Summary
이 문서에서 우리는 높은 공간과 시간적 정밀도 시냅스 신호의 통합을 조사하는 기술로 신경 전달 물질의 빠른 마이크로 이온 도입을 소개합니다.
Abstract
신경 과학의 근본적인 관심사 중 하나는 결국 축삭의 행동 잠재력의 신경을 출력한다 수지상 나무의 매우 복잡한 구조를 따라 흥분성과 억제 입력의 통합을 이해하는 것입니다. 신경 세포의 출력에 대한 특정 시냅스 입력의 다양한 공간적 매개 변수의 영향은 돌기 입력의 거리에 의존 감쇠, 공간적으로 분리 된 입력의 위치에 따라 상호 작용, 흥분 통합, 선형에 GABAergig 억제의 영향을 예를 들어, 현재 조사 중입니다 비선형 통합 모드, 그리고 더 많은.
글루타민산 염과 GABA의 빠른 마이크로 이온 도입으로 정확하게 글루타메이트 흥분과 GABA 성 억제의 공간적 통합을 조사 할 수 있습니다. 중요한 기술적 요구 사항 중 하나를 트리거 형광 램프, 발광 다이오드 (LED), 또는 두 광자 SCA 있습니다조직의 중요한 사진 피해를 도입하지 않고 돌기 가지를 시각화하는 현미경을 nning. 또한, 높은 저항 피펫의 빠른 용량 보정을 허용하는 마이크로 이온 도입 앰프를 가지고하는 것이 매우 중요합니다. 또 다른 중요한 점은 송신기가 무의식적으로 실험 기간 동안 피펫에 의해 발표되지 않은 것입니다.
일단 설정되면,이 기술은 높은 신경 전달 물질 및 위치 특이성과 신뢰성 및 재현성 신호를 제공합니다. 글루타메이트와 GABA의 uncaging에 비해 빠른 이온 도입이 시야에 제한없이 같은 시간에하지만, 아주 먼 위치에서 두 송신기를 사용하실 수 있습니다. 이 축삭의 초점 전기 자극에 비해 장점도있다 : 마이크로 이온 도입으로 입력 사이트의 위치는 확실히 알려져있어 관심에만 신경 전달 물질이 방출되어 있는지 확인합니다. 그러나 그와 함께 마이크로 이온 도입 전용으로 간주되어야한다postsynapse이 활성화되고 신경 전달 물질 방출의 연접 양상이 확인되지 않습니다. 이 문서에서 우리는 뇌 절편 실험에서 마이크로 이온 토 포레 시스를 설정하는 방법을 보여줍니다.
Introduction
중추 신경계의 뉴런은 얇은를내는 돌기 프로세스 1 시냅스 다양한 입력을받을 수 있습니다. 거기 흥분성 돌기 입력의 대부분은 글루타메이트 시냅스에 의해 매개된다. 이 시냅스는 흥분성 시냅스 후 전위 (EPSPS)의 시냅스 선형 통합의 결과, 공간적으로 분산 된 방식으로 활성화 할 수 있습니다. 시냅스가 동시에 돌기에 공간 근거리에서 활성화 된 경우 이러한 흥분성 입력은 위에 선형으로 통합 돌기 스파이크 2-5을 생성 할 수 있습니다.
또한, 흥분성 입력의 통합은 수지상 나무의 입력의 위치에 따라 달라집니다. 말초 술 지역에 도착 신호가 훨씬 더 감쇠 케이블 필터링 6에 의한 근위 입력보다. 해마에서 정점 술의 돌기에 먼 입력은 인접 dendri에 비해 다른 뇌 영역에 의해 생성되는TES 7. 흥미로운 질문은 따라서, 어떻게 시냅스 입력을 다른 돌기 구획에 의해 처리하고 돌기 통합은 여러 가지 방법으로 신경 세포의 발화에서 이러한 계층 입력의 영향을 조절합니다.합니다
기능적 속성, 수상 돌기의 형태 학적 특징뿐만 아니라, 입력의 위치와 클러스터링 결정적 글루타메이트 시냅스 8,9의 효능을 결정 또한 흥분성 입력, GABA 성 터미널에서 추가 금지 입력의 돌기 통합에 영향을주지 않습니다. 시냅스 통합의 서로 다른 측면을 이상적으로 돌기 도메인에 서로 다른 신경 전달 물질의 공간적 정의 응용 프로그램을 허용 신경 전달 물질의 마이크로 이온 도입을 사용하여 조사 할 수 있습니다. 우리는 성공적으로 뉴런의 신호 통합을 조사하는 글루타민산 염과 GABA의 마이크로 이온 토 포레 시스를 설정하는 방법을 여기에서 보여줍니다.
이 응용 프로그램, 뾰족한위한집중 신경 전달 물질의 솔루션으로 가득 고 저항 피펫이 사용됩니다. 이 피펫은 신경 전달 물질 수용체가있는 세포의 외부 막에 가까운 위치에 있습니다. 수지상 가지의 좋은 시각화가 필요합니다. 이 최고의 패치 피펫을 통해 도입 된 형광 염료를 사용하여 수행됩니다. 그런 다음 매우 짧은 (<1 밀리 초) 전류 펄스는 (10의 범위 - 100 NA) 청구 신경 전달 물질의 분자를 추출하는 데 사용됩니다. 이 짧은 펄스 및 효과적인 커패시턴스 보상, 시냅스 후 전위 또는 전류는 흥분성 입력의 위치를 정확하게 알려진 의미 높은 시간적 및 공간적 정밀도로 유발 될 수 있습니다. 글루타민산 마이크로 이온 토 포레 시스 (그림 1 9) 여기에 표시된대로 6 μm의보다 작은 정의 된 반경에 시냅스를 활성화 할 수 있지만, 단일 시냅스 해상도 10-12에 도달 할 수도 있습니다.
