Summary
Dans cet article, nous introduisons rapide micro-iontophorèse de neurotransmetteurs comme une technique pour étudier l'intégration des signaux post-synaptiques avec une grande précision spatiale et temporelle.
Abstract
L'un des intérêts fondamentaux en neurosciences est de comprendre l'intégration d'entrées excitateurs et inhibiteurs long de la structure très complexe de l'arbre dendritique, ce qui conduit finalement à la sortie neuronale de potentiels d'action à l'axone. L'influence de divers paramètres spatiaux et temporels de l'entrée synaptique spécifique sur la production neuronale est actuellement à l'étude, par exemple, l'atténuation dépendante de la distance d'entrées dendritiques, l'interaction dépendant de la localisation des entrées spatialement distincts, l'influence de l'inhibition GABAergig sur l'intégration d'excitation, linéaire et modes d'intégration non-linéaires, et beaucoup plus.
Avec rapide micro-iontophorèse de glutamate et le GABA, il est possible d'étudier précisément l'intégration spatiale et temporelle de l'excitation et l'inhibition GABAergique glutamatergique. Exigences techniques critiques sont soit une lampe fluorescente déclenché, la diode électroluminescente (LED), ou une à deux photons scanning microscope pour visualiser branches dendritiques sans introduire significative photo-dommages des tissus. En outre, il est très important d'avoir un amplificateur micro-iontophorèse qui permet de compensation de capacité rapide de pipettes à haute résistance. Un autre point crucial est que aucun émetteur est involontairement libéré par la pipette pendant l'expérience.
Une fois établie, cette technique va donner des signaux fiables et reproductibles avec une grande neurotransmetteur et l'emplacement spécificité. Par rapport au glutamate et le GABA uncaging, ionophorèse rapide permet d'utiliser deux émetteurs en même temps, mais à des endroits très éloignés sans limitation dans le champ de vue. Il ya aussi des avantages par rapport à une stimulation électrique des axones focale: avec micro-iontophorèse l'emplacement du site d'entrée est définitivement connus et il est sûr que seul le neurotransmetteur d'intérêt est publié. Cependant, il doit être considéré que la micro-iontophorèse seulement l'postsynapse est activé et aspects présynaptique de la libération de neurotransmetteurs ne sont pas résolus. Dans cet article, nous montrons comment mettre en place des micro-iontophorèse dans des expériences de tranches de cerveau.
Introduction
Neurones dans le système nerveux central reçoivent une variété d'entrées synaptiques sur leurs processus dendritiques fines et ramifiées 1. Là-bas, la majorité des entrées dendritiques excitateurs sont médiés par des synapses glutamatergiques. Ces synapses peuvent être activés de façon répartie dans l'espace, ce qui entraîne l'intégration linéaire post-synaptique des potentiels post-synaptiques excitateurs (EPSP). Si les synapses sont activées simultanément et à proximité spatiale sur la dendrites, ces entrées excitatrices peuvent être intégrés supra-linéaire et génèrent des pointes dendritique 2-5.
De plus, l'intégration des entrées excitatrices dépend de l'emplacement de l'entrée sur l'arbre dendritique. Signaux qui arrivent à la région de la touffe distale sont beaucoup plus atténué que les intrants proximales en raison de câble filtrage 6. Dans l'hippocampe, des entrées vers les dendrites éloignés de touffes apicales sont générés par une région du cerveau différentes de celles sur dendri proximaleTES 7. Une question intéressante est donc de savoir comment entrée synaptique est traitée par différents compartiments dendritiques et si l'intégration dendritique réglemente l'influence de ces entrées en couches sur la décharge neuronale de différentes manières.
Non seulement les propriétés fonctionnelles, les caractéristiques morphologiques de la Dendrite, le lieu et le regroupement des entrées affectent l'intégration dendritique d'entrées excitateurs, aussi les entrées inhibitrices supplémentaires à partir de terminaux GABAergiques un facteur déterminant pour l'efficacité des synapses glutamatergiques 8,9. Ces différents aspects de l'intégration synaptique peuvent être idéalement étudiés en utilisant neurotransmetteur micro-iontophorèse, ce qui permet une application définie dans l'espace des différents neurotransmetteurs à des domaines dendritiques. Nous montrons ici comment mettre en place avec succès des micro-iontophorèse de glutamate et de GABA pour enquêter sur l'intégration du signal dans les neurones.
Pour cette application, à pointe finepipettes à haute résistance remplis de solutions de neurotransmetteurs concentrés sont utilisés. Ces pipettes sont positionnés à proximité de la membrane externe de la cellule, où les récepteurs de neurotransmetteurs sont situés. Une bonne visualisation des branches dendritiques est nécessaire. Le mieux est réalisé en utilisant des colorants fluorescents qui sont introduits via la pipette de patch. Ensuite, une très courte (<1 ms) d'impulsions de courant (dans la plage de 10 à 100 nA) est utilisé pour éjecter les molécules de neurotransmetteurs chargées. Avec ces courtes impulsions et de la rémunération de la capacité effective, potentiels ou courants post-synaptiques peuvent être évoqués avec précision temporelle et spatiale, ce qui signifie que l'emplacement de l'entrée excitatrice est connue avec précision. Glutamate micro-iontophorèse peut activer synapses dans un rayon défini, ce qui est inférieur à 6 um comme indiqué ici (Figure 1 9), mais il est également possible de parvenir à la résolution de la synapse unique 10-12.
