Summary
Neste artigo, apresentamos rápido micro-iontoforese de neurotransmissores como uma técnica para investigar a integração de sinais de pós-sinápticos com alta precisão espacial e temporal.
Abstract
Um dos interesses fundamentais da neurociência é compreender a integração dos insumos excitatórios e inibitórios ao longo da estrutura muito complexa da árvore dendrítica, que eventualmente leva à produção neuronal de potenciais de ação no axônio. A influência de diversos parâmetros espaciais e temporais da entrada sináptica específica na saída neuronal está atualmente sob investigação, por exemplo, a atenuação dependente da distância das entradas dendríticas, a interação local-dependente de insumos espacialmente segregadas, a influência da inibição GABAergig na integração excitatório, linear e modos de integração não-lineares, e muitos mais.
Com o rápido micro-iontoforese de glutamato e GABA é possível investigar precisamente a integração temporal e espacial da excitação glutamatérgica e inibição GABAérgica. Requisitos técnicos críticos são ou uma lâmpada fluorescente triggered, diodo emissor de luz (LED), ou dois fótons scanning microscópio para visualizar ramificações dendríticas sem introduzir significativa da foto-dano do tecido. Além disso, é muito importante ter um amplificador de micro-iontoforese que permite a compensação de capacitância rápido de pipetas de alta resistência. Outro ponto crucial é que nenhum transmissor é involuntariamente divulgado pela pipeta durante o experimento.
Uma vez estabelecida, esta técnica vai fazer sinais fiáveis e reproduzíveis com um elevado neurotransmissor e especificidade de localização. Comparado ao glutamato e GABA uncaging, iontoforese rápida permite a utilização de ambos os transmissores, ao mesmo tempo mas em locais distantes, sem limitação para o campo de visão. Há também vantagens em comparação à estimulação elétrica focal de axônios: com micro-iontoforese a localização do local de entrada é definitivamente conhecido e é certo que só o neurotransmissor de interesse é liberada. No entanto, tem de ser considerado que, com micro-iontoforese apenas opostsynapse é ativado e os aspectos pré-sinápticos de liberação de neurotransmissores não são resolvidos. Neste artigo, vamos demonstrar como configurar o micro-iontoforese em experimentos fatia do cérebro.
Introduction
Os neurónios no sistema nervoso central receber uma variedade de entradas sinápticas em seus processos dendríticos finas e ramificadas 1. Ali, a maioria das entradas dendríticas excitatórios são mediadas por sinapses glutamatérgicas. Estes sinapses pode ser activado de um modo espacialmente distribuídos, resultando na integração linear pós-sináptico excitatório de potenciais pós-sinápticos (EPSPS). Se as sinapses são activados simultaneamente e em proximidade espacial do dendrito, estas entradas excitatórias podem ser integrados supra-linearmente e gerar picos dendrítica 2-5.
Além disso, a integração das entradas excitatórios depende da localização da entrada na árvore dendrítica. Os sinais que chegam à região tufo distal são muito mais atenuada do que entradas proximais, devido ao cabo de filtragem 6. No hipocampo, entradas distantes para os dendritos apicais de tufos são geradas por uma região do cérebro diferentes do que aqueles em proximal dendrites 7. Uma pergunta interessante é, portanto, como a entrada sináptica é processado por diferentes compartimentos dendríticas e se a integração dendrítica regula a influência desses insumos em camadas sobre a ativação neuronal em diferentes maneiras.
Não só as propriedades funcionais, as características morfológicas da dendrite, a localização ea aglomeração das entradas estão a afectar a integração dendrítica de entradas excitatórios, também as entradas inibidores adicionais de terminais GABAérgicos crucial determinar a eficácia das sinapses glutamatérgicas 8,9. Estes diferentes aspectos da integração sináptica pode ser idealmente investigada utilizando neurotransmissor micro-iontoforese, o que permite a aplicação espacialmente definido de diferentes neurotransmissores para domínios dendríticas. Nós demonstramos aqui como estabelecer com sucesso micro-iontoforese de glutamato e GABA para investigar integração de sinal em neurónios.
Para esta aplicação, de ponta finapipetas cheias de alta resistência, com soluções concentradas de neurotransmissores são utilizados. Estas pipetas estão posicionadas perto da membrana exterior da célula, onde os receptores de neurotransmissores estão localizados. É necessária uma boa visualização das ramificações dendríticas. Este é melhor conseguido usando corantes fluorescentes, que são introduzidos através da pipeta patch. Em seguida, um muito curto (<1 ms) impulso de corrente (no intervalo de 10 - 100 nA) é usado para ejectar as moléculas carregadas neurotransmissores. Com estes pulsos curtos e compensação da capacitância efectiva, potenciais pós-sinápticos ou as correntes podem ser evocados com alta precisão espacial e temporal, o que significa que a localização da entrada excitatória é precisamente conhecida. O glutamato de micro-iontoforese pode activar sinapses em um raio definido, que é menor do que 6 um, como mostrado (Figura 1 9), mas também é possível chegar a resolução sinapse único 10-12.