하이네, M., 외 13의 2 광자 uncaging을 달성 반점의 크기보다 작은 0.5 μm의 아래 사이즈를 발견 조정할 수 있습니다 것을 보여 주었다. 빠른 마이크로 이온 도입으로 두 개 이상의 iontophoretic 피펫을 사용하여 수지상 나무의 다른도 먼 장소에 배치 쉽게 할 수 있습니다. 이러한 방법으로, 서로 다른 경로에서 포함 흥분성 이벤트의 통합을 조사 할 수 있습니다. 그것은 동시에 글루타민산 염과 GABA 채워진 iontophoretic 피펫을 사용하는 것도 가능하다. 이 방법으로 흥분성 입력 (에 경로, 오프 경로 억제)을 기준으로 서로 다른 위치에서 GABA 성 억제의 효과를 연구 할 수 있습니다. 또한, 특정 신경 도메인을 대상의 interneurons에 의한 억제 효과는 말초 돌기처럼, 소마 또는 축삭 14, GABA 이온 도입을 사용하여 조사 할 수 있습니다. 배양 된 뉴런, 빠른 마이크로 이온 도입은 이전 inve 수있는 기회를 제공합니다더 자세한 10,11의 뉴런에서 단일 시냅스 분포와 시냅스 통신 초등학교 측면을 stigate.
이 문서에서 우리는 입력 위치 입력 강점과 타이밍, 단독으로 또는 상호 작용에의 의존에서 흥분성과 억제의 입력 시냅스 통합 조사를 허용 급성 뇌 조각에 사용하기 위해 글루타민산 염과 GABA 이온 도입을 설정하는 방법을 자세히 보여줍니다. 우리는 장점과 제한 사항이 기술을 어떻게 성공적으로 해결하는 방법을 가리 킵니다.
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Protocol
1. 시스템 요구 사항
- 현미경 시스템 : 수상 돌기의 좋은 시각화 중요합니다. 가능한 경우, 두 광자 레이저 스캐닝 현미경 시스템을 사용합니다. 사파이어 초고속-펄스 레이저 (카멜레온 울트라 II, 코 히어 런트)와 높은 NA 목적 : 본 실험에서 우리는 티타늄을 갖춘 TRIM 범위 II, LaVision 바이오텍, 빌레펠트, 독일, 울티마 IV 시스템, 프레리 기술, 매디슨, 위스콘신 사용 (60X, 0.9 NA, 올림푸스) 우리는 패치 피펫을 통해 형광 염료로 가득했던 돌기를 시각화 수 있습니다. 사진 손상이 2 광자 스캔을 사용하여 덜 심각한 것으로 생각되지만, 레이저 전력을 감소 (조직에서 아래의 8 MW) 및 체류 시간 (아래 1 마이크로 초) 또는 가능한 한 많이.
- 두 번째 가능성은 최대한 노출 시간을 줄이기 위해 인수 기적 넓은 필드 형광 광원 (LED 또는 형광 램프)을 유발하는 것입니다. 우리는 통합 된 광원 (TILLPho과 단색을 사용했습니다Dodt 대비 적외선 조명 (TILLPhotonics, Grafelfing에서, 독일)가 장착 된 자이스 Axioskop 2 FS 직립 현미경 토닉, Grafelfing에서, 독일). 우리의 실험에서 노출 시간을 밀리 일반적으로 10에서 최대였다. 30 밀리.
- 2 채널 마이크로 이온 도입 시스템을 예를 들어 MVCS-C-02 (NPI 전자, 탐, 독일)의 빠른 용량 보정., 빠른 마이크로 이온 도입 앰프를 사용 뾰족한 이온 도입 미세 전극은 25 저항이 - MΩ 100 (결정적 팁 크기와 피펫 모양에 따라), 그리고 iontophoretic 앰프의 용량 보정이 최적으로 조정되어있는 경우 빠른 상승 시간은 달성 될 수있다. 이 빠른 보상 iontophoretic 피펫을 밀리 초 이하의 범위에서 간단하고 신속한 증상과 전류 펄스를 적용함으로써 1 ㎛ 13 아래에 자리 크기의 높은 공간 해상도를 가진 송신기를 배출 할 필요가 있습니다. 이온 도입 앰프 알 수 있습니다우리가 실험실에서 테스트하지 않은 여러 다른 회사에서 너무 없습니다. 이 장치는 정전 용량 보상 회로가 장착되어 있지 우리의 지식이다.
2. 솔루션을 준비합니다
- 인공 뇌척수 (ACSF)과는 실험 설계에 필요한되는 내부 솔루션을 준비합니다. 필요한 내부 솔루션에 유일한 추가는 광학 기기에 따라 빨간색이나 녹색 형광 염료 (예 : 50-200 μM 알렉사 형석 488 또는 594 하이 드라 지드, Invitrogen 사)입니다. 정상 ACSF을 위해, 60 염화나트륨, 100 자당, 2.5 KCl을, 1.25의 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3를 1 염화칼슘 2, 5 MgCl 2, 20 포도당 : MM의 해부에 사용할 수 ACSF 자당, 여기 예제 밀리미터에있는 패치 클램프 실험 해결책 : 125의 NaCl, 3 KCl을, 1.25의 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3를 2.6 염화칼슘, 1.3 MgCl 2, 15 포도당.
- 모든 세포 솔루션을 지속적으로 (95 % O 2 5 % CO 2) Carbogenize.