Heine, M., et al 13. Avec rapide micro-iontophorèse, il est facilement possible d'utiliser deux ou plusieurs pipettes iontophorétiques et les placer à des endroits différents, même éloignés sur l'arbre dendritique. De cette manière, l'intégration des événements excitants, y compris ceux provenant de différentes voies, peut être étudiée. Il est également possible d'utiliser un glutamate et une pipette remplie par iontophorèse GABA dans le même temps. De cette façon, l'effet de l'inhibition GABAergique à différents emplacements par rapport à l'entrée d'excitation (en chemin, hors sentier inhibition) peut être étudiée. En outre, l'impact de l'inhibition par les interneurones ciblant les domaines neuronales spécifiques, comme dendrites distales, soma ou axones 14, peut être étudiée en utilisant l'iontophorèse GABA. Dans les neurones en culture, rapide micro-iontophorèse offre la possibilité d'investigate distribution de synapse unique et les aspects élémentaires de la communication synaptique dans les neurones dans beaucoup plus de détails 10,11.
Dans cet article, nous montrons en détail comment établir iontophorèse glutamate et de GABA pour l'utilisation dans des tranches de cerveau aigus, ce qui permet d'instruction intégration synaptique des entrées excitateurs et inhibiteurs en fonction de l'emplacement d'entrée, les forces d'entrée, et le moment, seul ou en interaction. Nous allons souligner les avantages et les limites de cette technique et comment résoudre avec succès.
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Protocol
1. Configuration requise
- Système de microscope: Bonne visualisation de la Dendrite est crucial. Si possible, utilisez un système de microscope à balayage laser à deux photons. Dans nos expériences, nous avons utilisé une portée TRIM II, LaVision Biotec, Bielefeld, en Allemagne ou un système Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin équipé d'un Ti: saphir laser ultrarapide pulsé (Chameleon Ultra II, Coherent) et un objectif élevé NA (60X, 0,9 NA, Olympus) pour visualiser les dendrites que nous avions remplis avec un colorant fluorescent via la pipette de patch. Bien que photo-dommages est pensé pour être moins sévère en utilisant un balayage à 2 photons, de réduire la puissance du laser (en dessous de 8 mW au niveau du tissu) et temps de séjour (moins de 1 ps) ou autant que possible.
- Une deuxième possibilité consiste à déclencher une source de lumière de fluorescence à champ large (LED ou une lampe à fluorescence) en synchronisme avec l'acquisition afin de réduire le temps d'exposition le plus possible. Nous avons utilisé un monochromateur avec une source de lumière intégrée (TILLPhotoniques, Grafelfing, Allemagne) sur un Zeiss Axioskop 2 FS microscope droit qui était équipé d'un éclairage infrarouge Dodt contraste (TILLPhotonics, Gräfelfing, Allemagne). Dans nos expériences, les temps d'exposition variaient de généralement 10 ms max. 30 msec.
- Utilisation d'un amplificateur micro-iontophorèse rapide, par exemple un système de micro-iontophorèse à deux canaux MVCS-C-02 (npi électronique, Tamm, Allemagne) avec compensation de capacité rapide. Les microélectrodes d'iontophorèse à pointe fine ont des résistances de 25 à 100 MQ (en fonction essentiellement de la taille de la pointe et la forme pipette), et des temps de montée rapides ne peuvent être atteints que si la compensation de capacité de l'amplificateur iontophorèse est réglé de manière optimale. Cette compensation rapide est nécessaire d'appliquer des impulsions de courant avec une brève apparition rapide et dans la plage inférieure à la milliseconde à la pipette par iontophorèse et ainsi éjecter le transmetteur à haute résolution spatiale en tailles de spot inférieure à 1 um 13. des amplificateurs de ionophorèse sont aldonc disponible à partir de plusieurs autres entreprises, que nous n'avons pas testé dans notre laboratoire. Ces dispositifs sont à notre connaissance pas équipé d'un circuit de compensation de capacité.
2. Préparer des solutions
- Préparer liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) et une solution interne car il est nécessaire pour la conception expérimentale. La seule addition à la solution interne, qui est nécessaire, est un colorant fluorescent rouge ou verte (par exemple 50 à 200 uM Alexa Fluor 488 ou 594 hydrazide, Invitrogen), en fonction de l'équipement optique. Voici un exemple pour ACSF saccharose qui peut être utilisée pour la dissection, en mM: NaCl 60, 100 saccharose, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, NaHCO3 26, CaCl2 1, MgCl2 5, 20 glucose, et pour ACSF normale solution pour les expériences de patch-clamp en mm: 125 NaCl, KCl 3, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 2,6 CaCl2, 1,3 MgCl2, 15 glucose.
- Carbogenize (95% O 2, 5% de CO 2) toutes les solutions extracellulaires constamment.
- Préparer une solution interne, par exemple, en mm: 140 K-gluconate, 7 KCl, 5 HEPES-acide, 0,5 MgCl2, 5 Phosphocréatine, 0,16 EGTA, avec 50 à 200 uM Alexa 488.