Heine, M., et ai 13. Com micro-iontoforese rápido é facilmente possível usar dois ou mais pipetas iontoforéticos e colocá-los em locais diferentes, mesmo distantes na árvore dendrítica. Deste modo, a integração de eventos excitatórios, incluindo aqueles a partir de diferentes vias, pode ser investigada. Também é possível utilizar um glutamato e uma pipeta cheia iontoforético GABA ao mesmo tempo. Deste modo, o efeito da inibição GABAérgica em locais diferentes em relação à entrada de excitação (no caminho, a inibição fora do caminho) pode ser estudada. Além disso, o impacto da inibição por interneurónios objectivo domínios neuronais específicos, como os dendritos distais, soma ou axónios 14, pode ser investigado utilizando iontoforese GABA. Em neurônios cultivados, micro-iontoforese rápida oferece a oportunidade de investigate distribuição sinapse único e os aspectos elementares da comunicação sináptica em neurônios em muito mais detalhe 10,11.
Neste artigo, demonstram em pormenor a forma de estabelecer iontoforese glutamato e GABA para uso em fatias cerebrais agudas, que permite a investigação de integração sináptica de entradas excitatórios e inibitórios na dependência da localização de entrada, as forças de entrada e de temporização, sozinho ou em interacção. Vamos apontar as vantagens e limitações dessa técnica e como solucionar problemas com sucesso.
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Protocol
1. Requisitos do Sistema
- Sistema de microscópio: boa visualização do dendrito é crucial. Se possível, use um sistema de microscópio de varredura a laser de dois fótons. Em nossos experimentos utilizamos um Scope TRIM II, LaVision Biotec, Bielefeld, Alemanha ou um sistema de Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin equipado com um Ti: Safira ultra-pulsada do laser (Chameleon Ultra II, Coherent) e um objetivo de alto NA (60X, 0,9 NA, Olympus) para visualizar os dendritos que tinham enchido com um corante fluorescente através da pipeta patch. Embora foto-dano é pensado para ser menos intensa utilizando a digitalização em 2 de fotões, reduzir a potência do laser (abaixo de 8 MW no tecido) e os tempos de temporização (inferior a 1 ms), ou tanto quanto possível.
- Uma segunda possibilidade é a de desencadear uma fonte de luz de fluorescência de campo amplo (diodo emissor de luz ou uma lâmpada fluorescente) em sincronia com a aquisição de reduzir o tempo de exposição tanto quanto possível. Temos usado um monocromador com uma fonte de luz integrada (TILLPhotônicos, Grafelfing, Alemanha) em uma Zeiss Axioskop 2 FS microscópio vertical que foi equipado com iluminação infravermelha Dodt contraste (TILLPhotonics, Gräfelfing, Alemanha). Em nossos experimentos tempos de exposição variaram de normalmente 10 ms máx. 30 ms.
- Usar um amplificador de micro-iontoforese rápido, por exemplo, um micro-sistema de iontoforese dois canais MVCS-C-02 (NPI electrónico, Tamm, Alemanha), com a compensação de capacitância rápido. Os microeléctrodos de iontoforese de ponta fina têm resistências de 25-100 mohms (crucialmente, dependendo do tamanho e da forma da ponta de pipeta), e tempos de subida rápida só pode ser alcançada se a compensação de capacitância do amplificador iontoforético está sintonizado de maneira óptima. Esta compensação rápida é necessária para aplicar os impulsos de corrente com um rápido início e curta na gama de sub-milisegundo para a pipeta iontoforético e, assim, para ejectar o transmissor com uma elevada resolução espacial no local tamanhos inferiores a 1 mícron 13. Amplificadores de iontoforese são alassim disponível a partir de várias outras empresas, que não têm testado em nosso laboratório. Estes dispositivos são de nosso conhecimento não equipada com circuito de compensação de capacitância.
2. Preparar soluções
- Prepare líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF) e solução interna, uma vez que é necessário para o projeto experimental. A única adição à solução interna, que é necessário, é um corante fluorescente vermelho ou verde (por exemplo, 50 a 200 fiM Alexa Fluor 488 ou 594 hidrazida, Invitrogen), dependendo do equipamento óptico. Aqui, um exemplo para ACSF sacarose, que pode ser utilizada para dissecação, em mM: NaCl 60, 100 de sacarose, 2,5 de KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, NaHCO 3 26, CaCl 2 1, 5 MgCl 2, 20 de glicose, e para ACSF normais solução para as experiências de patch-clamp em mM: 125 de NaCl, 3 de KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3, 2,6 CaCl2, 1,3 de MgCl2, 15 de glicose.
- Carbogenize (95% O2, 5% de CO 2) todas as soluções extracelulares constantemente.
- Preparar solução interna, por exemplo, em mM: 140 de K-gluconato, 7 KCl, HEPES 5-ácido, 0,5 MgCl2, 5 fosfocreatina, 0,16 EGTA, com 50-200 uM Alexa 488.
- Para micro-glutamato iontoforese preparar uma solução com ácido glutâmico 150 mM e ajustar o pH para 7,0 com NaOH. Adicionar 50 -200 mM Alexa Fluor 488 ou 594 hidrazida (Invitrogen) para visualização.