- 밀리미터, 예를 들어, 내부 솔루션을 준비 : 140 K-글루코 네이트, 7 KCl을, 5 HEPES-산, 0.5 MgCl 2, 5 포스 포 크레아틴 (phosphocreatine), 176 EGTA, 50과 - 200 μM 알렉사 488.
- 글루타민산 염에 대한 마이크로 이온 토 포레 시스는 150 밀리미터 글루탐산과 솔루션을 준비하고 수산화 나트륨으로 7.0으로 산도를 조정합니다. 50 -200 μM 알렉사 형석 488 또는 시각화를위한 594 하이 드라 지드 (Invitrogen 사)를 추가합니다.
- GABA의 이온 도입이 1 M GABA 솔루션을 준비하고 염산 15 5 산도를 조정합니다. pH가 GABA가 충전에 만 다음은 이온 도입하여 적용 할 수 있습니다. 솔루션의 낮은 pH는 GABA 전송 자체 16,17 영향을 미칠 수있는 세포 공간으로 배출 양해 바랍니다.
빛으로부터 GABA 솔루션을 보호하고 오래된 솔루션은 그 효과를 잃을 수 있기 때문에 자주 신선한 GABA 재고 솔루션을 준비합니다. - 그것은 GABA 성 이벤트, 안녕을 확인하기 어려운 경우GH 염소 - 구동력 내부 솔루션은 KCl을을 떠나는하여 예를 들어, GABA 이온 도입이 작동하는지 확인합니다 GABA 성 이벤트를 시각화하는 데 도움이 될 수 있지만 생리적 원동력이 권장 될 수 시냅스 통합을 조사 할 수 있습니다. 작은 GABA 성 이벤트의 일반적인 탐지를 위해, 그림 88에 표시된 프로토콜은 도움이 될 수 있습니다.
3. 이온 도입 피펫을 당겨 테스트
- 일반적으로, 오른쪽 피펫을 당기는 것은 어쩌면 조절 신경 전달 물질의 이온 도입을 달성하기 위해 가장 중요한 단계입니다. 세포 배양에 이온 도입을 사용할 때, 10 날카로운 미세 전극과 유사한 매우 미세한 전극을 가져올 수 있습니다. 그들은 각도 조직으로 낮출 때 심각한 조각에 패치 클램프 실험에서는, 그러나,이 매우 얇은 피펫은 불가능 깊은 수상 돌기에 도달하기 위해 만드는 조각 표면에 구부립니다.
- 따라서, 그래서 아주 작은 팁 피펫을 잡아 그 없음 해당 없음eurotransmitter은 누설 할 수 있지만, 끝은 여전히 조직 (그림 2)에 침투 할만큼 충분히 단단해야합니다. 또는 P-97 풀러, 서터 악기 회사, 예를 들어, 150기가바이트 F 8P 클래스 피펫 (과학 제품, 호프 하임, 독일)와 수평 풀러 (예를 들어 DMZ-유니버셜 풀러, 이츠 - 악기 GmbH를, Martinsried, 독일 사용 , 가파른 각도 (그림 2 및 표 2)와 작은 오프닝뿐만 아니라 짧은 꼭지를 달성하기 위해 여러 당기는 단계 노바 토, CA).
- 그것은 iontophoretic 피펫에게 10를 가져 오기 위해 석영 유리 피펫을 사용하는 것도 가능하다. 이들은 더 나은 기계적 성질을 가지고하고보다 신뢰할 수 있어야되지만 특수 레이저 풀러가 필요합니다. 그러나 일반적으로 패치 피펫을 당기에 사용되는 정상적인 유리 피펫, 좋은 결과를 얻을 수도 있습니다.
- 처음 그들을 사용하기 전에 조직이없는 약실에있는 피펫 성능 및 저항 테스트시간은 글루타민산의 누설 때문에 조직을 해칠 수 있습니다.
- 제대로 이온 도입 앰프를 설정합니다. 그런 신경 전달 물질과 염료 함유 용액에 피펫을 채우고 욕조 (ACSF)에 넣습니다.
- 정전 용량 (그림 3)을 보상한다. 일반적으로 매우 날카로운 피펫은 무딘 것보다 더 높은 용량을 갖게됩니다.
- 피펫의 저항을 확인하십시오 : 여기에 사용되는 마이크로 이온 도입 앰프는 피펫 저항을 측정하기위한 빌드에서 기능이 있습니다. 그것은 표준 오실로스코프 수집 소프트웨어와 컴퓨터에 연결된 A / D 보드를 모니터링 할 수있는 간단한 직사각형 테스트 펄스를 불러 일으킨다. 모양과 팁 크기에 따라 끝에서 25 사이의 저항이 있어야합니다 - MΩ 90.
- 피펫 팁 밖으로 형광 염료가 누수 60X 또는 40X 물 침지 목표 및 형광 이미징 스위치로 가능하다면 팁에 초점, 확대 (글루의 경우 작은 양을 적용tamate) 또는 부정이 (GABA, 그림 4의 경우) (<0.02 μA) 현재 유지합니다. 그 누설을 취소하는 데 도움이되지 않는 경우 피펫을 변경합니다.
- 강한 단계 전류를 적용하거나 수동 트리거를 사용하여 용액을 피펫 밖으로 배출 될 수 있는지 확인하기 위해 형광 이미지의 끝을 모니터링 할 수 있습니다. 위에서 언급 한 바와 같이, 전류 펄스의 극성을 배출하도록되어 분자의 전하에 따라 있습니다. 글루 탐 산염을 추출하려면 그것은 음의 전류와 GABA 양의 전류 (그림 4)의 경우.입니다
- 염료와 송신기의 블록 배출이 높은 방출에게 현재 여러 번 적용하여 해제 할 수있는 피펫에 기포.