- Pour glutamate micro-iontophorèse préparer une solution avec de l'acide glutamique 150 mM et ajuster le pH à 7,0 avec du NaOH. Ajouter 50 -200 iM Alexa Fluor 488 ou 594 hydrazide (Invitrogen) pour la visualisation.
- Pour ionophorèse du GABA préparer une solution 1 M de GABA et ajuster le pH à 5 avec HCl 15. A ce pH, le GABA est chargé, alors seulement il peut être appliqué à l'aide iontophorèse. S'il vous plaît noter que le faible pH dans la solution éjectée dans l'espace extracellulaire pourraient effectuer transmission GABA lui-même 16,17.
Protéger la solution GABA de la lumière et de préparer fréquemment solution de GABA frais, puisque solution âgée peut perdre de son efficacité. - S'il est difficile de voir les événements GABAergiques, une chaîne high Cl - solution interne force motrice, par exemple en précisant KCl, pourraient aider à visualiser les événements GABAergiques pour voir si l'iontophorèse GABA travaille, mais pour étudier l'intégration synaptique une force motrice physiologique pourrait être recommandé. Pour la détection générale de petits événements GABAergiques, un protocole illustré à la figure 8C peut aider.
3. Tirez et tester les Pipettes d'ionophorèse
- En général, tirant les bonnes pipettes est peut-être l'étape la plus critique pour atteindre iontophorèse, un neurotransmetteur contrôlée. Lors de l'utilisation iontophorèse en culture cellulaire, il est possible de tirer de très fines électrodes similaires à microélectrodes tranchants 10. Dans les expériences de patch-clamp en tranches aiguës, cependant, ces pipettes très minces virage sur la surface de la tranche quand ils sont descendus dans le tissu avec un angle, ce qui rend impossible d'atteindre dendrites profondes.
- Par conséquent, tirer une pipette avec une très petite pointe, afin que personne neurotransmitter peut s'échapper, mais la pointe doit être encore suffisamment rigide pour pénétrer dans le tissu (figure 2). Par exemple, utiliser 150 Go F 8P des pipettes de classe (Produits Science, Hofheim, Allemagne) et un extracteur horizontal (par exemple un extracteur DMZ-Universal, Zeitz-Instruments GmbH, Martinsried, Allemagne; ou un P-97 Extracteur, Instrument Company Sutter , Novato, CA) avec plusieurs étapes de traction pour atteindre une petite ouverture, mais aussi un court tapper avec un angle de pente (figure 2 et tableau 2).
- Il est également possible d'utiliser des pipettes en verre de quartz de tirer pipettes iontophorétiques 10. Ceux-ci sont censés avoir de meilleures propriétés mécaniques et d'être plus fiable, mais extracteurs laser spéciaux sont nécessaires. Mais il est également possible d'obtenir de bons résultats avec des pipettes en verre normales, qui sont habituellement utilisés pour tirer des pipettes de patch.
- Testez les performances de la pipette et la résistance dans une chambre sans tissu, avant de les utiliser pour la premièretemps, depuis la fuite de glutamate pourrait nuire au tissu.
- Mettre en place l'amplificateur d'iontophorèse correctement. Puis remplir la pipette avec le neurotransmetteur et la solution contenant le colorant et placez-le dans le bain (ACSF).
- Compenser la capacitance (Figure 3). Habituellement pipettes très forte auront une capacité plus élevée que celles émoussés.
- Vérifier la résistance de la pipette: L'amplificateur micro-iontophorèse utilisé ici a une accumulation dans le dispositif pour mesurer la résistance de la pipette. Il évoque brèves impulsions de test rectangulaires, qui peuvent être contrôlés avec un oscilloscope standard ou une carte A / D relié à un ordinateur avec un logiciel d'acquisition. Selon la forme et la taille de la pointe, la pointe doit avoir une résistance entre 25 à 90 MQ.
- Focus sur la pointe avec un objectif à immersion dans l'eau 60X ou 40X et passer à l'imagerie de fluorescence et, si possible, agrandir En cas de fuite de colorant fluorescent sur la pointe de la pipette, appliquer une petite positive (dans le cas de glutamate) ou négative (dans le cas de GABA, figure 4) conservent courant (<0,02 mA). Si cela n'aide pas à annuler la fuite, changer la pipette.
- Appliquer un courant d'étape fort ou utiliser le déclencheur manuel et surveiller la pointe dans l'image fluorescente pour voir si la solution ne peut être éjecté hors de la pipette. Comme mentionné ci-dessus, le groupe de l'impulsion de courant est fonction de la charge de la molécule qui est censé être éjecté. Pour éjecter glutamate est un courant négatif et pour GABA A de courant positif (figure 4).
- Les bulles d'air dans la pipette que l'éjection du bloc de colorant et d'un émetteur, peuvent être corrigées en appliquant une forte éjection à plusieurs reprises en cours.
- Pris dans leur ensemble, s'il n'y a pas de fuite visible et l'éjection de test a réussi, à compenser la capacitance et commencer l'expérience.
- Attention: Depuis compensation de capacité est obtenue par un circuit de rétroaction, ce circuit peut osciller dépassement ou si elle est overcompensated. Utiliser doucement le réglage de la molette de compensation de capacité.