- Para iontoforese do GABA preparar uma solução 1 M de GABA e ajustar o pH a 5 com HCl 15. A este pH o GABA está carregada, então só pode ser aplicado utilizando a iontoforese. Por favor, note que o baixo pH da solução ejetado para o espaço extracelular pode efetuar-se a transmissão GABA 16,17.
Proteger a solução da luz GABA e freqüentemente preparar nova solução estoque GABA, uma vez que uma solução mais velhos podem perder a sua eficácia. - Se é difícil ver os eventos GABAérgicos, aparelhagem hiGH Cl - solução interna força motriz, por exemplo, por deixar de fora de KCl, pode ajudar a visualizar os eventos GABAérgicos para ver se a iontoforese GABA está a trabalhar, no entanto para investigar integração sináptica uma força motriz fisiológico pode ser recomendada. Para a detecção geral de pequenos eventos GABAérgicos, um protocolo mostrado na Figura 8C pode ajudar.
3. Puxe e testar as Pipettes Iontoforese
- Em geral, puxando as pipetas certas é talvez o passo mais importante para conseguir iontoforese neurotransmissor controlada. Quando se utiliza a iontoforese em cultura de células, é possível puxar eléctrodos muito finos semelhantes a microeléctrodos afiados 10. Em experimentos de patch-clamp em fatias agudas, no entanto, estas pipetas muito finas sobre a superfície curva da fatia quando eles são reduzidos no tecido com um ângulo, o que torna impossível atingir dendritos mais profundas.
- Portanto, puxe uma pipeta com uma ponta muito pequena, de modo que nenhum neurotransmitter pode vazar, mas a ponta tem de ser ainda suficientemente rígidos para penetrar no tecido (Figura 2). Por exemplo, use 150 GB F 8P pipetas classe (Science Products, Hofheim, Alemanha) e um puxador horizontal (por exemplo, um extrator DMZ-Universal, Zeitz-Instruments GmbH, Martinsried, na Alemanha, ou um extrator P-97, Sutter Instrument Company , Novato, CA), com várias etapas, puxando para alcançar uma abertura pequena, mas também a uma curta recolector com um ângulo agudo (Figura 2 e Tabela 2).
- Também é possível a utilização de pipetas de vidro de quartzo para puxar pipetas iontoforéticos 10. Estes são suposto ter melhores propriedades mecânicas e ser mais confiável, no entanto puxadores de laser especiais são necessários. Mas também é possível obter bons resultados com pipetas de vidro normais, os quais são normalmente utilizados para puxar pipetas remendo.
- Teste o desempenho da pipeta e resistência em uma câmara sem tecido, antes de usá-los pela primeiratempo, uma vez que fugas de glutamato pode danificar os tecidos.
- Configure o amplificador iontoforese corretamente. Em seguida, preencha a pipeta com o neurotransmissor e solução contendo corante e colocá-lo no banho (ACSF).
- Compensar a capacitância (Figura 3). Normalmente pipetas muito afiada terá uma capacidade maior do que os contundentes.
- Verificar a resistência da pipeta: O amplificador de micro-iontoforese usado aqui tem uma construção em característica para a medição da resistência da pipeta. Ela evoca breves pulsos de teste rectangulares, que podem ser monitorizados com um osciloscópio padrão ou uma placa de A / D ligado a um computador com o software de aquisição. Dependendo da forma e do tamanho do bico, a ponta deve ter uma resistência de entre 25-90 mohms.
- Concentre-se na ponta com uma objetiva de imersão em água ou 60X 40X e mudar a imagem fluorescente e, se possível, zoom in Se os vazamentos de corante fluorescente para fora da ponteira, aplique uma pequena positivo (no caso da gluTamate) ou negativo (no caso de GABA, Figura 4) reter corrente (<0,02 mA). Se isso não ajudar a cancelar o vazamento, mudar a pipeta.
- Aplicar uma forte corrente passo ou utilizar o disparador manual e monitorar a ponta na imagem de fluorescência para verificar se a solução pode ser ejectado para fora da pipeta. Como mencionado acima, a polaridade do impulso de corrente é, dependendo da carga da molécula que é suposto ser ejectado. Para ejectar o glutamato é uma corrente negativa e para o GABA uma corrente positiva (Figura 4).
- Bolhas de ar na pipeta que o bloco de ejeção de tinta e transmissor, pode ser apuradas através da aplicação de uma alta corrente de ejeção várias vezes.
- Tomados em conjunto, se não houver nenhum vazamento visível e ejecção teste foi bem sucedido, a capacitância de compensação e iniciar a experiência.
- Cuidado: Uma vez que a compensação de capacitância é conseguido através de um circuito de realimentação, este circuito pode ultrapassar ou oscilar, se for overcompensated. Com cuidado, use a configuração de discagem para a compensação de capacitância.
