Summary
Bu yazıda yüksek uzaysal ve zamansal hassasiyetle postsinaptik sinyal entegrasyonu araştırmak için bir teknik olarak nörotransmitterlerin hızlı mikro-iyontoforez tanıtmak.
Abstract
Nörobilim temel ilgi alanlarından biri sonunda akson de aksiyon potansiyeli nöronal çıkışına yol açan dendritik ağaç, çok kompleks yapısı boyunca eksitatör ve inhibitör girdi entegrasyonu anlamaktır. Nöronal çıkış belirli sinaptik giriş farklı mekansal ve zamansal parametrelerinin etkisi dendritik girdi mesafe bağımlı zayıflama, mekansal ayrılmış giriş yerini bağımlı etkileşim, uyarıcı entegrasyonu, lineer üzerinde GABAergig inhibisyon etkisi örneğin, halen araştırılmaktadır ve doğrusal olmayan entegrasyon modları, ve çok daha fazlası.
Glutamat ve GABA hızlı mikro-iyontoforez ile tam glutamaterjik uyarma ve GABAerjik inhibisyon mekansal ve zamansal entegrasyonu incelemek mümkündür. Kritik teknik gereksinimleri ya tetiklenen floresan lamba, ışık yayan diyot (LED), ya da bir iki foton SCA olandoku önemli fotoğraf zarar tanıtan olmadan dendritik dalları görselleştirmek için mikroskop nning. Ayrıca, yüksek direnç pipetler hızlı kapasite tazminat sağlayan bir mikro-iyontoforez amplifikatör olması çok önemlidir. Başka bir önemli nokta hiçbir verici istemsiz deney sırasında pipet tarafından yayımlanan olmasıdır.
Bir kez kurulan bu tekniği yüksek bir nörotransmitter ve konumu özgüllük ile güvenilir ve tekrarlanabilir sinyalleri verecektir. Glutamat ve GABA uncaging ile karşılaştırıldığında, hızlı iyontoforez görüş alanı için sınırlama olmaksızın aynı anda ama çok uzak yerlerde hem vericileri kullanarak sağlar. Orada akson odak elektrik stimülasyonu ile karşılaştırıldığında avantajları da vardır: mikro-iyontoforez ile giriş sitenin konumu kesinlikle bilinir ve ilgi sadece nörotransmitter serbest emin olabilirsiniz. Ancak bu mikro-iyontoforez sadece dikkate alınmalıdırpostsynapse devreye girer ve nörotransmitter serbest presinaptik yönleri çözülmüş değildir. Bu yazıda beyin dilim deneylerinde mikro-iyontoforez kurmak nasıl gösterilmektedir.
Introduction
Merkezi sinir sisteminde nöronların ince ve dallanmış dendritik süreçleri 1 sinaptik çeşitli girişler almak. Orada, eksitatör dendritik girişlerin çoğunluğu glutamaterjik sinaps aracılık eder. Bu sinaps eksitatör postsinaptik potansiyeller (EPSPS) bir postsinaptik doğrusal entegrasyonu ile sonuçlanan, bir mekansal dağıtılmış şekilde devreye alınabilir. Sinaps aynı anda ve dendrit üzerine mekansal yakınlık içinde aktif ise, bu uyarıcı girişler supra-lineer entegre ve dendritik ani 2-5 oluşturmak olabilir.
Ayrıca, eksitatör girdilerin entegrasyonu dendritik ağaç üzerindeki giriş yerini bağlıdır. Distal tutam bölgede varmak sinyalleri çok daha zayıflatılmış kablo filtreleme 6 nedeniyle proksimal girişi daha vardır. Hipokampus, apikal tutam dendritler için uzak girdi proksimal dendri üzerinde daha farklı bir beyin bölgesi tarafından oluşturulantes 7. Heyecan verici bir soru bu nedenle, ne kadar sinaptik giriş farklı dendritik bölmeleri tarafından işlenen ve dendritik entegrasyon farklı şekillerde nöronal ateşleme bu katmanlı girişlerinin etkisi düzenler eğer. Edilir
Fonksiyonel özellikleri, dendrit morfolojik özellikleri Sadece, giriş yerini ve kümeleme önemlisi glutamaterjik sinaps 8,9 etkinliğini belirlemek de uyarıcı girişleri, GABAerjik terminallerinden ek inhibitör girişlerin dendritik entegrasyonu etkiliyor. Sinaptik entegrasyon Bu farklı yönlerini ideal dendritik etki için farklı nörotransmitterlerin mekansal tanımlı uygulama sağlar nörotransmitter mikro-iyontoforez, kullanılarak incelenebilir. Biz başarıyla nöronlar sinyal entegrasyon araştırmak glutamat ve GABA mikro-iyontoforez kurmak için nasıl burada göstermek.
Bu uygulama, ince uçlu içinKonsantre nörotransmitter çözeltisi ile doldurulur, yüksek direnç pipetler kullanılır. Bu pipet nörotransmiter reseptörleri bulunmaktadır hücresi, dış membran yakın konumlandırılmıştır. Dendritik dalların iyi bir görüntüleme gereklidir. Bu en iyi yama pipet vasıtasıyla tanıtılmaktadır floresan boyalar kullanılarak elde edilir. Daha sonra çok kısa bir (<1 milisaniye) akım darbesi (10 aralığında - 100 NA) şarj nörotransmitter molekülleri çıkarmak için kullanılır. Bu kısa bakliyat ve etkili kapasite tazminat ile, postsinaptik potansiyelleri veya akımlar eksitatör giriş yerini tam olarak bilinen anlamına gelir yüksek zamansal ve mekansal hassas, ile uyarılmış olabilir. Glutamat mikro iyontoforez (Şekil 1 9), burada gösterildiği gibi 6 um'den daha küçük olan bir yarıçap tanımlanabilir, sinaps aktive olabilir, ancak tek bir sinaps çözünürlük 10-12 ulaşmak da mümkündür.