- Selon la stabilité de l'extracteur, il est parfois nécessaire d'ajuster les paramètres de l'extracteur de temps en temps, depuis le filament peut avoir changé propriétés. Cependant, si une fois une bonne pipette est conçu, il peut être utilisé pour plusieurs jours. Par conséquent, après la fin de l'expérience stocker la pipette par ionophorèse dans un récipient fermé, sans endommager la pointe.
- Pour l'expérience suivante remplir la pipette avec la solution de neurotransmetteur, appliquer plusieurs impulsions d'éjection fort pour dégager l'extrémité, puis vérifier si les propriétés (résistance) changer de façon significative. Puis compenser la capacitance et utiliser la pipette à nouveau. Ne pas utiliser une pipette unique avec différentes solutions de neurotransmetteurs.
4. Préparer les tranches de cerveau
- Si la micro-iontophorèse est utilisé pour la première fois définitivement préparer des tranches après l'établissement d'un programme de marche de l'extracteur de façon fiable. <procédures li> Perform anesthésie et la décapitation, conformément aux lignes directrices de soins aux animaux de votre institution ou une autorité locale.
- Après l'enlèvement du cerveau, la transférer à froid de la glace saccharose ACSF (voir protocole 2.1).
- Couper la région d'intérêt en tranches d'épaisseur appropriée (par exemple 300 um).
- Incuber les tranches dans ACSF saccharose à 35 ° C pendant 30 min. Par la suite, les transférer sur une chambre de retenue immergée contenant ACSF normal à température ambiante.
- Tout au long de la préparation et de l'expérience carbogenize l'ACSF entourant les tranches avec 95% d'O 2, 5% de CO 2.
5. Établir un enregistrement cellules entières
- Positionner la pipette d'iontophorèse (s) déjà proche de la surface de la tranche avant de colmatage d'une cellule, afin d'éviter un positionnement durable, après l'établissement du mode de cellule entière.
- Tirer une faible résistance pipette de patch (3-5 mQ), remplissez-le avec la dye contenant une solution interne et appliquer une pression positive à la pipette (30 - 60 mbar).
- Entrez le bain et l'approche de la cellule sous guidage visuel (contraste de Dodt infrarouge ou deux image en contraste de gradient photon).
- Surveiller la résistance de la pipette avec une impulsion d'essai (par exemple -10 mV, 20 ms) en mode de blocage de tension. En touchant le tissu corriger le potentiel de décalage.
- Approche de la cellule et appuyez doucement sur la pointe de la pipette en elle jusqu'à ce qu'un «fossette» peut être vu clairement. Libérer immédiatement la pression de la pipette, appliquer 40 - 60 mbar de pression négative et commuter le potentiel de membrane de -65 mV.
- Lorsque le courant de maintien atteint des valeurs inférieures à 100 pA, relâchez la pression négative.
- Après avoir établi une joint giga (résistance> 1 VA), la rupture de la membrane avec une courte, forte aspiration à la pipette ou une brève surcompensation du circuit de compensation de capacité.
- Selon le mode (pince de tension ou de courant) est nécessairepour la conception expérimentale, de compenser de manière appropriée.
- Commencer à mettre la pipette iontophorèse dans sa position finale. Si une description plus détaillée de la façon de réaliser avec succès des enregistrements de patch-clamp est nécessaire, il ya plusieurs excellentes lignes directrices disponibles 18,19.
6. Placez la pipette Iontophoretic et de générer un potentiel Iontophoretic Postsynaptic
- En général, les événements iontophorétiques peuvent être invoquées à des endroits définis en fonction de l'expérience souhaitée, par exemple, à une dendrite épineux pour le glutamate micro-iontophorèse, à l'arbre dendritique, soma ou axone segment initial de GABA micro-iontophorèse.
- Approche de la cellule jusqu'à environ la distance de 1 um sans le toucher. Après avoir atteint la position d'intérêt, il est essentiel qu'aucun neurotransmetteur est fuit et que la capacité pipette est compensée correctement.
- Si s'approchant de la cellule par un glutamate rempli pipett iontophorétiquee provoque une dépolarisation détectée du potentiel de membrane, d'ajuster le courant conserver si possible, ou changer la pipette.
- Appliquer courtes impulsions de courant négatives, à partir de zéro et augmenter le courant systématiquement (par exemple de 0,1 à 0,4 ms, de 0,01 à 1 uA impulsions). Cela permet de savoir dans quelle plage du courant d'iontophorèse évoque les réponses souhaitées dans le groupe expérimental spécifique mis en place.
- S'il n'ya pas de réponse détectable, soulevez la pipette plusieurs centaines de micromètres et d'appliquer un fort courant d'éjection (> 0,1 mA) pour nettoyer l'embout. Réglez la compensation de capacité, l'approche de la cellule, et essayez à nouveau.
- S'il n'y a toujours pas de réponse, réduire le courant conserver. Soyez très prudent avec les paramètres de numérotation car cette procédure peut entraîner la libération de neurotransmetteurs incontrôlée. Par conséquent, constamment surveiller l'enregistrement de détecter les changements respectifs dans le potentiel de membrane.
- S'il est difficile de détecter des événements GABAergiques, il peut être utile d'utiliser unen composition de la solution interne qui donne une grande Cl - force motrice. Pour atteindre cet objectif, réduire la concentration de Cl - dans la solution pipette (voir section 2.6 du protocole.). Cela se traduira par des événements GABAergiques plus au potentiel de membrane au repos en raison d'une force d'entraînement supérieur.