- Dependendo da estabilidade puxador é por vezes necessário para ajustar as definições puxador ao longo do tempo, uma vez que o filamento pode ter mudado propriedades. No entanto, uma vez que, se uma boa pipeta é concebido, que pode ser usado para vários dias. Portanto, depois de terminada a experiência armazenar a pipeta iontoforético em um recipiente fechado, sem danificar a ponta.
- Para a próxima experimento encher a pipeta com a solução de neurotransmissor, aplicar vários pulsos ejetar fortes para limpar a ponta e, em seguida, verificar se as propriedades (por exemplo, resistência) mudança significativa. Em seguida, compensar a capacitância e usar novamente a pipeta. Não use uma única pipeta com soluções diferentes neurotransmissores.
4. Prepare as fatias de cérebro
- Se micro-iontoforese é usado pela primeira vez definitivamente preparar as fatias após o estabelecimento de um programa de trabalho do extrator de forma fiável. <procedimentos li> Perform anestesia e decapitação, em conformidade com as diretrizes de cuidados de animais da sua instituição ou autoridade local.
- Após a remoção do cérebro, transferi-lo para ACSF gelado de sacarose (ver protocolo 2.1).
- Cortar a região de interesse em fatias de espessura adequada (por exemplo, 300 mm).
- Incubar as fatias em ACSF sacarose a 35 ° C durante 30 min. Em seguida, transferi-los para uma câmara de retenção submersa contendo ACSF normal, à temperatura ambiente.
- Durante a preparação e a experiência carbogenize ACSF em torno das fatias com 95% de O2, 5% de CO 2.
5. Estabelecer uma gravação de célula inteira
- Posicionar a pipeta iontoforese (s) já perto da superfície fatia antes de remendar uma célula, a fim de evitar o posicionamento de longa duração, após o que estabelece o modo de célula inteira.
- Puxe uma baixa resistência remendo pipeta (3-5 mohms), preenchê-lo com o dYE contendo solução interna e aplicar a pressão positiva para a pipeta (30 - 60 mbar).
- Entre no banho e abordagem da célula sob a orientação visual (contraste Dodt infravermelho ou dois contraste da imagem gradiente fóton).
- Monitorar a resistência da pipeta com um pulso de teste (por exemplo, -10 mV, 20 ms) no modo de fixação de tensão. Ao tocar no tecido corrigir o potencial de deslocamento.
- Aproxime-se do celular e empurre a ponta da pipeta até uma "covinha" pode ser visto claramente. Imediatamente após a libertação de pressão da pipeta, aplicam-se 40 - 60 mbar de pressão negativa e mudar o potencial da membrana a -65 mV.
- Quando a corrente de retenção atinge valores abaixo de 100 pA, solte a pressão negativa.
- Depois de estabelecer um selo giga (resistência> 1 GÊ), ruptura da membrana com um curto, forte sucção da pipeta ou breve sobrecompensação do circuito de compensação de capacitância.
- Dependendo do modo (fixador de tensão ou corrente) é necessáriapara o projeto experimental, compensar de forma adequada.
- Iniciar a trazer a pipeta iontoforético para a sua posição final. Se uma descrição mais detalhada de como executar com sucesso as gravações patch clamp é necessário, existem vários excelentes diretrizes disponíveis 18,19.
6. Coloque o Pipeta iontoforético e gerar um potencial iontoforético Postsynaptic
- Em geral, os eventos podem ser evocados iontoforéticos em locais definidos, dependendo da experiência desejada, por exemplo, a uma dendrite espinhoso para glutamato de micro-iontoforese, no eixo dendrítica, soma ou segmento inicial do axónio para o GABA micro-iontoforese.
- Aproxime-se da célula-se a cerca de 1 mM distância, sem tocá-lo. Depois de atingir a posição de interesse, é fundamental que não neurotransmissor está vazando e que a capacitância pipeta é compensado corretamente.
- Se se aproximar da célula com uma pipeta cheia glutamato iontoforéticoe provoca a despolarização detectável do potencial de membrana, ajustar a actual se possível manter ou mudar a pipeta.
- Aplicar negativos curtos impulsos de corrente, a partir de zero e aumentar a corrente sistematicamente (por exemplo, 0,1-0,4 ms, 0,01-1 uA pulsos). Isso ajuda a descobrir em qual faixa o atual iontophoretic evoca as respostas desejadas no experimental específico set-up.
- Se não houver resposta detectável, levante a pipeta várias centenas de micrómetros e aplicar uma forte corrente de ejecção (> 0,1 mA) para limpar a ponta. Ajuste a compensação de capacitância, a abordagem da célula, e tente novamente.
- Se ainda não houver resposta, reduzir a corrente de reter. Tenha muito cuidado com as configurações de discagem uma vez que este procedimento pode causar a liberação do neurotransmissor descontrolada. Portanto, monitorar constantemente a gravação para detectar respectivas alterações no potencial de membrana.
- Se é difícil detectar eventos GABAérgicos, pode ser útil usar umn composição da solução interna rendendo em um alto Cl - força motriz. Para alcançar este objectivo, reduzir o Cl - concentração da solução de pipeta (ver secção protocolo 2.6.). Isto irá resultar em acontecimentos GABAérgicos maiores em potencial de membrana em repouso, devido a uma força motriz superior.