Heine, M., ve ark 13 iki-foton uncaging ile elde nokta boyutları daha küçük olan 0.5 mikron altında boyutları, nokta ayarlanabilir gösterdi. Hızlı mikro-iyontoforez ile iki veya daha fazla iyontoforez pipetler kullanın ve dendritik ağaç üzerinde farklı, hatta uzak noktalarda yerleştirmek için kolayca mümkündür. Bu şekilde, farklı yollar gelenler de dahil olmak üzere uyarıcı etkinlik, entegrasyonu araştırılabilir. Bu, aynı zamanda, bir glutamat, GABA dolu bir iyontoforetik pipet kullanmak da mümkündür. Bu şekilde eksitatör giriş (on-yolu, off-yolu inhibisyonu) göre farklı yerlerde GABAerjik inhibisyon etkisi incelenebilir. Ayrıca, belirli nöronal etki hedef internöronlar tarafından inhibisyon etkisi, distal dendritler gibi, soma veya aksonlar 14, GABA iyontoforez kullanılarak incelenebilir. Kültürlü nöronlarda, hızlı mikro-iyontoforez INVE için bir fırsat sunuyorçok daha ayrıntılı 10,11 nöronların tek sinaps dağıtım ve sinaptik iletişim temel yönlerini stigate.
Bu yazıda giriş yeri, giriş güçlü ve zamanlama, tek başına ya da etkileşim içinde bağımlılığında eksitatör ve inhibitör girdi sinaptik entegrasyonu soruşturma sağlar akut beyin dilimleri, en kullanılmak üzere glutamat ve GABA iyontoforez kurmak için nasıl ayrıntılı olarak göstermektedir. Biz avantajları ve sınırlamaları bu tekniğin ve nasıl başarılı bir şekilde gidermek için işaret olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Sistem Gereksinimleri
- Mikroskop sistemi: dendrit iyi görselleştirme önemlidir. Varsa, bir iki foton lazer tarama mikroskop sistemi kullanın. Sapphire ultra-darbeli lazer (Chameleon Ultra II, Tutarlı) ve yüksek NA amacı: Deneylerde bir Ti ile donatılmış bir TRIM Kapsam II, LaVision Biotec, Bielefeld, Almanya ya da Ultima IV sistemi, Prairie Teknolojileri, Middleton, Wisconsin kullanılan (60X, 0.9 NA, Olympus) biz yama pipet ile bir floresan boya ile dolu olan dendritler görselleştirmek için. Fotoğraf-zarar 2-foton tarama kullanarak daha hafif olduğu düşünülmektedir rağmen, lazer gücü azaltmak (dokuda altında 8 mW) ve bekleme süreleriyle (aşağıda 1 mikrosaniye) veya mümkün olduğunca.
- İkinci bir olasılık mümkün olduğunca maruz kalma süresini azaltmak için satın alma ile eşzamanlı bir geniş alan floresan ışık kaynağı (LED veya floresan lamba) tetiklemek için olduğunu. Biz entegre bir ışık kaynağı (TILLPho bir monokromatör kullanmışDodt kontrastlı kızılötesi aydınlatma (TILLPhotonics, Gräfelfing, Almanya) ile donatılmış bir Zeiss Axioskop 2 FS dik mikroskop tonikler, Gräfelfing, Almanya). Deneylerde pozlama süreleri msn genellikle 10 maks değişmektedir. 30 msn.
- Iki kanallı mikro-iyontoforez sistemi örneğin Kızamık aşılamasından-C-02 (npi elektronik, Tamm, Almanya) hızlı kapasitans tazminat ile., Hızlı mikro-iyontoforez amplifikatör kullanın Ince uçlu iyontoforez Mikroelektronlar 25 dirençleri var - MQ 100 (en önemlisi ucu boyutu ve pipet şekline bağlı olarak), ve iyontoforez amplifikatör kapasitans tazminat en iyi şekilde ayarlanmış ise hızlı artış kez elde edilebilir. Bu hızlı tazminat iyontoforez pipet için alt milisaniye aralığında kısa ve hızlı başlayan akım darbeleri uygulamak ve böylece 1 mikron 13 aşağıda yer boyutlarda yüksek uzaysal çözünürlüğü ile verici çıkarmak için gereklidir. İyontoforez amplifikatörler al vardırbizim laboratuvarda test değil diğer bazı şirketler, bu kadar kullanılabilir. Bu cihazlar kapasite tazminat devresi ile donatılmış değil bilgimizi için vardır.
2. Çözümler hazırlayın
- Yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) ve deney tasarımı için gerekli olduğu gibi iç çözeltisi hazırlayın. Gerekli iç çözüm, tek sıra optik donanım bağlı olarak kırmızı veya yeşil floresan boya (örneğin 50 ila 200 mcM Alexa Fluor 488 veya 594 hidrazin Invitrogen) 'dir. Ve normal ACSF için, 60 NaCl, 100 sukroz, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3, 1 CaCl2, 5 MgCl2, 20 glukoz: mM diseksiyon için kullanılabilir ACSF sukroz, burada bir örnek mM olarak patch-clamp deneyler solüsyon: 125 NaCI, 3 KCI, 1.25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3, 2.6 CaCl2, 1.3 MgCl2, 15 glukoz.
- Tüm dışı çözümler sürekli olarak (% 95 O 2,% 5 CO 2) Carbogenize.
- MM olarak, örneğin, iç çözeltisi hazırlayın: 140 K-glukonat, 7 KCI, 5 Hepes-asit, 0.5, MgCl2, 5 fosfat, 0.16 mM EGTA, 50 - 200 uM Alexa 488.
- Glutamat için mikro-iyontoforez 150 mM glutamik asit, bir çözelti hazırlamak ve NaOH ile pH değeri 7.0 'ye ayarlayın. 50 -200 mcM Alexa Fluor 488 veya görselleştirme için 594 hydrazide (Invitrogen) ekleyin.
- GABA iyontoforez 1 M'lik bir çözeltinin hazırlanması GABA ve HCl 15 5 ile, pH yi ayarlamak için. Bu pH GABA tahsil edilir de, ancak o zaman iyontoforez ile uygulanabilir. Çözümünde düşük pH GABA iletim kendisi 16,17 etkileyebilecek dışı alana atılan lütfen unutmayın.