- Sinon, injecter étapes longues actuels résultent en membrane chances potentielles de -100 mV à -48 mV (figure 8C). Avec ce protocole, le Cl - force motrice est augmentée à des potentiels hyperpolarisés provoquant une réponse GABA dépolarisants.
- Il est également possible d'utiliser le protocole d'injection de courant étapes pour déterminer le potentiel d'inversion des événements évoqués, ce qui permet de déterminer la nature GABAergique des événements. Fuite de GABA est plus difficile à détecter que la fuite de glutamate. Dans ce cas, une surveillance constante de la résistance d'entrée peut aider, quand la pipette remplie GABA est abordée. Si la résistance d'entrée diminue, le courant ne peut retenir be augmentée ou une pipette différent devrait être utilisé.
- Comme les expériences de contrôle pour ionophorèse glutamate, nous vous proposons un 2 + expérience d'imagerie Ca, en utilisant 200 uM OGB-1 et n ° EGTA dans la solution de la pipette pour visualiser l'afflux de calcium locales qui pourraient être causés par des fuites de glutamate.
- En général, pour obtenir une réponse stable, il est très important d'avoir une pipette mécaniquement stable pour éviter toute dérive dans le temps. La dérive peut être causée par des changements de température, il est donc recommandé d'allumer l'appareil au moins une demi-heure avant les mesures pour éviter la dérive thermique. Assurez-vous d'utiliser les bonnes joints de la cartouche dans le porte-pipette et la pointe est vraiment fixé. Le titulaire lui-même peut en outre être fixé avec du ruban téflon, en outre, être sûr qu'il n'y a pas de tension sur les câbles de la headstage ou manipulateur, qui est aussi une source potentielle de dérive.
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Representative Results
Une approche simple pour déterminer la propagation spatiale de l'iontophorèse est de retirer la pipette iontophorèse par étapes à partir de la dendrite, tout en maintenant constant le glutamate éjecté. Nous avons constaté que l'étendue spatiale d'une stimulation micro-iontophorèse avait un diamètre d'environ 12 um (figure 1 montrant rayon). Quelle profondeur dans le tissu de la ionophorèse peut être utilisé dépend de la rigidité de la pipette. Cependant, les pipettes iontophorétiques nécessaires pour des expériences en tranches (figure 2), qui sont utilisés ici, ne sont pas limitatifs de la profondeur de la pénétration. Au contraire le système optique et la résolution en diminuant la profondeur de la coupe de cerveau est le facteur limitant. Pour un enregistrement de bonne qualité, il est essentiel qu'aucun émetteur est une fuite hors de la pipette. Dans le cas du glutamate, une fuite peut être identifié s'il existe une dépolarisation brusque lorsque la dendrite est approchée avec la pointe de pipette ou si le niveau de référence devient subitementinstable (figure 5). Après l'établissement d'un enregistrement stable, il est possible d'évoquer epsps d'amplitudes définies, des pointes dendritiques ou potentiels d'action avec cette technique sur n'importe quel endroit tout au long de l'arbre dendritique (Figure 6). En appliquant glutamate avec rapide micro-iontophorèse, les propriétés de l'EPSPS, leur propagation et de sommation, simultanément à différents endroits, même lointaines, peuvent être étudiés (figure 7). Événements GABAergiques peuvent être évoqués seul ou en complément au glutamate avec une seconde pipette en remplissant la pipette ionophorèse avec une solution hautement concentrée GABA (voir: section protocole n ° 2) et un courant d'éjection positive. Il ya un protocole simple pour confirmer la nature GABAergique des événements et pour faciliter événements GABAergiques à détecter, si vous n'utilisez pas une solution interne de haute force motrice: Injecter courants négatifs (env. 1 sec; l'amplitude dépend de la résistance d'entrée de l' cellulaire) résultant en hyperpolarisant voétapes de ltage, commençant à environ -100 mV et ensuite augmenter à 5 mV (figure 8). À des potentiels très négatifs des événements GABAergiques sont plus faciles à détecter, grâce à la force d'entraînement supérieur. Et si les signaux inverser autour du Cl calculé - potentiel d'inversion pour les solutions, il est très probable qu'ils sont GABAergique dans la nature (figure 8). Avec une pipette micro-iontophorèse GABA supplémentaire, il est possible d'étudier, par exemple, l'effet de l'inhibition GABAergique sur les événements glutamatergique, comme le sodium / calcium pointes dendritiques, en faisant varier la synchronisation relative des dendritique pic et IPSP (Figure 9), le position relative de ces deux événements, ou leurs amplitudes. (Tous les expérimentations animales ont été menées en conformité avec les lignes directrices de la protection des animaux et Utilisez comité de l'Université de Bonn, le Centre allemand pour les maladies neurodégénératives et l'état Rhénanie du Nord-Westphalie.)