- Em alternativa, injecta-se etapas correntes longas, resultando em membranas possibilidades potenciais de -100 mV a -48 mV (Figura 8C). Com este protocolo o Cl - força motriz é aumentada em potenciais hiperpolarizados causando uma resposta GABA despolarização.
- Também é possível utilizar o protocolo de injecção de corrente passo para determinar o potencial dos acontecimentos evocados, o que ajuda a determinar a natureza dos eventos GABAérgica reversão. Vazamento de GABA é mais difícil de detectar do que o vazamento de glutamato. Neste caso, um controlo constante da resistência de entrada pode ajudar, quando a pipeta cheia GABA é abordado. Se a resistência de entrada diminui, a corrente pode reter be aumento ou uma pipeta diferente deve ser usado.
- Como experiências de controlo para iontoforese glutamato, sugerimos a 2 + experimento de imagem de Ca, usando 200 uM OGB-1 e não na solução de EGTA a pipeta para visualizar o influxo de cálcio local que pode ser causada por vazamento de glutamato.
- Em geral, para conseguir uma resposta estável, é muito importante ter uma pipeta mecanicamente estável para evitar desvios ao longo do tempo. Tração pode ser causada por alterações da temperatura, por conseguinte, recomenda-se ligar o equipamento, pelo menos, meia hora antes das medições para evitar desvio térmico. Não se esqueça de usar bons selos de cartucho no suporte da pipeta ea dica é realmente fixo. O suporte propriamente dito pode ser adicionalmente fixado com fita de Teflon, além disso, ter a certeza de que não há tensão nos cabos do headstage ou manipulador, que é também uma fonte potencial de deriva.
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Representative Results
Uma abordagem simples para determinar a distribuição espacial da iontoforese é para retrair a pipeta iontoforético gradual do dendrito, mantendo constante o glutamato ejectado. Descobrimos que a extensão espacial de um micro-estimulação iontoforético tinha um diâmetro de cerca de 12 mM (Figura 1, que mostra o raio). Como profundamente no tecido a iontoforese pode ser utilizada dependerá da rigidez da pipeta. No entanto, as pipetas iontoforéticos necessários para as experiências em fatias (Figura 2), que são utilizados aqui, não estão a limitar a profundidade da penetração. Em vez do sistema óptico e a resolução diminuindo na profundidade da fatia de cérebro é o factor limitante. Para uma gravação de boa qualidade é fundamental que nenhum transmissor está vazando para fora da pipeta. No caso de o glutamato, uma fuga pode ser identificada se houver uma súbita quando despolarização do dendrito é abordado com a ponta da pipeta ou se a linha de base torna-se subitamenteestável (Figura 5). Depois de estabelecer uma leitura estável, é possível evocar EPSPs de amplitudes definidos, espigões dendríticas ou potenciais de acção com esta técnica em qualquer local ao longo da árvore dendrítica (Figura 6). Através da aplicação de glutamato com micro-iontoforese rápido, as propriedades dos EPSPs, a sua propagação e soma, simultaneamente em diferentes locais, mesmo distantes, pode ser investigado (Figura 7). GABAérgicos eventos podem ser evocados por si só ou em conjunto com glutamato, com uma pipeta de enchimento segundo a pipeta iontoforético com uma solução altamente concentrada de GABA (ver: secção Protocolo 2) e uma corrente de ejecção positiva. Há um protocolo simples para confirmar a natureza GABAérgica dos eventos e torná eventos GABAérgicos fácil de detectar, não se utilizando uma solução interna elevada força de condução: injectar correntes negativas (aproximadamente 1 seg, a amplitude depende da resistência de entrada do célula), resultando em hyperpolarising voltage etapas, a partir de cerca de -100 mV e, então, aumentar em 5 mV (Figura 8). Para potenciais muito negativos dos eventos GABAérgicos são mais fáceis de detectar, devido à força motriz superior. E, se os sinais de inverter todo o calculador Cl - potencial de inversão para as soluções, é muito provável que eles são de natureza GABAérgico (Figura 8). Com uma pipeta micro-GABA iontoforético adicional, é possível investigar, por exemplo, o efeito da inibição GABAérgica em eventos glutamatérgicos, como sódio / cálcio picos dendríticas, fazendo variar a temporização relativa de espiga e IPSP dendríticas (Figura 9), o localização relativa de ambos os eventos, ou as suas amplitudes. (Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes do Animal Care e do Comitê Use da Universidade de Bonn, o Centro Alemão de Doenças Neurodegenerativas e do estado Renânia do Norte-Westfalia).