Işıktan GABA çözüm korumak ve eski çözüm etkinliğini kaybedebilir çünkü sık sık, taze GABA stok solüsyon hazırlanır. - Bu GABAerjik olaylar, bir hi görmek zor isegh Cl - itici güç iç çözüm, KCl bırakarak, örneğin, GABA iyontoforez çalışıp çalışmadığını görmek için GABAerjik olayları görselleştirmek için yardımcı olabilir, ancak fizyolojik bir itici güç tavsiye olabilir sinaptik entegrasyon araştırmak. Küçük GABAerjik olayların genel tespiti için, Şekil 8C gösterilen bir protokol yardımcı olabilir.
3. İyontoforez Pipetler çekin ve test edin
- Genel olarak, doğru pipetler çekerek belki kontrollü nörotransmitter iyontoforez elde etmek için en kritik adımdır. Hücre kültüründe iyontoforez kullanırken, 10 keskin bir mikroelektrot benzer çok ince elektrotlar çekmek mümkündür. Bunlar, bir açı ile dokuya indirildiğinde akut dilimleri içinde patch-clamp deneylerde, ancak, bu çok ince olan pipetler imkansız derin dendrit ulaşmak için yapım kesit yüzeyi üzerinde eğilir.
- Bu nedenle, bu yüzden, çok küçük bir ucu ile bir pipet çekin hiçbir neurotransmitter dışarı sızıntı olabilir, ancak yine de ucu doku (Şekil 2) içine geçmek için yeterince sert olması gerekir. Veya P-97 Çektirme, Sutter Instrument Company, örneğin, 150 GB F 8P sınıf pipetler (Bilim Ürünleri, Hofheim, Almanya) ve yatay çektirmesi (örneğin bir DMZ-Evrensel Çektirme, Zeitz-Instruments GmbH, Martinsried, Almanya kullanın , dik bir açı ile (Şekil 2 ve Tablo 2) ile birlikte küçük bir delik, aynı zamanda, bir kısa uzantılar elde etmek için çeşitli çekme adımları Novato, CA).
- Bu iyontoforez pipetler 10 çekmek için kuvars cam pipetler kullanmak da mümkündür. Bu daha iyi mekanik özelliklere sahip olduğu ve daha güvenilir olması gerekiyordu, ancak özel lazer Elcikler gereklidir. Ama genellikle yama pipetler çekme için kullanılan normal bir cam pipet ile iyi sonuçlar elde etmek de mümkündür.
- İlk için kullanmadan önce, doku olmayan bir çember içinde pipet performans ve direnç testizaman, glutamat kaçak yana doku zarar verebilir.
- Doğru iyontoforez amplifikatör ayarlayın. Daha sonra nörotransmitter ve boya içeren çözüm ile pipet doldurun ve banyo (ACSF) içine yerleştirin.
- Kapasitans (Şekil 3) telafi. Genellikle çok keskin pipetler künt olanlardan daha yüksek bir kapasite olacak.
- Pipet direnci kontrol edin: Burada kullanılan mikro-iyontoforez amplifikatör pipet direnci ölçmek için bir yap-özelliği vardır. Bu standart bir osiloskop veya satın alma yazılımı ile bir bilgisayara bağlı bir A / D kurulu ile izlenebilir kısa dikdörtgen test darbeleri, çağrıştırıyor. Şekil ve ucu boyutuna bağlı olarak, uç 25 arasında bir dirence sahip olmalıdır - MQ 90.
- Pipet dışında floresan boya akarsa, bir 60X veya 40X suya daldırma hedefi ve floresan görüntüleme geçiş ile ve mümkünse ucu odaklanın, yaklaştırma, (glu durumunda küçük bir olumlu uygulamaktamate) veya negatif (GABA, Şekil 4 ile ilgili olarak) (<0.02 uA) akım korur. Bu kaçak iptal etmek için işe yaramazsa, pipet değiştirin.
- Güçlü bir adım mevcut uygulama veya manuel tetik kullanımı ve çözüm pipet dışına çıkarılır olabilir görmek için floresan görüntü ucu izlemek. Yukarıda belirtildiği gibi, mevcut darbe kutup çıkartılabilmesi için gerekiyordu molekülün yük bağlıdır. Glutamat çıkarmak için bir negatif akım ve GABA olumlu akım (Şekil 4) için. Olduğu
- Boya ve verici blok çıkarma, yüksek ejeksiyon akım birkaç kez uygulanarak giderilebilir ki pipet hava kabarcıkları var.
- Hiçbir görünür sızıntı olup testi ejeksiyon başarılı olup olmadığını, Birlikte ele alındığında, kapasite telafi ve deney başlar.
- Dikkat: kapasitans tazminat bir geri besleme devresi ile elde olduğundan, bu devre aşmayı olabilir veya overcomp ise salınımensated. Yavaşça kapasite tazminat için arama ayarını kullanın.
- Filament özellikleri değişmiş olabilir bu yana çektirmesi istikrar bağlı olarak bu, bazen zaman zaman çektirmenin ayarlarını yapmak için gereklidir. Bir kere iyi bir pipet tasarlanmıştır, ancak birkaç gün için kullanılabilir. Bu nedenle, bitirdikten sonra deney ucu zarar vermeden kapalı bir kapta iyontoforez pipet saklayın.
- Bir sonraki deneme nörotransmitter çözüm pipet doldurmak için, ucu açık ve daha sonra özellikleri (örneğin direnci) değişirse önemli ölçüde kontrol etmek için birkaç güçlü çıkarma bakliyat geçerlidir. Daha sonra kapasite telafi ve tekrar pipet kullanın. Farklı nörotransmitter çözümleri ile tek bir pipet kullanmayın.
4. Beyin Dilimleri hazırlayın
- Mikro-iyontoforez ilk defa kullanılırsa kesinlikle güvenilir çalışma çektirmesi programı kurduktan sonra dilimleri hazırlamak. <Kurumunuzun ya da yerel otoritenin hayvan bakımı kurallarına uygun olarak li> Perform anestezi ve baş kesme işlemleri.
- Beynin çıkarıldıktan sonra, buz soğuk ACSF sakaroz (Protokol 2.1) aktarın.
- Uygun kalınlıkta dilimler (örneğin 300 mikron) içine ilgi bölgesi kesin.
- 30 dakika boyunca 35 ° C'de ACSF sükroz dilimleri inkübe edin. Daha sonra, oda sıcaklığında normal ACSF içeren bir batık tutma odasına aktarabilirsiniz.