Figure 1. Étendue spatiale de glutamate par ionophorèse éjecté déterminée par pipette rétraction. A) la projection d'intensité maximale d'une image à deux photons d'une dendrite de cellules CA1 pyramidale rempli de 100 pM Alexa 594 et la pipette par ionophorèse dans la position initiale (barre d'échelle 8 pm). Encarts montrent la rétraction de la pipette d'iontophorèse et l'EPSP iontophorèse correspondante enregistrée au soma. La flèche indique la position de la pointe de la pipette par ionophorèse. B) Distance dépendance de l'EPSP amplitudes par rapport à la position initiale de l'embout de pipette par ionophorèse (≤ 1 um loin de dendrites, n = 6 branches). Avec cela, nous pourrions estimer le rayon du glutamate se propager en retirant systématiquement la pipette. Encart montre un exemple des traces représentatives. Les barres d'erreur représententmoyenne ± SEM. (Adapté de Müller et al. 2012 9, réimprimé avec la permission d'Elsevier).
Figure 2. Comment une pipette iontophorèse devrait ressembler. A) L'image infrarouge CCD d'une pipette iontophorèse par rapport à un petit 5,5 MQ pipette de patch en utilisant un objectif 60x. B) pipette Iontophoretic avec échelle en utilisant un objectif 60x. Calibration: petits = 10 um.
Figure 3. compensation de capacité de la pipette iontophorèse aide de l'accumulation dans le test d'impulsion (10 nA, 10 msec, NPI électronique, Tamm,Allemagne). Il est important de compenser la capacité de surveiller correctement le droit résistance de pipette et de veiller à l'application des neurotransmetteurs rapide et précis.
Figure 4. Principes de micro-iontophorèse. A) Représentation schématique d'un neurone pyramidal CA1 dans la configuration de patch-clamp cellule et une pipette remplie d'iontophorèse glutamate. Le glutamate est chargé négativement, donc un courant positif appliqué à la pipette sera l'empêcher de s'échapper de la pipette: Le conservent courant est positif (panneau de gauche). Pour éjecter glutamate de la pipette, appliquer un courant négatif (à droite). De cette façon, le glutamate est forcé à sortir de la pipette et peut évoquer les événements excitants dans la cellule post-synaptique. B) Représentation schématique de CNeurone pyramidal A1 dans la configuration de patch-clamp cellule et une pipette remplie d'iontophorèse GABA. GABA est chargé positivement à un pH bas. Par conséquent, un courant négatif sera l'empêcher de s'échapper de la pipette (panneau de gauche). Pour éjecter GABA appliquer un courant positif (à droite). De cette manière, le GABA sort de la pipette et peut évoquer événements inhibiteurs dans la cellule post-synaptique.
Figure 5. Bonnes et mauvaises pipettes iontophorétiques. A) un exemple représentatif d'une EPSP glutamatergique iontophorèse généré sur une branche dendritique d'un neurone pyramidal CA1. B) Exemple représentatif d'un dendritique pic iontophorèse généré une branche dendritique dans la région CA1 de l'hippocampe avec la fuite de glutamate légère cours de la pointe de la pipette.
Figure 6. Les résultats représentatifs de glutamate seul micro-iontophorèse. A) Schéma d'un patché CA1 neurone pyramidal et une pipette iontophorèse remplis de glutamate. B) EPSP a évoqué dans un neurone pyramidal CA1 avec iontophorèse glutamate. C) dendritique Na + / Ca 2 + pic évoqué sur une dendrite proximal d'un CA1 pyramidale neurone, trace du bas montre la pente de la courbe de tension, pic indique la pente de crête de la pointe dendritique. D) lorsque l'augmentation du courant appliqué à l'ionophorèse l'amplitude de l'EPSP va augmenter jusqu'à ce qu'il franchisse le seuil du potentiel d'action.
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Figure 7. Les résultats représentatifs pour le double glutamate micro-iontophorèse à différents endroits sur l'arbre dendritique. A) Schéma d'un patché CA1 neurone pyramidal et deux pipettes iontophorétiques rempli de glutamate, qui sont positionnés sur une extrémité proximale et une dendrite distale, respectivement. B) EPSP Iontophoretic évoqué sur une dendrite proximal d'un CA1 neurone pyramidal (1). C) EPSP Iontophoretic évoqué lors d'une dendrite distale (2).
Figure 8. Les résultats représentatifs pour GABA micro-iontophorèse. A) Représentation schématique d'un patché CA1 neurone pyramidal et une pipette remplie d'iontophorèse GABA.B) PSEI iontophorèse évoqué sur une dendrite proximale d'un CA1 pyramidale neurone. C) d'injection de courant à long de changeant systématiquement amplitudes à un neurone pyramidal CA1 par l'intermédiaire de la pipette de patch, pour déterminer le potentiel d'inversion du cas évoqué (des injections de courant de -400 pA à 0 Pa). Artefact indique l'heure du point de ionophorèse GABA. L'événement évoqué indique un risque d'inversion de l'ordre de -70 mV (flèche).