Figura 1. Extensão espacial do glutamato iontoforeticamente ejetado determinada pela pipeta de retração. A) projeção de intensidade máxima de uma imagem de dois fótons de um CA1 dendrito da célula piramidal preenchido com 100 mM Alexa 594 eo iontophoretic pipeta na posição inicial (barra de escala 8 m). Inserções mostram retração da pipeta iontophoretic eo EPSP iontophoretic correspondente registrado na soma. A seta indica a posição da ponta da pipeta iontoforético. B) dependência Distância de EPSP de amplitudes em relação à posição inicial da ponta da pipeta iontoforético (≤ 1 um longe dendríticos, n = 6 ramos). Com isto, foi possível estimar o raio do glutamato espalhar retraindo sistematicamente a pipeta. O encarte mostra exemplos de traços representativos. As barras de erro representamsignifica ± SEM. (Adaptado de Müller et al. 9, 2012, reimpresso com permissão da Elsevier).
Figura 2. Como uma pipeta iontophoretic deve ser parecida. A) imagem infravermelho CCD de uma pipeta iontophoretic comparado a um pequeno 5.5 mohms remendo pipeta usando uma objetiva 60X. B) pipeta iontoforético com escala usando uma objetiva 60X. Calibração: menores = 10 um.
Figura 3. Compensação de capacitância da pipeta iontophoretic usando a compilação em test-pulso (10 nA, 10 ms, NPI eletrônico, Tamm,Alemanha). É importante para compensar a capacidade de controlar correctamente a resistência pipeta direita e para assegurar a aplicação neurotransmissor rápido e preciso.
Figura 4. Princípios de micro-iontoforese. A) Representação esquemática de um neurónio piramidal CA1 na configuração de patch-clamp de célula completa e uma pipeta iontoforético enchido com glutamato. O glutamato é carregada negativamente, portanto, uma corrente positiva aplicada à pipeta irá mantê-lo vaze da pipeta: A reter corrente é positivo (painel da esquerda). Para ejetar o glutamato da pipeta, aplicar uma corrente negativa (painel direito). Deste modo o glutamato é forçado para fora da pipeta e pode evocar eventos excitatórios na célula pós-sináptica. B) Desenho esquemático do CNeurónio piramidal A1 na configuração de patch-clamp de célula completa e uma pipeta iontoforético enchido com GABA. GABA é carregado positivamente, a um pH baixo. Portanto, a corrente negativa irá mantê-lo de vazar para fora da pipeta (painel esquerdo). Para ejetar GABA aplicar uma corrente positiva (painel direito). Desta forma GABA sai da pipeta e pode evocar eventos inibitórios na célula pós-sináptica.
Figura 5. Boas e más pipetas iontoforéticos. A) Exemplo representativo de uma EPSP glutamatergic iontophoretic gerado em uma filial dendrítica de um neurônio piramidal CA1. B) Exemplo representativo de uma iontophoretic dendrítica pico gerado um ramo dendríticas na área CA1 do hipocampo com o vazamento contínuo de glutamato leve a ponta da pipeta.
Figura 6. Os resultados representativos para o único glutamato micro-iontoforese. A) Representação esquemática de um patched piramidal CA1 neurónio e uma pipeta iontoforético enchido com glutamato. B) EPSP evocada num neurónios piramidais CA1 iontoforese com glutamato. C) dendríticas Na + / Ca2 + pico evocada num dendrito proximal de um piramidal CA1 neurónio, traço inferior mostra a inclinação do traçado de tensão, pico indica a inclinação máxima do pico dendrítica. D) Quando o aumento da corrente aplicada ao iontoforética da amplitude do EPSP irá aumentar até cruzar o limiar do potencial de acção.
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Figura 7. Os resultados representativos para o dobro glutamato micro-iontoforese em locais diferentes na árvore dendrítica. A) Representação esquemática de um patched piramidal CA1 neurónio e duas pipetas iontoforéticos enchido com glutamato, que são posicionados em uma extremidade proximal e uma distal do dendrito, respectivamente. B) EPSP iontoforético evocada num dendrito proximal de um neurónio piramidal CA1 (1). C) EPSP iontoforético evocada em um dendrito distal (2).
Figura 8. Os resultados representativos para GABA micro-iontoforese. A) Desenho esquemático de um patch CA1 piramidal neurônio e uma pipeta iontophoretic cheio de GABA.B) IPSP iontoforético evocada num dendrito proximal de um neurónio piramidal CA1. C) comprida de injecção de corrente de alterar sistematicamente amplitudes para um neurónio piramidal CA1 via pipeta de adesivo, para determinar o potencial de inversão do evento evocada (injecções correntes de -400 pA para 0 aa). Artefato indica tempo ponto de iontoforese GABA. O evento evocado indica um potencial de cerca de -70 mV (seta) reversão.