- Hazırlanması ve deney boyunca% 95 O 2,% 5 CO 2 ile dilim çevreleyen ACSF carbogenize.
5. Bir Tüm hücre Kayıt oluşturulması
- Tam hücreli modu kurduktan sonra, uzun süreli konumlandırma önlemek için, yama bir hücre önce dilim yüzeyine yakın zaten iyontoforez pipet (ler) yerleştirin.
- Düşük dirençli bir yama pipet (3 - MQ 5) çekin, d ile doldurunye iç çözüm içeren ve pipet pozitif basınç (30 - 60 mbar) geçerlidir.
- Görsel gözetiminde banyo ve yaklaşım hücre (kızılötesi Dodt kontrast veya iki foton degrade kontrast görüntü) girin.
- Gerilim kelepçe modunda bir test darbe (örneğin -10 mV, 20 msn) ile pipet direnci izleyin. Doku ofset potansiyel düzeltmek dokunurken.
- Hücre yaklaşım ve hafifçe açıkça görülebilir bir "çukur" kadar içine pipet itin. 60 mbar negatif basınç ve -65 mV membran potansiyeli geçiş - hemen pipet basınç serbest, 40 geçerlidir.
- Tutma akımı 100 pA altındaki değerler ulaştığında, negatif basınç bırakın.
- Bir giga mühür kurduktan sonra (direnci> 1 GΩ), pipet veya kapasitans tazminat devrenin kısa aşırı telâfi için kısa, güçlü emiş gücü ile kopma membran.
- Moda bağlı olarak (gerilim veya akım kelepçe) gereklidirdeneysel tasarım için, uygun telafi.
- Nihai konumuna iyontoforez pipet getirmek için başlayın. Başarılı bir yama kelepçe kayıtları gerçekleştirmek için nasıl daha ayrıntılı bir açıklama gerekiyorsa, 18,19 kullanılabilir harika birkaç kurallar vardır.
6. Iontophoretic Pipet yerleştirin ve postsinaptik Iontophoretic Potansiyel Oluştur
- Genel olarak, iyontoforez olaylar soma GABA ya da mikro-İyontoforez akson başlangıç çizgi parçasının, dendritik şaftında, glutamat mikro iyontoforez bir dikenli dendrit de, örneğin, arzu edilen deneye bağlı olarak tanımlanan konumlarda uyarılmış olabilir.
- Dokunmadan yaklaşık 1 mikron mesafe için hücre kadar Yaklaşım. Ilgi konumunu ulaştıktan sonra hiçbir nörotransmitter dışarı sızdıran ve pipet kapasitans doğru telafi olduğu olduğu çok önemlidir.
- Glutamat ile hücre yaklaşan iyontoforetik pipett doldurulduğundae membran potansiyeli tespit depolarizasyon neden, mümkünse mevcut korumak ayarlamak, ya da pipet değiştirin.
- , Kısa negatif akım darbeleri uygulayın sıfırdan başlayarak ve (örneğin 0,1-0,4 msn, 0,01-1 uA bakliyat) sistematik akım artar. Bu iyontoforez mevcut spesifik deneysel olarak istenen yanıtları set-up çağrıştıran hangi aralığında öğrenmek için yardımcı olur.
- Yanıt tespit varsa, pipet birkaç yüz mikrometre kaldırmak ve ucu temizlemek için (> 0.1 uA) güçlü bir çıkarma akımı uygulanır. , Kapasite tazminat ayarlayın hücre yaklaşım ve yeniden deneyin.
- Yanıt hala var ise, mevcut muhafaza azaltır. Bu işlem kontrolsüz nörotransmitter salınımına neden olabilir bu yana arama ayarlarını çok dikkatli olun. Bu nedenle, sürekli membran potansiyeli ilgili değişiklikleri tespit etmek için kayıt izlemek.
- Bu GABAerjik olayları tespit etmek zor ise, bir kullanmak yararlı olabilirn iç çözüm kompozisyon yüksek Cl verimli - itici güç. Bunu başarmak için, Cl azaltmak - pipet çözüm (. Protokol bölüm 2.6 bakınız) konsantrasyonu. Bu, daha yüksek bir itici güç nedeniyle istirahat membran potansiyeli büyük GABAerjik etkinlik ile sonuçlanır.
- Alternatif olarak, -100 mV -48 mV (Şekil 8C) için membran potansiyeli şansı sonuçlanan uzun geçerli adımları enjekte. Bu protokol ile Cl - itici güç bir depolarizan GABA tepki neden hiperpolarize potansiyelleri de artar.
- Bu olayların GABAerjik nedenini belirlemek için yardımcı olur uyarılmış olaylar, ters potansiyelini belirlemek için adım mevcut enjeksiyon protokolü kullanmak da mümkündür. GABA Kaçak glutamat sızıntı daha tespit etmek zordur. Bu durumda, giriş direnci bir sürekli izlenmesi GABA dolduran pipet yaklaştığı zaman, yardımcı olabilir. Giriş direnci azalır, geçerli olabilir b korumakE artan ya da farklı bir pipet kullanılmalıdır.
- Glutamat iyontoforez için kontrol deneyleri olarak, glutamat sızıntı neden olabileceği yerel kalsiyum girişini görselleştirmek için pipet çözüm 200 mcM OGB-1 ve hiçbir EGTA kullanarak, bir Ca 2 + görüntüleme deney öneririz.