- 거기에 눈에 띄는 누설하지 및 테스트 배출이 성공하면 함께 촬영 커패시턴스를 보상하고 실험을 시작합니다.
- 주의 : 용량 보정이 피드백 회로에 의해 달성되기 때문에,이 회로는 오버 할 수 있고 또는 그것을 overcomp 경우 진동ensated. 부드럽게 커패시턴스 보상 다이얼 설정을 사용합니다.
- 필라멘트 속성을 변경했을 수 있기 때문에 풀러의 안정성에 따라서, 때때로 수시로 풀러 설정을 조정하는 것이 필요하다. 일단 좋은 피펫을 설계하는 경우 그러나, 그것은 몇 일 동안 사용할 수 있습니다. 따라서 끝난 후 실험 팁을 손상시키지 않고 밀폐 용기에 iontophoretic 피펫을 저장합니다.
- 다음 실험은 신경 전달 물질의 용액을 피펫을 채울 경우, 팁을 취소하고 다음 속성 (예 : 저항) 변화에 크게 확인하는 몇 가지 강력한 배출 펄스를 적용합니다. 그런 다음 용량을 보정하고 다시 피펫을 사용합니다. 다른 신경 전달 물질의 솔루션을 하나의 피펫을 사용하지 마십시오.
4. 뇌 조각을 준비한다
- 마이크로 이온 토 포레 시스를 처음 사용하는 경우 확실히 안정적으로 작동 풀러 프로그램을 수립 한 후 슬라이스를 준비합니다. <귀하의 기관 또는 지방 자치 단체의 동물 관리 지침에 따라 리> 수행 마취 잘린 프로 시저.
- 뇌의 제거 후, 차가운 얼음 ACSF 자당 (프로토콜 2.1 참조)로 전송할 수 있습니다.
- 적절한 두께의 조각 (예를 들어, 300 μM)로 관심의 영역을 잘라.
- 30 분 동안 35 ° C에서 ACSF 자당의 조각을 품어. 그 후, 실온에서 정상 ACSF을 포함 침수 보유 챔버로 전송.
- 준비와 실험을 통해 95 % O 2, 5 % CO 2 조각을 둘러싼 ACSF을 carbogenize.
5. 전체 세포 녹음 설정
- 전체 셀 모드를 설정 한 후, 오래 지속 위치를 피하기 위해, 패치 셀 전에 슬라이스 표면 근처 이미 이온 도입 피펫 (들)을 놓습니다.
- 낮은 저항 패치 피펫 (3 - 5 MΩ)를 당겨, D로 채 웁니다너희는 내부 솔루션을 포함하고 피펫에 긍정적 인 압력 (30-60 밀리바)를 적용합니다.
- 시각적 인지도를 아래에서 목욕 및 방법 세포 (적외선 dodt 대비 또는 두 개의 광자 그라데이션 대비 이미지)를 입력합니다.
- 전압 클램프 모드에서 테스트 펄스 (예 : -10 MV, 20 밀리 초)을 피펫 저항을 모니터링 할 수 있습니다. 조직 오프셋 잠재력을 수정 만질 때.
- 셀을 접근하고 부드럽게 명확하게 볼 수있다 "보조개"가 표시 될 때까지 그것으로 피펫 팁을 누릅니다. 60 mbar의 부정 압력을 -65 mV에서 막 잠재력을 전환 - 즉시 피펫의 압력을 해제, 40을 적용합니다.
- 유지 전류가 100 펜실바니아 아래 값에 도달하면, 부정적인 압력을 놓습니다.
- 기가 씰을 설정 한 후 (저항> 1 GΩ), 피펫 또는 커패시턴스 보상 회로의 간단한 overcompensation에 짧은, 강한 흡입과 파열 막.
- 어떤 모드에 따라 (전압 또는 전류 클램프)가 필요합니다실험 설계에 대해 적절하게 보상한다.
- 최종 위치로 iontophoretic 피펫을 가지고 시작합니다. 성공적으로 패치 클램프 녹음을 수행하는 방법에 대한 자세한 설명이 필요한 경우, 18,19 사용할 수있는 몇 가지 훌륭한 지침이 있습니다.
6. Iontophoretic 피펫을 놓고 시냅스 Iontophoretic 잠재적를 생성
- 일반적으로, iontophoretic 이벤트는 소마 또는 GABA 마이크로 이온 도입 축삭 초기 세그먼트 돌기 샤프트에서 글루타민산 마이크로 이온 도입 가시 돌기에서, 예를 들어, 원하는 실험에 따라 정의 된 위치에서 유발 될 수 있습니다.
- 터치하지 않고 약 1 ㎛ 거리에있는 셀을 접근. 그 위치에 도달하면 그것은 더 신경 전달 물질이 유출되지 않고 피펫 용량을 정확하게 보상하는 것을 중요합니다.
- 글루타민산 염과 셀을 접근하는 것은 iontophoretic pipett 가득 경우E는 세포막 전위의 검출 탈분극이 발생, 가능하면 현재 유지 조정하거나 피펫을 변경합니다.
- 짧은 음의 전류 펄스를 적용 0에서 시작하고 (예 : 0.1-0.4 밀리 초, 0.01-1 μA 펄스) 체계적으로 전류를 증가시킨다. 이 iontophoretic 전류가 특정 실험에서 원하는 응답을 셋업 연상하는 범위에서 찾을 수 있도록 도와줍니다.
- 응답 검출이없는 경우, 피펫 수백 마이크로 미터를 들고 팁을 청소하는 (> 0.1 μA) 강한 방출 전류를 적용한다. , 커패시턴스 보상을 조정 셀을 접근하고 다시 시도하십시오.