Figura 9. Os resultados representativos de glutamato simultânea e iontoforese GABA para investigar a integração de excitação e de inibição. A) Desenho esquemático de um neurônio piramidal remendado e uma pipeta cheia de glutamato (verde) e com GABA (laranja). B) iontoforeticamente evocadospikes dendríticas sozinho, em varreduras posteriores, traços inferiores mostram dV / dt, picos indicam picos dendríticas. C) iontoforeticamente evocado IPSP sozinho. D) Ambos os eventos, glutamatérgicos e gabaérgicos juntos.
| Localização especificidade | Especificidade transmissor | Efeitos tóxicos / lateral | Estimulação pré-sináptica | Experimento de longa duração | Custos / complexidade | |
| Micro-iontoforese | + + | + + + | + + | - | + + | + + |
| Dois fótons uncaging | + + + | + + + | + | - | + | + |
| Estimulação Synaptic | - | - | + + + | + + + | + + + | + ++ |
Tabela 1. . Comparação de diferentes técnicas Vantagens e desvantagens das técnicas para estimular os neurônios de acordo com critérios diferentes (- = mau, + = não ideal, + + = bom, + + + = melhor).
| Pipetas de patch | Pipetas iontoforese | |||
| Pré-puxa P (A) tração simples | Última Pull P (B) | Pré-puxa P (A) Pull Único | Última Pull P (B) | |
| Calor H | 700 | 480 | 510 | 600 |
| Força Pré Pull F (TH) | 018 | 035 | 018 | 008 |
| Distância Threshold s (TH) | 017 | 012 | 025 | 015 |
| Atraso Heatstop t (H) | 050 | 030 | 050 | 030 |
| Distância Heatstop s (H) | 030 | 000 | 030 | 000 |
| Atraso F (F1) | 000 | 136 | 000 | 050 |
| Uma força de tração F1 | 000 | 065 | 200 | 400 |
| Distância de puxar 2 s (F2) | 000 | 005 | 000 | 001 |
| Força de tração 2 F2 | 000 | 080 | 000 | 095 |
| Ajuste (AD) | 121 | 000 | 121 | 000 |
Tabela 2. Exemplarmente protocolo extrator. Para um puxador horizontal (DMZ-Universal Extrator, Zeitz-Instruments GmbH, Martinsried, Alemanha), utilizando filamentos GB150F-8P (Science Products, Hofheim, Alemanha), tanto para correção e pipetas iontoforéticos.
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Discussion
Aqui vamos explicar como aplicar rápida micro-iontoforese de neurotransmissores para investigar a integração sináptica em dendritos. Esta técnica tem sido utilizada com êxito para estudar a transmissão sináptica glutamatérgica e GABAérgicos em diferentes regiões do cérebro, in vitro e in vivo, 9,20-22. Micro-iontoforese tem sido usada há mais de 60 anos, mas nos primeiros anos era usado principalmente para se candidatar localmente neurotransmissores e drogas em escalas de tempo lenta ou intermédia 23 ou para microinjeção de substâncias nas células 24.
Micro-iontoforese tornou-se um meio particularmente interessante para o estudo da integração dendrítica desde a introdução dos amplificadores, que estão equipados com uma compensação de capacitância rápido dos eléctrodos de alta resistência 10,11. Com esta melhoria, tornou-se possível a aplicação de correntes iontoforéticos retangulares breves, resultando em respostas pós-sinápticas, que resembled de forma mais realista o curso do tempo de eventos sinápticos 10,25.
Quais são os requisitos técnicos e dificuldades para lidar com, no estabelecimento de micro-iontoforese? Um amplificador iontoforético é necessário que permite a compensação da capacitância alta das pipetas iontoforéticos finas. O ajuste correcto da compensação capacidade é muito importante se a operação de alta velocidade em conjunto com microeléctrodos de alta resistência é necessária. Capacitâncias de dispersão não compensadas são carregadas a partir da corrente iontoforética, que é fornecido pelo instrumento, e, portanto, diminui aplicação. Compensando a capacitância é crucial e devidamente explicado em detalhe no vídeo. Além disso, é importante que o sistema óptico dá uma boa imagem de fluorescência do dendrito e a pipeta iontoforético, sem indução de foto-dano do tecido. O ideal é usar um sistema de dois fótons e reduzir a potência do laser e tempos de permanência, tanto quanto compatível comuma qualidade de imagem decente. Se for utilizada uma fonte de luz mais convencional, certifique-se a reduzir o tempo de exposição tanto quanto possível, por exemplo, utilizando obturadores mecânicos ou desencadeamento eléctrico. Provavelmente, o ponto mais crítico é o desenho da pipeta, o que irá permitir uma aplicação definida e específica do neurotransmissor utilizado. Esta etapa exige algum esforço e tempo para encontrar as configurações ideais. Aqui, nós apresentamos os protocolos para iontoforese glutamato e GABA, se outros neurotransmissores, bloqueadores ou moduladores são utilizados, é necessário que a substância é altamente concentrada e ainda mais importante, que a ela é carregada. Por exemplo, uma vez que o GABA tem uma carga líquida igual a zero, a um pH de 0, o pH tem de ser ajustado (ver secção Protocolo 2), resultando numa carga líquida positiva.
Quando micro-iontoforese é estabelecida, que irá fornecer um conjunto de ferramentas estendida para estudar a integração sináptica em neurônios. Ele permite estimular sinapses de interesse selectivamente comum neurotransmissor específico. Usando um neurotransmissor selecionados em locais definidos, correntes e potenciais pós-sinápticos e sua propagação pode ser investigado. Além disso, é possível utilizar simultaneamente vários eléctrodos iontoforéticos para investigar a integração de várias entradas glutamatérgicos ou alterar sistematicamente o tempo relativo ou a força de eventos.