- Genel olarak, kararlı bir yanıt elde etmek için zaman zarfında önlemek için mekanik olarak stabil bir pipet olması çok önemlidir. Drift sıcaklık değişimleri neden olabilir, bu nedenle ölçümlerin termal sürüklenme önlemek için önce en az yarım saat ekipman açmak için tavsiye edilir. Pipet tutucu iyi kartuş mühürler kullanmak ve ucu gerçekten sabit olduğundan emin olun. Sahibi kendisi ayrıca teflon bant ile tespit edilebilir, ayrıca, aynı zamanda kayması potansiyel bir kaynağı olan headstage veya manipülatör, gelen kabloları üzerinde herhangi bir gerilim olduğundan emin olun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İyontoforez mekansal yayılmasını belirlemek için basit bir yaklaşım, püskürtülen glutamat sabit tutarken, dendrit arasında aşamalı iyontoforetik pipet geri etmektir. Bir mikro-iyontoforetik stimülasyon mekansal ölçüde yaklaşık 12 mikron (Şekil 1 yarıçapı arası) bir çapa sahip olduğu bulundu. Ne iyontoforez kullanılabilir dokusunda derin pipet sertliği bağlıdır. Bununla birlikte, burada kullanılan dilimleri (Şekil 2), deneyler için gerekli olan iyontoforetik pipet, penetrasyon derinliği sınırlayıcı değildir. Bunun yerine optik sistem ve beyin dilim derinlemesine azalan çözünürlük sınırlayıcı faktördür. Kaliteli bir kayıt için hiçbir verici pipet dışarı sızıntı çok önemlidir. Bazal aniden olursa dendrit pipet ile ele olduğunda veya ani depolarizasyon varsa glutamat durumda, sızıntı tespit edilebilirolmayan (Şekil 5). Istikrarlı bir kayıt kurduktan sonra, bu dendritik ağacı (Şekil 6) boyunca herhangi bir yere bu teknik ile tanımlanan genlik, dendritik sivri veya eylem potansiyellerinin EPSPS uyandırmak mümkündür. Hızlı mikro-iyontoforez ile glutamat uygulayarak, EPSPS özelliklerini, kendi yayılma ve toplama, aynı anda farklı bile uzak yerlerde, (Şekil 7) incelenebilir. Ve olumlu bir çıkarma akımı: GABAerjik etkinlik, oldukça konsantre bir GABA çözeltisi (Protokol bkz. Bölüm 2) ile iyontoforez pipet doldurarak ikinci bir pipet ile glutamat için tek başına ya da ek olarak uyarılmış olabilir. Olayların GABAerjik doğası onaylamak için ve bir yüksek itici güç iç çözümü kullanarak değilse, algılamak için GABAerjik olayları kolaylaştırmak için basit bir protokol vardır: negatif akımları (yaklaşık 1 saniye enjekte, genlik ve giriş direnci bağlıdır hücre) hyperpolarising vo sonuçlananltage adımları, -100 mV civarında başlayan ve daha sonra 5 mV adım (Şekil 8) 'de artar. Çok olumsuz potansiyelleri de GABAerjik olaylar daha yüksek itici güç nedeniyle, tespit etmek kolaydır. Sinyalleri hesaplanan Cl etrafında tersine eğer - çözümleri için ters potansiyel, onlar (Şekil 8) doğada GABAerjik olması çok muhtemeldir. Ek GABA mikro-iyontoforez pipet ile,, dendritik diken ve IPSP göreli zamanlama (Şekil 9) değiştirerek, dendritik sodyum / kalsiyum sivri gibi, glutamaterjik olaylar, örneğin, GABAerjik inhibisyon etkisini araştırmak mümkündür iki olay, ya da genliklerinin göreli konumu. (Tüm hayvan deneyleri Hayvan Bakım ve kurallarına uygun olarak yapılan ve Bonn Üniversitesi'nde, Nörodejeneratif Hastalıklar ve devlet Northrhine-Westfalia için Alman Merkezi Kullanım Kurulu edildi.)
Şekil 1. Iontophoretically çıkarılır glutamat Mekansal ölçüde pipet geri çekme ile belirlenir. 100 mcM Alexa 594 ve başlangıç pozisyonuna (ölçek çubuğu 8 mikron) en iyontoforez pipet ile dolu bir CA1 piramidal hücre dendrit bir iki foton görüntü A) Maksimum yoğunluk projeksiyonu. Parçalar iyontoforez pipet geri çekilmesi ve soma kaydedilmiş olan ilgili iyontoforez EPSP göstermektedir. Ok iyontoforez pipet ucunun konumunu gösterir. EPSP genlik B) Mesafe bağımlılığı iyontoforez pipet ilk pozisyonu (≤ 1 mm uzakta dendrit, n = 6 şubelerinden) göre. Bu ile, sistematik geri çekilmeden pipet tarafından yayılan glutamat yarıçapı tahmin olabilir. Ankastre gösterir temsilcisi örnek izleri. Hata çubukları temsilortalama ± SEM. (Müller ve ark uyarlanmıştır. 2.012 9, Elsevier izniyle).
Şekil 2. Nasıl iyontoforez pipet gibi görünmelidir. Bir iyontoforez pipet A) Kızılötesi CCD görüntü bir 60X objektif kullanarak ölçekli. B) Iontophoretic pipet bir 60X objektif kullanarak küçük bir 5.5 MQ yama pipet göre. Kalibrasyon: küçük = 10 mikron.
Şekil 3,. Test-darbe (10 nA, 10 msn, npi elektronik, Tamm, en inşa kullanarak iyontoforez pipet kapasitans tazminatAlmanya). Doğru pipet direnci izlemek ve hızlı ve doğru nörotransmitter uygulama sağlamak için doğru kapasite telafi etmek için önemlidir.
Şekil 4. Mikro-iyontoforez ilkeleri. Tüm hücre yama-kelepçe yapılandırma ve glutamat ile dolu bir iyontoforez pipet bir CA1 piramidal nöron A) şematik çizimi. Glutamat olumsuz pipet uygulanan pozitif bir akım pipet dışarı sızmasını tutacak nedenle, tahsil edilir: Mevcut pozitiftir (sol panel) korumak. Pipetle glutamat çıkarmak için, bir negatif akım uygulamak (sağ panel). Bu şekilde glutamat pipet zorla ve postsinaptik hücrede uyarıcı olayları uyandırabilir. C B) şematik çizimiTüm hücre yama-kelepçe yapılandırma ve GABA ile dolu bir iyontoforez pipet A1 piramidal nöron. GABA olumlu bir düşük pH üzerinden ücretlendirilir. Bu nedenle, bir negatif akım pipet (sol panel) dışarı sızmasını tutacak. Çıkarmak için GABA olumlu akım (sağ panel) geçerlidir. Bu şekilde GABA pipet çıkar ve postsinaptik hücrede inhibitör olaylar uyandırabilir.
Şekil 5,. İyi ve kötü iyontoforez pipetler. Bir CA1 piramidal nöron bir dendritik şube oluşturulan bir iyontoforez glutamaterjik EPSP A) Temsilcisi örnek. B) bir iyontoforez dendritik başak Temsilcisi örnek pipet devam eden hafif glutamat sızıntı ile hipokampus CA1 alanında bir dendritik şube oluşturulur.