- 응답이 아직없는 경우, 현재의 유지를 줄일 수 있습니다. 이 절차를 통제 신경 전달 물질의 방출을 일으킬 수 있기 때문에 다이얼 설정을 매우주의해야합니다. 따라서 지속적으로 막 잠재력에 각각의 변화를 감지 녹음을 모니터링 할 수 있습니다.
- 이 GABA 성 이벤트를 감지하기 어려운 경우에 사용하는 것이 도움이 될 수 있습니다n 내부 용액 조성물은 높은 염소의 항복 - 원동력. 이를 위해 염소를 감소 - 피펫 솔루션 파일 (. 프로토콜 2.6 절 참조) 농도를. 이 높은 구동력으로 인해 휴식 막 잠재력에 큰 GABA 성 이벤트가 발생합니다.
- 또한, -100 MV에서 -48 MV (그림 88)에 막 잠재적 가능성의 결과로 긴 현재의 단계를 주입. 이 프로토콜과 염소가 - 원동력은 탈분극 GABA 반응을 일으키는 원인이 과분극 전위 증가합니다.
- 그것은 사건의 GABA 성 특성을 결정하는 데 도움이 유발 사건의 반전 가능성을 결정하는 단계 전류 주입 프로토콜을 사용하는 것도 가능하다. GABA의 누설 글루타민산 누설보다 감지하기 어렵습니다. 이 경우, 입력 저항의 지속적인 모니터링은 GABA 가득 피펫에 접근 할 때 도움이 될 수 있습니다. 입력 저항이 감소하면, 현재 할 수있는 B를 유지E는 증가하거나 다른 피펫을 사용하여야한다.
- 글루타민산 염 이온 도입에 대한 제어 실험, 우리는 글루타민산 누수로 인해 발생 될 수있는 지역의 칼슘 유입을 시각화하기 위해 피펫 용액에 200 μM OGB-1없이 EGTA를 사용하여, 칼슘 2 + 이미징 실험을 제안한다.
- 일반적으로, 안정된 반응을 달성하는 것은 시간이 지남에 드리프트를 방지하기 위해 기계적으로 안정 피펫을 가지고하는 것이 매우 중요하다. 드리프트 온도 변화로 인해 발생할 수 있습니다, 그 때문에 측정 온도 드리프트를 방지하기 전에 적어도 반 시간 장비에 전환하는 것이 좋습니다. 피펫 홀더에 좋은 카트리지 씰을 사용하고 끝이 정말 고정되어 있는지 확인합니다. 홀더 자체는 또한 테프론 테이프로 고정 할 수 있으며, 또한, 또한 드리프트의 잠재적 인 소스입니다 headstage 또는 조작자의 케이블에는 장력이 없는지 확인합니다.
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Representative Results
이온 도입의 공간 확산을 결정하는 간단한 방법은 배출 글루타민산 염을 일정하게 유지하면서, 수상 돌기에서 단계적으로 iontophoretic 피펫을 철회하는 것입니다. 우리는 마이크로 iontophoretic 자극의 공간적 범위는 약 12 μm의 (그림 1 반경을 보여주는)의 직경이 있었다는 것을 것을을 발견했습니다. 어떻게 이온 도입을 사용할 수 있습니다 조직에 깊은 것은 피펫의 강성에 따라 달라집니다. 그러나 여기에 사용되는 조각 (그림 2)에서 실험에 필요한 iontophoretic 피펫은 침투의 깊이를 제한하지 않습니다. 오히려 광학 시스템과 뇌 조각의 깊이 감소 해상도가 제한 요인이다. 좋은 품질의 녹음을 위해 더 송신기 피펫 밖으로 유출되지 않는 것이 중요합니다. 기준이 갑자기 될 경우 수상 돌기가 피펫 팁으로 접근 될 때 또는 갑자기 depolarisation가있는 경우 글루타메이트의 경우, 누출이 확인 될 수있다불안정 (그림 5). 안정적인 기록을 수립 한 후에는 수지상 나무 (그림 6)을 통해 어떤 위치에서이 기술을 정의 진폭, 돌기 스파이크 또는 행동 잠재력의 EPSPS를 연상 할 수 있습니다. 빠른 마이크로 이온 도입과 글루타민산을 적용하여, EPSPS의 특성, 그들의 전파 및 합계는 동시에 다른도 먼 위치에서, (그림 7) 조사 할 수 있습니다. 그리고 긍정적 꺼내기 현재 : GABA 성 이벤트는 고농도의 GABA 용액 (프로토콜 섹션 2 참조) iontophoretic 피펫을 작성하여 두 번째 피펫 글루 탐 산염 단독으로 또는 추가로 유발 될 수 있습니다. 이벤트의 GABA 성 특성을 확인하고 높은 구동력 내부 솔루션을 사용하지 않는 경우, 감지 GABA 성 이벤트를 쉽게하기 위해 간단한 프로토콜이있다 : 음의 전류 (약 1 초 주입, 진폭의 입력 저항에 따라 달라집니다 셀) hyperpolarising 할머니의 결과ltage 단계, -100 MV 주위에 시작하고 5 MV 단계 (그림 8)에서 증가한다. 매우 부정적인 가능성에 GABA 성 이벤트는 높은 추진력에 의해 감지하기가 쉽습니다. 신호가 계산 된 염소 주위에 반대한다면 - 솔루션에 대한 반전 가능성, 그들이 (그림 8) 자연 GABA가 있다는 것을 매우 가능성이 높습니다. 추가 GABA 마이크로 iontophoretic 피펫으로, 그것은, 돌기 스파이크와 IPSP의 상대적인 시간 (그림 9)을 변화시켜, 돌기 나트륨 / 칼슘 스파이크처럼, 글루타메이트 이벤트를, 예를 들어, GABA 성 억제 효과를 조사 할 수 있습니다 두 이벤트, 또는 진폭의 상대적 위치입니다. (모든 동물 실험은 동물 관리의 지침에 따라 실시하고 본 대학 신경 퇴행성 질환과 국가 노스 린 - 웨스트 팔리위한 독일 센터의위원회를 사용 하였다.)