Alguns pontos críticos gerais devem ser considerados quando se utiliza micro-iontoforese. O perfil da concentração do neurotransmissor após micro-iontoforese é diferente da libertação endógena. Murnick e outros 10 relatou que a velocidade de libertação a partir da ponta de iontoforese (cerca de 1 ms) é provável que seja significativamente mais lenta do que a partir das vesículas sinápticas de libertação, o que ocorre em milésimos de segundo (0,2 ms) 26. Além disso, a difusão a partir de e para a fenda sináptica é provavelmente retardando subida e decaimento de concentração de neurotransmissores iontoforeticamente aplicado.Além disso, o volume de neurotransmissor ejectado é susceptível de ser maior do que os volumes fisiologicamente divulgados, no entanto, com os eléctrodos de alta resistência, único glutamatérgicos e postsynapses GABAérgicos poderia ser activado utilizando micro-iontoforese 10-12. Uma selectividade espacial na gama de alguns micrômetros recentemente também tem sido conseguida por uncaging dois fotões de neurotransmissores 3,4,27.
Enquanto consideravelmente mais dispendiosa, uncaging dois fotões possui várias vantagens sobre os micro-iontoforese. Em particular, ele pode ser usado para a libertação de neurotransmissores, simultaneamente em múltiplos sítios sinápticos e não exige o posicionamento exacto de uma ponta de eléctrodo fino. Contudo, também tem algumas desvantagens importantes a ser considerado na escolha de um método para uma experiência em particular. Muitos compostos enjaulados têm efeitos colaterais indesejados, tais como o bloqueio de receptores de neurotransmissores 28. Por exemplo, muitos glutamato e GABA gaiolasTem sido relatado que interferem com a inibição GABAérgica. Além disso, a potência relativamente elevada do laser necessária para uncaging dois fotões pode resultar no foto-dano do neurónio pós-sináptico, particularmente quando a estimulação é aplicada várias vezes ao longo de vários minutos. Além disso, enquanto a micro-iontoforese é limitada no número de locais estimulados, estes locais podem ser escolhidos livremente na árvore dendrítica inteiro de um neurónio, por exemplo, sobre as dendrites distais e basal, para simular a entrada sináptica em camadas a partir de diferentes regiões do cérebro. Dois fótons uncaging, como é atualmente usado pela maioria dos grupos, será limitado a sítios sinápticos em um plano focal particular e no campo de visão, o que depende do objetivo usado (normalmente 40X ou imersão em água 60X). Tem de ser considerado que ambas as técnicas sempre conduzem à activação de receptores extrasynaptic, o que pode dificultar a interpretação dos resultados mais difícil.
Outra desvantagem da micro-iontoforese é que oSomente as postsynapse pode ser ativado. Se a função de pré-sináptico eo papel da vesícula-lançado neurotransmissor precisa ser definida para o foco experimental, a estimulação sináptica elétrica local pode ser um método de escolha. No entanto, as desvantagens de estimulação sináptica eléctrica em comparação com micro-iontoforese são a localização desconhecida das sinapses activados e a co-activação de axónios a partir de diferentes populações neuronais, potencialmente, pertencentes a outros sistemas de neurotransmissores (Tabela 1).
Em resumo, a vantagem mais importante do micro-iontoforese é, na nossa opinião, de que é possível a utilização de vários neurotransmissores diferentes e estudar sua interação em compartimentos neuronais como dendrites 9.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos Hans Reiner Polder, Martin Fuhrmann e Walker Jackson para a leitura atenta do manuscrito. Os autores receberam financiamento que foi fornecido pelo Ministério da pesquisa MIWF do estado Renânia do Norte-Westfalia (SR), o BMBF-Projekträger DLR colaboração EUA-alemão em neurociência computacional (CRCNS; SR), Centros de Excelência em Doenças Neurodegenerativas (COEN; SR), e da Universidade de Bonn programa de financiamento intramural (BONFOR; SR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin) | LaVision Biotec, Bielefeld, Germany | ||
| Two-photon laser scanning microscope Ultima IV | Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA | ||
| Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laser | Chameleon Ultra II, Coherent | ||
| 60X Objective, NA 0.9 | Olympus | ||
| Zeiss Axioskop 2 FS upright microscope | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Monochromator | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Micro-iontophoresis system MVCS-02 | NPI Electronics, Tamm, Germany | ||
| Sutter puller P-97 | Sutter Instrument Company, Novato, CA | ||
| Glass filaments (150 GB F 8P) | Science Products, Hofheim, Germany | ||
| Reagent | |||
| Alexa Fluor 488 hydrazide | Molecular Probes life technologies | A-10436 | |
| Alexa Fluor 594 | Molecular Probes life technologies | A-10438 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6297 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C5080 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M2670 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| K-Gluconate | Sigma Aldrich | G4500 | |
| HEPES-acid | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Phosphocreatin | Sigma Aldrich | P7936 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Glutamic acid | Sigma Aldrich | G8415 | |
| GABA | Sigma Aldrich | A5835 | |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | |
| HCl | Merck | 1.09108.1000 |
References
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