6 Şekil. Tek glutamat mikro-iyontoforez için Temsilcisi sonuçları. Bir yamalı CA1 piramidal nöron A) şematik çizim ve iyontoforez pipet glutamat ile dolu. B) EPSP glutamat iyontoforez ile bir CA1 piramidal nöron uyarılmış. C) dendritik Na + / Ca 2 + başak bir CA1 piramidal bir proksimal dendrit üzerinde uyarılmış nöron alt iz voltaj izleme eğimi göstermektedir, pik dendritik başak tepe eğim gösterir. bu eylem potansiyeli başlangıcından geçene kadar D) artırılırken EPSP iyontoforetik genlik uygulanan akım artacaktır.
"Fo: src =" / "src =" / files/ftp_upload/50701/50701fig7.jpg "/ files/ftp_upload/50701/50701fig7highres.jpg>
Şekil 7. Dendritik ağaç üzerinde farklı yerlerde çift glutamat mikro-iyontoforez için Temsilcisi sonuçları. Sırasıyla bir yamalı CA1 piramidal nöron ve iki iyontoforez pipetler glutamat ile dolu, bir proksimal üzerinde konumlandırılmış ve bir distal dendrit A) şematik çizim, bir CA1 piramidal nöron (1) bir proksimal dendrit üzerinde uyarılmış. B) Iontophoretic EPSP. C) Iontophoretic EPSP bir distal dendrit (2) de uyarılmış.
Şekil 8. GABA mikro-iyontoforez için Temsilcisi sonuçları. Bir yamalı CA1 piramidal nöron ve GABA ile dolu bir iyontoforez pipet A) şematik çizimi.B) Iontophoretic IPSP) bir CA1 piramidal nöron. C bir proksimal dendrit üzerinde sistematik -400 pA gelen uyarılmış olayın ters potansiyeli (mevcut enjeksiyon belirlemek için, yama pipet üzeri CA1 piramidal nöron için genlik değişen Uzun mevcut enjeksiyon uyarılmış 0 pA). Artifact GABA iyontoforez zaman noktası gösterir. Uyarılmış olay yaklaşık -70 mV (ok) bir ters gelebilecek olası.
9 Şekil. Aynı anda glutamat ve inhibisyon ve uyarma entegrasyonu araştırmak için GABA iyontoforez Temsilcisi sonuçları. Glutamat (yeşil) ve GABA (turuncu) ile dolu bir yamalı piramidal nöron ve bir pipet A) şematik çizimi. B) iontophoretically uyarılmıştek başına dendritik sivri, sonraki temizleyicileri olarak, düşük izleri dV / dt, zirveleri dendritik sivri gösterir gösterir. C) iontophoretically. D) Her iki, glutamaterjik ve GABAerjik olayları birlikte tek başına IPSP uyarılmış.
| Yer özgüllük | Verici özgüllük | Toksisite / yan etkileri | Presinaptik stimülasyon | Uzun süreli deneme | Maliyetler / karmaşıklık | |
| Mikro-iyontoforez | + + | + + + | + + | - | + + | + + |
| 2-foton Uncaging | + + + | + + + | + | - | + | + |
| Sinaptik stimülasyonu | - | - | + + + | + + + | + + + | + ++ |
Tablo 1. . Farklı teknikler karşılaştırılması avantajları ve teknikleri dezavantajları farklı kriterlere göre nöronlar uyarmak için (- = kötü, + = değil iyi, + + = iyi, + + + = iyi).
| Patch pipetler | Iyontoforez pipetler | |||
| P (A) Tek çekme Ön çeker | Son Çekme P (B) | P (A) Tek Çekişli Ön çeker | Son Çekme P (B) | |
| Isı H | 700 | 480 | 510 | 600 |
| Kuvvet Ön Çekme F (TH) | 018 | 035 | 018 | 008 |
| Mesafe Eşik s (TH) | 017 | 012 | 025 | 015 |
| Gecikme Heatstop t (H) | 050 | 030 | 050 | 030 |
| Mesafe Heatstop s (H) | 030 | 000 | 030 | 000 |
| Gecikme F (F1) | 000 | 136 | 000 | 050 |
| 1 F1 çekin zorlamak | 000 | 065 | 200 | 400 |
| Mesafe Çekme 2 s (F2) | 000 | 005 | 000 | 001 |
| 2 F2 çekin zorlamak | 000 | 080 | 000 | 095 |
| Ayarlayın (AD) | 121 | 000 | 121 | 000 |
Tablo 2'de. Örnek bir çektirmenin protokolü. Yatay çektirmesi için (DMZ-Yama ve iyontoforez pipetler hem GB150F-8P filamentler (Bilim Ürünleri, Hofheim, Almanya) kullanılarak evrensel Çektirme, Zeitz-Instruments GmbH, Martinsried, Almanya),.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada dendritler üzerinde sinaptik entegrasyon araştırmak için nörotransmitterlerin hızlı mikro-iyontoforez nasıl uygulanacağını açıklar. Bu teknik, başarılı bir şekilde, in vitro ve in vivo olarak 9,20-22, beynin farklı bölgelerinde ve glutamaterjik sinaptik transmisyonu GABAerjik araştırmak için kullanılmıştır. Mikro-iyontoforez 60 yılı aşkın süredir kullanılmaktadır, ancak erken yıllarda çoğunlukla yerel olarak yavaş ya da ara zaman çizelgesi 23 veya hücre 24 içine maddelerin mikroenjeksiyon için nörotransmitter ve ilaç uygulamak için kullanılmıştır.
Mikro-iyontoforez yüksek direnç elektrotlar 10,11 için hızlı kapasite tazminat ile donatılmıştır amplifikatörler, bu yana dendritik entegrasyon eğitim için özellikle ilginç bir araç haline geldi. Bu gelişme sayesinde rese postsinaptik tepkiler sonucu kısa dikdörtgen iyontoforez akımları, uygulamak mümkün oldudaha gerçekçi sinaptik olayların 10,25 zaman ders mbled.