Figure 9. Les résultats représentatifs de glutamate simultanée et iontophorèse GABA pour enquêter sur l'intégration de l'inhibition et d'excitation. A) Représentation schématique d'un neurone pyramidal patché et une pipette remplie de glutamate (vert) et avec le GABA (orange). B) par ionophorèse évoquépointes dendritiques seuls, dans les balayages ultérieurs, des traces inférieures montrent / dt, pics indiquent pointes dendritiques. C) par ionophorèse évoqués IPSP seul. D) Les deux événements, glutamatergique et GABAergique ensemble.
| Lieu spécificité | spécificité de l'émetteur | Toxicité / effets secondaires | Stimulation présynaptique | Expérience à long terme | Coûts / Complexité | |
| Micro-iontophorèse | + + | + + + | + + | - | + + | + + |
| 2-photon uncaging | + + + | + + + | + | - | + | + |
| Stimulation synaptique | - | - | + + + | + + + | + + + | + ++ |
Tableau 1. . Comparaison des différentes techniques Avantages et inconvénients des techniques pour stimuler les neurones en fonction de différents critères (- = mauvais, + = pas optimal, + + = bon, + + + = meilleur).
| pipettes de patch | Pipettes iontophorétiques | |||
| Pré-tire P (A) traction simple | Dernière Pull P (B) | Pré-tire P (A) Pull unique | Dernière Pull P (B) | |
| Chaleur H | 700 | 480 | 510 | 600 |
| Force de pré Pull F (TH) | 018 | 035 | 018 | 008 |
| Distance seuil S (TH) | 017 | 012 | 025 | 015 |
| Retard Heatstop t (H) | 050 | 030 | 050 | 030 |
| Distance Heatstop s (H) | 030 | 000 | 030 | 000 |
| Retard F (F1) | 000 | 136 | 000 | 050 |
| Force de traction 1 F1 | 000 | 065 | 200 | 400 |
| Distance Pull 2 s (F2) | 000 | 005 | 000 | 001 |
| Force de traction 2 F2 | 000 | 080 | 000 | 095 |
| Ajustez (AD) | 121 | 000 | 121 | 000 |
Tableau 2. Protocole exemplairement extracteur. </ Strong> Pour un extracteur horizontal (DMZ-Universal Puller, Zeitz-Instruments GmbH, Martinsried, Allemagne), en utilisant des filaments GB150F-8P (Science Products, Hofheim, Allemagne) pour le patch et pipettes iontophorétiques.
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Discussion
Nous expliquons ici comment appliquer rapidement des micro-iontophorèse de neurotransmetteurs pour enquêter sur l'intégration synaptique sur dendrites. Cette technique a été utilisée avec succès pour étudier la transmission synaptique glutamatergique et GABAergique dans différentes régions du cerveau in vitro et in vivo 9,20-22. Micro-iontophorèse a été utilisé pendant plus de 60 ans, mais dans les premières années, il a été principalement utilisé pour appliquer localement neurotransmetteurs et des drogues sur des échelles de temps lentes ou intermédiaires 23 ou de micro-injection de substances dans les cellules 24.
Micro-iontophorèse est devenu un outil particulièrement intéressant pour étudier l'intégration dendritique depuis l'introduction des amplificateurs, qui sont équipés d'une compensation de capacité rapide pour les électrodes à haute résistance 10,11. Grâce à cette amélioration, il est devenu possible d'appliquer brèves courants iontophorétiques rectangulaires résultant des réponses post-synaptiques, qui résembled plus réaliste l'évolution temporelle des événements synaptiques 10,25.
Quelles sont les exigences techniques et des difficultés à traiter, lors de l'établissement de micro-iontophorèse? Un amplificateur d'iontophorèse est nécessaire qui permet de compensation de la capacité élevée des pipettes iontophorétiques fines. L'exactitude réglage de la compensation de la capacité est très important si l'opération à grande vitesse en conjonction avec des microélectrodes à haute résistance est nécessaire. Capacités parasites non compensées sont facturés à partir du courant d'iontophorèse qui est fourni par l'instrument, et ralentit donc l'application. Compenser la capacitance correctement est crucial et expliqué en détail dans la vidéo. En outre, il est essentiel que le système optique donne une bonne image de fluorescence de la dendrite et la pipette iontophorèse sans induire photo-dommages des tissus. Si possible, utilisez un système à deux photons et réduire la puissance du laser et temps de séjour autant que compatible avecune qualité d'image décente. Si une source de lumière plus conventionnelle est utilisée, assurez-vous de réduire le temps d'exposition autant que possible, par exemple, à l'aide de volets mécaniques ou de déclenchement électrique. Probablement le point le plus critique est la conception pipette, ce qui permettra une application définie et spécifique du neurotransmetteur utilisé. Cette étape exige un certain effort et de temps pour trouver les réglages optimaux. Ici, nous présentons des protocoles pour ionophorèse glutamate et le GABA, si d'autres neurotransmetteurs, les inhibiteurs ou modulateurs sont utilisés, il est nécessaire que la substance est très concentré et plus important encore qu'elle est chargée. Par exemple, depuis GABA a une charge nette de zéro à un pH de 0, le pH doit être ajusté (voir la section protocole n ° 2), résultant en une charge nette positive.
Lorsque micro-iontophorèse est établi, il fournira un ensemble d'outils étendue pour étudier l'intégration synaptique dans les neurones. Il permet la stimulation des synapses d'intérêt de manière sélective avecun neurotransmetteur particulier. L'utilisation d'un neurotransmetteur choisi sur des emplacements définis, les courants post-synaptiques et potentiels et leur propagation peut être étudiée. En outre, il est possible d'utiliser plusieurs électrodes d'iontophorèse simultanément pour étudier l'intégration de plusieurs entrées glutamatergiques ou changer systématiquement la chronologie relative ou la force des événements.