그림 1. iontophoretically 배출 글루타민산의 공간적 범위는 피펫 후퇴에 의해 결정됩니다. 100 μM 알렉사 594와 초기 위치 (눈금 막대 8 μm의)의 iontophoretic 펫을 가득 CA1 피라미드 세포의 수상 돌기의 두 광자 이미지) 최대 강도 투영합니다. 인 세트는 iontophoretic 피펫의 철회 및 소마에서 기록 된 해당 iontophoretic EPSP을 보여줍니다. 화살표 iontophoretic 피펫 팁의 위치를 나타냅니다. EPSP 진폭 B) 거리 의존성 iontophoretic 피펫 팁의 초기 위치 (≤ 1 ㎛ 멀리 돌기, n은 = 6 지점에서)을 기준. 이것으로 우리는 체계적으로 후퇴 피펫에 의해 전파 글루타메이트의 반경을 추정 할 수 있습니다. 삽입 쇼 대표적인 예 추적합니다. 오차 막대 표시± SEM을 의미합니다. (뮐러 등에서 적응. 2012/05/09, 엘스 비어의 허가를 받아).
그림 2. 어떻게 iontophoretic 피펫과 같다. iontophoretic 피펫) 적외선 CCD 이미지는 60X 목표를 사용하여 스케일. B) Iontophoretic 피펫 60X 목표를 사용하여 작은 5.5 MΩ 패치 피펫에 비해. 교정 : 최소 = 10 μm의.
그림 3. 테스트 펄스 (10 nA의 10 밀리, NPI 전자, 탐에서 빌드를 사용하여 iontophoretic 피펫의 용량 보정독일). 오른쪽 피펫 저항을 모니터링하고 신속하고 정확한 신경 전달 물질의 응용 프로그램을 위해 제대로 커패시턴스를 보상하는 것이 중요합니다.
그림 4. 마이크로 이온 도입의 원칙. 전체 세포 패치 - 클램프 구성과 글루타민산 가득 iontophoretic 피펫의 CA1 피라미드 뉴런 A) 도식 그리기. 글루타민산 염은 부정적인 피펫에 적용되는 긍정적 인 전류가 피펫 밖으로 유출을 유지합니다 따라서 충전 : 현재는 긍정적이다 (왼쪽 패널) 유지합니다. 피펫 글루타민산를 추출하려면, 음의 전류를 적용 (오른쪽 패널). 이 방법 글루타민산 염은 피펫의 강제하고 시냅스 후 세포의 흥분성 이벤트를 보여주고 있습니다. C의 B) 개략도전체 세포 패치 - 클램프 구성과 GABA 가득 iontophoretic 피펫 A1 피라미드 신경 세포. GABA는 긍정적 낮은 pH에서 청구됩니다. 따라서 음의 전류가 피펫 (왼쪽 패널)에서 누출을 유지합니다. 꺼 GABA는 양 전류 (오른쪽 패널)을 적용합니다. 이 방법으로 GABA는 피펫 나오고 시냅스 세포의 억제 이벤트를 보여주고 있습니다.
그림 5. 좋고 나쁜 iontophoretic 피펫. CA1 피라미드 신경 세포의 돌기 분기에 발생 iontophoretic 글루타메이트 EPSP의) 대표 예. B) iontophoretic 돌기 스파이크의 대표 예는 피펫 팁의 지속적인 가벼운 글루타민산 염 누설 해마의 CA1 영역에서 수지상 분기를 생성.
그림 6. 단일 글루타민산 마이크로 이온 도입에 대한 대표적인 결과. 패치 CA1 피라미드 뉴런 A) 도식 그림과 iontophoretic 피펫은 글루타민산으로 가득합니다. B) EPSP 글루 탐 산염 이온 도입과 CA1 피라미드 신경 세포에서 유발. C)는 돌기 나 + / CA 2 + 스파이크 CA1 피라미드의 근위 수상 돌기에 되살려 신경이 낮은 트레이스 전압 트레이스의 기울기를 보여주고, 피크 돌기 스파이크의 최대 기울기를 나타냅니다. 그것은 활동 전위 임계 값을 교차 할 때까지 D) 증가 할 때 EPSP의 iontophoretic 진폭에 적용되는 전류가 증가합니다.
"FO : SRC ="/ "SRC ="/ files/ftp_upload/50701/50701fig7.jpg "/를 files/ftp_upload/50701/50701fig7highres.jpg>
그림 7. 수지상 나무의 다른 위치에서 두 글루타민산 마이크로 이온 도입에 대한 대표적인 결과. 각각 패치 CA1 피라미드 신경 세포의 두 iontophoretic 피펫 글루타민산 염으로 가득 근위부에 위치하며, 원위 수상 돌기의 A) 도식 드로잉, CA1 피라미드 신경 세포 (1)의 근위 수상 돌기를 유발. B) Iontophoretic EPSP. C) Iontophoretic EPSP는 말초 돌기 (2)에서 유발.