Mikro-iyontoforez kurarken teknik gereksinimleri ve başa çıkmak için zorluklar nelerdir? Bir iyontoforez amplifikatör ince iyontoforez pipetler yüksek kapasite tazmini için izin gereklidir. Yüksek direnç, mikroelektrotla bağlantılı olarak yüksek hızda çalışma gerekli ise kapasite tazminat doğru ayarlama çok önemlidir. Kompanse başıboş kapasitanslar cihaz tarafından sağlanan iyontoforetik akımdan şarj ve bu nedenle uygulama yavaşlatır edilir. Düzgün bir kapasitans telafi önemli ve video ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Ayrıca, optik sistem doku foto-hasarı neden olmadan dendrit ve iyontoforetik pipet iyi bir floresan görüntü veren önemlidir. Optimal, iki foton sistemi kullanmak ve lazer gücü azaltmak ve ile kadar uyumlu kez beklemeiyi bir görüntü kalitesi. Daha geleneksel bir ışık kaynağı kullanıldığı takdirde, mekanik ya da elektriksel perdeler kullanılarak tetikleyerek, örneğin, mümkün olduğunca maruz kalma süresini azaltmak için emin olun. Muhtemelen en önemli noktası kullanılabilir nörotransmitter tanımlanmış ve belirli bir uygulama için sağlayacak pipet tasarımı vardır. Bu adım, biraz çaba ve en iyi ayarları bulmak için zaman gerektirir. Burada, diğer nörotransmitterlerin, blokerleri veya modülatör kullanılması durumunda, bu maddenin son derece dolu olduğunu daha da önemlisi konsantre ve olması gerekmektedir, glutamat ve GABA iyontoforez için protokoller mevcut. GABA 0, pH değeri sıfıra kadar bir net yüke sahip olduğundan, örneğin, pH, bir net pozitif yük ile sonuçlanan, (Protokol bakınız bölüm 2) ayarlanmalıdır.
Mikro-iyontoforez kurulduğunda, bu nöronlarda sinaptik bütünleşme çalışma uzun bir araç sağlayacaktır. Bu seçici ile ilgi sinaps uyarıcı sağlarbir nörotransmitter. Tanımlanan yerlerde, postsinaptik akımlar ve potansiyeller üzerine seçilen bir nörotransmitter kullanarak ve yayılma incelenebilir. Ayrıca, birkaç glutamaterjik girişlerin entegrasyonu araştırma ya da sistematik olarak göreli zamanlama veya olaylar gücünü değiştirmek için aynı anda birden fazla elektrot iyontoforetik kullanmak mümkündür.
Bazı genel kritik noktaları mikro-iyontoforez kullanırken dikkate alınması gerekir. Mikro-iyontoforez sonra nörotransmitter konsantrasyon Profil endojen sürümü farklıdır. Murnick ve diğerleri 10 iyontoforez ucu (msn 1) tahliye hızını bir milisaniye (0.2 msn) 26 fraksiyonları ortaya çıkar veziküller, gelen sinaptik sürüm çok daha yavaş olması muhtemeldir bildirdi. Ayrıca, ve sinaptik yarık gelen difüzyon olası konsantrasyon artışı ve iontophoretically uygulanan nörotransmitterlerin çürümesi yavaşlıyor.Ayrıca, çıkarılan nörotransmitter hacmi yüksek direnç elektrotlar, tek glutamaterjik ve GABAerjik postsynapses ile, ancak, fizyolojik olarak serbest hacimleri daha yüksek olması muhtemeldir mikro-iyontoforez 10-12 ile devreye sokulabilir. Birkaç mikrometre aralığında bir mekansal seçicilik, en son nörotransmitterlerin 3,4,27 iki-fotonlu Uncaging ile elde edilmiştir.
Çok daha maliyet yoğun iken, iki foton uncaging mikro-iyontoforez üzerinde birçok avantajı vardır. Özellikle birden fazla sinaptik aynı anda serbest bırakmak için nörotransmitter kullanılabilir ve ince bir elektrot ucu arasında hassas konumlandırma gerektirmez. Ancak, aynı zamanda belirli bir deney için bir yöntem seçerken dikkat edilmesi gereken bazı önemli dezavantajları vardır. Birçok kafesli bileşikler nörotransmitter reseptörlerinin 28 abluka gibi istenmeyen yan etkileri vardır. Örneğin, birçok glutamat, GABA kafesleriGABAerjik inhibisyonu ile etkileşime bildirilmiştir. Ayrıca, iki-fotonlu Uncaging için gerekli olan nispeten yüksek bir lazer güç uyarılması, birkaç dakika boyunca tekrar tekrar uygulanır, özellikle postsinaptik nöronların verilmedi-hasara neden olabilir. Mikro-iyontoforez uyarılan sitelerin sayısı sınırlı iken Ayrıca, bu siteler farklı beyin bölgelerinden katmanlı sinaptik giriş simüle etmek için, distal ve bazal dendritler, örneğin, bir nöronun bütün dendritik ağaç üzerinde serbestçe seçilebilir. İki foton uncaging, şu anda en çok gruplar tarafından kullanıldığı gibi, belirli bir odak düzlemde ve (genellikle 40X veya 60X suya daldırma) kullanılan objektif bağlıdır görüş alanı, sinaptik siteleri ile sınırlı olacaktır. Bu iki tekniğin her sonuçların yorumlanması güçleştirebilir extrasynaptic reseptörlerinin aktivasyonu, neden olduğu göz önünde bulundurulmalıdır.
Mikro-iyontoforez bir diğer dezavantajı o olduğununly postsynapse aktif hale getirilebilir. Presinaptik fonksiyonu ve vezikül-serbest nörotransmitter rolünü deneysel odak haline ayarlanması gerekiyorsa, yerel elektrik sinaptik stimülasyonu tercih edilen bir yöntem olabilir. Bununla birlikte, elektrik sinaptik stimülasyon dezavantajları mikro iyontoforez ile karşılaştırıldığında potansiyel olarak diğer nörotransmitter sistemleri (Tablo 1) ait, aktive sinaps bilinmeyen konumu ve farklı nöronal populasyonlardan akson eş aktivasyon vardır.