Certains points critiques générales doivent être considérés lors de l'utilisation de micro-iontophorèse. Le profil de la concentration des neurotransmetteurs après micro-iontophorèse est différente de libération endogène. Murnick et autres 10 ont indiqué que la vitesse de libération de la pointe d'iontophorèse (environ 1 msec) est susceptible d'être beaucoup plus lente que la libération synaptique de vésicules, qui se produit en une fraction de milliseconde (0,2 ms) 26. En outre, la diffusion de et vers la fente synaptique est probable ralentissement augmentation de la concentration et de la décomposition des neurotransmetteurs iontophorétiquement appliquées.En outre, le volume de neurotransmetteur éjecté est susceptible d'être plus élevé que les volumes physiologiquement libérés, cependant, avec des électrodes à haute résistance, glutamatergique unique et postsynapses GABAergiques pourrait être activé à l'aide de micro-iontophorèse 10-12. Une sélectivité spatiale de l'ordre de quelques micromètres a récemment été réalisé par uncaging à deux photons des neurotransmetteurs 3,4,27.
Bien que considérablement plus économique intensive, uncaging à deux photons a plusieurs avantages par rapport aux micro-iontophorèse. En particulier, elle peut être utilisée pour libérer neurotransmetteur simultanément à plusieurs sites synaptiques et ne nécessite pas le positionnement précis de la pointe d'électrode bien. Cependant, il a aussi quelques inconvénients importants à considérer lors du choix d'une méthode pour une expérience particulière. De nombreux composés en cage ont des effets secondaires indésirables tels que le blocage des récepteurs de neurotransmetteurs 28. Par exemple, beaucoup de glutamate et de GABA cagesont été signalés à interférer avec inhibition GABAergique. En outre, la puissance du laser relativement élevée requise pour uncaging deux photons peut donner lieu à dommages-photo du neurone post-synaptique, en particulier lorsque la stimulation est appliquée de manière répétée sur plusieurs minutes. De plus, tandis que les micro-iontophorèse est limité dans le nombre de sites stimulés, ces sites peuvent être choisis librement sur l'ensemble de l'arbre dendritique d'un neurone, par exemple sur les dendrites distale et basale, pour simuler entrée synaptique en couches à partir de différentes régions du cerveau. Deux photons uncaging, car il est actuellement utilisé par la plupart des groupes, sera limitée aux sites synaptiques dans un plan focal particulier et dans le champ de vision, qui dépend de l'objectif utilisé (typiquement 40X ou immersion dans l'eau 60X). Il doit être considéré que les deux techniques conduisent toujours à l'activation des récepteurs extrasynaptiques, ce qui peut rendre l'interprétation des résultats plus difficile.
Un autre inconvénient de micro-iontophorèse est que oeul le postsynapse peut être activé. Si la fonction présynaptique et le rôle des vésicules publié neurotransmetteur doivent être mis dans le foyer expérimental, la stimulation synaptique électrique local peut être une méthode de choix. Toutefois, les inconvénients de stimulation synaptique électrique par rapport à micro-iontophorèse sont le lieu inconnu des synapses activées et le co-activation des axones de différentes populations neuronales, potentiellement appartenant à d'autres systèmes de neurotransmetteurs (tableau 1).
En résumé, l'avantage le plus important de micro-iontophorèse est, à notre avis, qu'il est possible d'utiliser plusieurs neurotransmetteurs différents et d'étudier leur interaction sur les compartiments neuronaux tels que les dendrites 9.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Nous remercions Hans Reiner Polder, Martin Fuhrmann et Walker Jackson pour la lecture attentive du manuscrit. Les auteurs ont reçu des fonds qui ont été fournis par le ministère de la recherche MIWF de l'état Rhénanie du Nord-Westphalie (SR), le BMBF-Projekträger DLR collaboration américano-allemand en neurosciences computationnelles (CRCNS; SR), des centres d'excellence dans les maladies neurodégénératives (COEN; SR), et l'Université du programme de financement intra-muros Bonn (BONFOR; SR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin) | LaVision Biotec, Bielefeld, Germany | ||
| Two-photon laser scanning microscope Ultima IV | Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA | ||
| Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laser | Chameleon Ultra II, Coherent | ||
| 60X Objective, NA 0.9 | Olympus | ||
| Zeiss Axioskop 2 FS upright microscope | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Monochromator | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Micro-iontophoresis system MVCS-02 | NPI Electronics, Tamm, Germany | ||
| Sutter puller P-97 | Sutter Instrument Company, Novato, CA | ||
| Glass filaments (150 GB F 8P) | Science Products, Hofheim, Germany | ||
| Reagent | |||
| Alexa Fluor 488 hydrazide | Molecular Probes life technologies | A-10436 | |
| Alexa Fluor 594 | Molecular Probes life technologies | A-10438 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6297 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C5080 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M2670 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| K-Gluconate | Sigma Aldrich | G4500 | |
| HEPES-acid | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Phosphocreatin | Sigma Aldrich | P7936 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Glutamic acid | Sigma Aldrich | G8415 | |
| GABA | Sigma Aldrich | A5835 | |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | |
| HCl | Merck | 1.09108.1000 |
References
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