그림 8. GABA 마이크로 이온 도입에 대한 대표적인 결과. 패치 CA1 피라미드 신경 세포 및 GABA 가득 iontophoretic 피펫 A) 도식 그리기.B) Iontophoretic IPSP)는 CA1 피라미드 신경 세포. C의 근위 수상 돌기에 체계적 -400 펜실바니아에서 유발 사건의 반전 가능성 (현재 주입을 결정하기 위해 패치 피펫을 통해 CA1 피라미드 신경 세포에 진폭 변화의 긴 전류 주입을 유발 0 PA). 유물 GABA 이온 도입의 시간 점을 나타냅니다. 유발 이벤트는 약 -70 MV (화살표)의 반전 가능성을 나타냅니다.
그림 9. 동시 글루타민산 염 및 억제와 흥분의 통합을 조사하기 위해 GABA 이온 도입의 대표적인 결과. 글루타민산 (녹색)와 GABA (오렌지)와에 가득 패치 피라미드 신경 세포 하나의 피펫 A) 도식 그리기. B)는 Iontophoretically 유발혼자 돌기 스파이크, 이후 스윕에, 낮은 트레이스의 dV / dt에, 봉우리 돌기 스파이크를 나타냅니다 보여줍니다. C) Iontophoretically. D) 둘, 글루타메이트와 GABA 성 이벤트가 함께 혼자 IPSP을 유발.
| 위치 특이성 | 송신기 특이성 | 독성 / 부작용 | 시냅스 자극 | 장기 실험 | 비용 / 복잡성 | |
| 마이크로 이온 도입 | + + | + + + | + + | - | + + | + + |
| 2 광자 uncaging | + + + | + + + | + | - | + | + |
| 시냅스 자극 | - | - | + + + | + + + | + + + | + ++ |
표 1. . 다른 기술의 비교 장점과 기술의 단점은 다른 기준에 따라 신경을 자극하는 (- = 나쁜, + = 최적이 아닌, + + = 좋은, + + + = 최고).
| 패치 피펫 | Iontophoretic 피펫 | |||
| P (A) 단일 풀에게 사전이 - 끌어 | 마지막으로 끌어 P (B) | P (A) 단일 풀에게 사전이 - 끌어 | 마지막으로 끌어 P (B) | |
| 열 H | 700 | 480 | 510 | 600 |
| 힘 미리 당겨 F (TH) | 018 | 035 | 018 | 008 |
| 거리 임계 값 S (TH) | 017 | 012 | 025 | 015 |
| 지연 Heatstop T (H) | 050 | 030 | 050 | 030 |
| 거리 Heatstop S (H) | 030 | 000 | 030 | 000 |
| 지연 F (F1) | 000 | 136 | 000 | 050 |
| 1 F1을 당겨 강제로 | 000 | 065 | 200 | 400 |
| 거리 당겨 2 초 (F2) | 000 | 005 | 000 | 001 |
| 2 F2를 당겨 강제로 | 000 | 080 | 000 | 095 |
| 조정 (AD) | 121 | 000 | 121 | 000 |
표 2. 예시 끌어 당기는 프로토콜입니다. 수평 풀러 경우 (DMZ-패치 iontophoretic 피펫 모두 GB150F-8P 필라멘트 (과학 제품, 호프 하임, 독일)를 사용하여 범용 끌어 당기는 사람, 이츠 - 악기 GmbH를, Martinsried, 독일).
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Discussion
여기에 우리가 돌기에 시냅스 통합을 조사하는 신경 전달 물질의 빠른 마이크로 이온 토 포레 시스를 적용하는 방법에 대해 설명합니다. 이 기술은 성공적으로 체외에서 생체 9,20-22 다른 뇌 영역에서 글루타메이트와 GABA 성 시냅스 전달을 조사하는 데 사용되었습니다. 마이크로 이온 토 포레 시스는 60 년 이상에 사용되고 있습니다 만, 초기에 주로 로컬 느리거나 중간 척도 23 또는 셀 24에 물질의 microinjection을위한 신경 전달 물질과 약물을 적용하는 데 사용되었다.
마이크로 이온 토 포레 시스는 고 저항 전극 10,11위한 빠르고 용량 보상 장착되어 앰프의 도입 이후 돌기 통합을 공부에 특히 흥미있는 도구가되었다. 이 개선은 rese 시냅스 반응의 결과로 짧은 직사각형 iontophoretic 전류를 적용 가능하게되었다현실적으로 시냅스 이벤트 10,25의 시간 과정을 mbled.
마이크로 이온 도입을 설정할 때 기술적 요구 사항 및 처리하는 어려움은 무엇입니까? iontophoretic 앰프는 잘 iontophoretic 피펫의 높은 용량의 보상을 할 수있는 필요합니다. 고 저항 미세 전극과 함께 고속 작업이 필요한 경우 용량 보정의 올바른 튜닝은 매우 중요합니다. 보상되지 않은 부유 커패시턴스는 장비에 의해 제공됩니다 iontophoretic 현재의 충전, 따라서 응용 프로그램을 느리게하고 있습니다. 제대로 커패시턴스를 보상하는 것은 매우 중요하고 비디오에 자세히 설명되어 있습니다. 또한, 그것은 광학 시스템은 조직의 사진 손상을 유발하지 않고 돌기 및 iontophoretic 피펫의 좋은 형광 이미지를 제공하는 것이 중요합니다. 최적, 두 광자 시스템을 사용하여 레이저 출력을 절감하고 함께만큼 호환 체류 시간우수한 이미지 품질을 제공합니다. 더 많은 기존의 광원이 사용되는 경우, 기계 셔터를 사용하거나 전기를 트리거하여, 예를 들어, 최대한 노출 시간을 줄일 수 있는지 확인하십시오. 아마도 가장 중요한 점은 사용되는 신경 전달 물질의 정의와 특정 응용 프로그램을 허용 할 피펫 디자인입니다. 이 단계는 약간의 노력과 최적의 설정을 찾기 위해 시간을 요구한다. 여기, 우리는 다른 신경 전달 물질 차단제 또는 변조기를 사용하는 경우, 그것은 물질이 높은이 충전되어 있는지 더 중요한 집중되는 필요하다 글루타민산 염과 GABA 이온 도입을위한 프로토콜을 제시한다. GABA는 0의 pH에서 0의 전하를 가지고 있기 때문에 예를 들어, pH는 순 양전하의 결과 (프로토콜 섹션 2 참조) 조정할 수있다.