Özet olarak mikro-iyontoforez en önemli avantajı birkaç farklı nörotransmitter kullanmak ve bu dendritler 9 gibi nöronal bölmeleri üzerindeki etkileşimi incelemek mümkün olduğunu, bizim görüşümüze göre, bir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Dikkatle el yazması okumak için Hans Reiner Polder, Martin Fuhrmann ve Walker Jackson teşekkür ederim. , Nörodejeneratif Hastalıklar Mükemmeliyet Merkezleri (COEN, yazarlar devlet Northrhine-Westfalia (SR), hesaplama nörobilim BMBF-Projekträger DLR ABD-Alman işbirliği (SR CRCNS) araştırma MIWF Bakanlığı tarafından sağlanan fon aldı; SR) ve Bonn intramural finansman programının Üniversitesi (BONFOR, SR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin) | LaVision Biotec, Bielefeld, Germany | ||
| Two-photon laser scanning microscope Ultima IV | Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA | ||
| Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laser | Chameleon Ultra II, Coherent | ||
| 60X Objective, NA 0.9 | Olympus | ||
| Zeiss Axioskop 2 FS upright microscope | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Monochromator | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Micro-iontophoresis system MVCS-02 | NPI Electronics, Tamm, Germany | ||
| Sutter puller P-97 | Sutter Instrument Company, Novato, CA | ||
| Glass filaments (150 GB F 8P) | Science Products, Hofheim, Germany | ||
| Reagent | |||
| Alexa Fluor 488 hydrazide | Molecular Probes life technologies | A-10436 | |
| Alexa Fluor 594 | Molecular Probes life technologies | A-10438 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6297 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C5080 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M2670 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| K-Gluconate | Sigma Aldrich | G4500 | |
| HEPES-acid | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Phosphocreatin | Sigma Aldrich | P7936 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Glutamic acid | Sigma Aldrich | G8415 | |
| GABA | Sigma Aldrich | A5835 | |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | |
| HCl | Merck | 1.09108.1000 |
References
- Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neuroscience. 102, 527-540 (2001).
- Gasparini, S., Migliore, M., Magee, J. C. On the initiation and propagation of dendritic spikes in CA1 pyramidal neurons. J. Neurosci. 24, 11046-11056 (2004).
- Losonczy, A., Magee, J. C. Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuron. 50, 291-307 (2006).
- Remy, S., Csicsvari, J., Beck, H. Activity-dependent control of neuronal output by local and global dendritic spike attenuation. Neuron. 61, 906-916 (2009).
- Stuart, G., Schiller, J., Sakmann, B. Action potential initiation and propagation in rat neocortical pyramidal neurons. J. Physiol. 505 (Pt. 3), 617-632 (1997).
- Magee, J. C. Dendritic integration of excitatory synaptic input. Nat. Rev. Neurosci. 1, 181-190 (2000).
- Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31, 571-591 (1989).
- Miles, R., Toth, K., Gulyas, A. I., Hajos, N., Freund, T. F. Differences between somatic and dendritic inhibition in the hippocampus. Neuron. 16, 815-823 (1996).
- Muller, C., Beck, H., Coulter, D., Remy, S. Inhibitory control of linear and supralinear dendritic excitation in CA1 pyramidal neurons. Neuron. 75, 851-864 (2012).
- Murnick, J. G., Dube, G., Krupa, B., Liu, G. High-resolution iontophoresis for single-synapse stimulation. J. Neurosci. Methods. 116, 65-75 (2002).
- Liu, G., Choi, S., Tsien, R. W. Variability of neurotransmitter concentration and nonsaturation of postsynaptic AMPA receptors at synapses in hippocampal cultures and slices. Neuron. 22, 395-409 (1999).
- Renger, J. J., Egles, C., Liu, G. A developmental switch in neurotransmitter flux enhances synaptic efficacy by affecting AMPA receptor activation. Neuron. 29, (2001).
- Heine, M., et al. Surface mobility of postsynaptic AMPARs tunes synaptic transmission. Science. 320, 201-205 (2008).
- Somogyi, P., Klausberger, T. Defined types of cortical interneurone structure space and spike timing in the hippocampus. J. Physiol. 562, 9-26 (2005).
- Pugh, J. R., Jahr, C. E. Axonal GABAA receptors increase cerebellar granule cell excitability and synaptic activity. J. Neurosci. 31, 565-574 (2011).
- Mozrzymas, J. W., Zarnowska, E. D., Pytel, M., Mercik, K. Modulation of GABA(A) receptors by hydrogen ions reveals synaptic GABA transient and a crucial role of the desensitization process. J. Neurosci. 23, 7981-7992 (2003).
- Pasternack, M., Smirnov, S., Kaila, K. Proton modulation of functionally distinct GABAA receptors in acutely isolated pyramidal neurons of rat hippocampus. Neuropharmacology. 35, 1279-1288 (1996).
- Single-Channel Recording. , Springer. (2009).
- Davie, J. T., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nat. Protoc. 1, 1235-1247 (2006).
- Major, G., Polsky, A., Denk, W., Schiller, J., Tank, D. W. Spatiotemporally graded NMDA spike/plateau potentials in basal dendrites of neocortical pyramidal neurons. J. Neurophysiol. 99, 2584-2601 (2008).
- Rose, G. J. Combining pharmacology and whole-cell patch recording from CNS neurons, in vivo. J. Neurosci Methods. , (2012).
- Behrends, J. C., Lambert, J. C., Jensen, K. Repetitive activation of postsynaptic GABA(A )receptors by rapid, focal agonist application onto intact rat striatal neurones in vitro. Pflugers Arch. 443, 707-712 (2002).
- Hahnel, C. Practical Electrophysiological methods. Kettenmann, H., Grantyn, R. , Wiley-Liss. (1992).
- Wetzel, C. H., et al. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. J. Neurosci. 19, 7426-7433 (1999).
- Cash, S., Yuste, R. Linear summation of excitatory inputs by CA1 pyramidal neurons. Neuron. 22, 383-394 (1999).
- Eccles, J. C., Jaeger, J. C. The relationship between the mode of operation and the dimensions of the junctional regions at synapses and motor end-organs. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 148, 38-56 (1958).
- Kwon, H. B., Sabatini, B. L. Glutamate induces de novo growth of functional spines in developing cortex. Nature. 474, 100-104 (2011).
- Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Front Neural Circuits. 3, 2 (2009).
