR und Gelelektrophorese zu erkennen. Durch die Einführung einer Restriktionsenzymerkennungssequenz in dem SNP, kann man zwischen beiden Allelen unterscheiden.
Das war die Einführung in Restriktionsenzyme von JoVE. Hier habt ihr gelernt wo die Enzyme herkommen und wie sie funktionieren. Außerdem haben wir behandelt wie man einen Verdau ansetzt und welche Anwendungen es in der Molekularbiologie gibt. Wie immer – Danke für eure Aufmerksamkeit!
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