마이크로 이온 도입이 설정되면, 그것은 뉴런의 시냅스 통합을 연구하는 확장 된 도구 세트를 제공합니다. 그것은 선택적으로와 관심의 시냅스를 자극 할 수 있습니다특정 신경 전달 물질. 정의 위치, 시냅스 후 전류와 전위에 선택된 신경 전달 물질을 사용하여 자신의 전파를 조사 할 수 있습니다. 또한, 여러 글루타메이트 입력의 통합을 조사하거나 체계적으로 상대 시간이나 이벤트의 강도를 변경하는 동시에 여러 iontophoretic 전극을 사용할 수 있습니다.
일반적인 중요한 점은 마이크로 이온 토 포레 시스를 사용할 때 고려되어야한다. 마이크로 이온 도입 후 신경 전달 물질의 농도 프로파일은 내생 릴리스와 다릅니다. Murnick 등 10은 이온 도입 팁 (밀리 초 약 1)에서 방출 속도는 밀리 초 (0.2 밀리) 26의 분수에서 발생 소포에서 시냅스 버전보다 훨씬 느리게 될 가능성이 있다고 보도했다. 또한,하고 시냅스의 확산 가능성이 농도 상승과 iontophoretically 적용되는 신경 전달 물질의 붕괴를 느리게합니다.또한, 배출 된 신경 전달 물질의 양이 고 저항 전극, 하나의 글루타메이트와 GABA 성 postsynapses으로, 그러나, 생리 학적으로 출시 된 볼륨보다 높게 될 가능성은 마이크로 이온 토 포레 시스 10-12를 사용하여 활성화 할 수 있습니다. 몇 마이크로 미터 범위의 공간 선택성는 최근 신경 전달 물질 3,4,27의 2 광자 uncaging에 의해 달성되었다.
훨씬 더 많은 비용이 많이 있지만, 두 광자 uncaging 마이크로 이온 토 포레 시스에 비해 여러 가지 장점이 있습니다. 특히 그것은 여러 시냅스 사이트에서 동시에 신경 전달 물질을 방출하는 데 사용할 수 있으며 미세 전극 팁의 정확한 위치를 필요로하지 않습니다. 그러나, 그것은 또한 특정 실험 방법을 선택할 때 고려해야 할 몇 가지 중요한 단점이 있습니다. 많은 갇힌 화합물은 신경 전달 물질 수용체 (28)의 봉쇄 등의 부작용이있다. 예를 들어, 많은 글루타민산 염과 GABA 케이지GABA 성 억제에 방해가보고되었습니다. 또한, 두 광자 uncaging에 필요한 상대적으로 높은 레이저 전원 자극이 몇 분 이상 반복적으로 가해 특히, 시냅스 후 뉴런의 사진이 손상 될 수 있습니다. 마이크로 이온 토 포레 시스를 자극 사이트의 수에 제한이있는 동안 또한,이 사이트는 서로 다른 뇌 영역에서 계층 시냅스 입력을 시뮬레이션하기 위해, 원위부 기저 돌기에 예를 들어, 신경 세포의 전체 돌기 나무에 자유롭게 선택할 수 있습니다. 두 광자 uncaging, 그것은 현재 대부분의 그룹에 의해 사용되는, 특정 초점 비행기와 (일반적으로 40X 또는 60X 물 침지)를 사용 목적에 따라보기의 분야에서 시냅스 사이트로 제한됩니다. 이 두 가지 기술은 항상 결과의 해석을 어렵게 만들 수 있습니다 extrasynaptic 수용체의 활성화로 이어질 것으로 생각해야합니다.
마이크로 이온 도입의 또 다른 단점은 O 형NLY는 postsynapse을 활성화 할 수 있습니다. 시냅스 기능과 소포 발표 신경 전달 물질의 역할은 실험 초점을 설정해야 할 경우, 해당 지역의 전기 시냅스 자극의 선택의 방법이 될 수 있습니다. 그러나 전기 시냅스 자극의 단점은 마이크로 이온 도입으로 비교하는 것은 잠재적으로 다른 신경 전달 물질 시스템 (표 1)에 속하는 활성화 된 시냅스의 알 수없는 위치와 다른 신경 세포 인구에서 축삭의 공동 활성화합니다.
요약 마이크로 이온 도입의 가장 중요한 장점은 여러 가지 신경 전달 물질을 사용하는 등 돌기 9와 같은 신경 구획에서의 상호 작용을 연구하는 것이 가능하다는 것을, 우리의보기이다.
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Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 신중하게 원고를 읽는 한스 라이너 간척지, 마틴 마차부 워커 잭슨 감사합니다. , neurodegenerative 질병의 우수성 센터 (COEN, 저자는 국가 노스 린 - 웨스트 팔리 (SR), 전산 신경 과학 BMBF-Projekträger DLR 미국 - 독일어 협업 (SR CRCNS)의 연구 MIWF의 사역에 의해 제공되었다 자금을 받았다; SR) 및 본 교내 자금 지원 프로그램의 대학 (BONFOR, SR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin) | LaVision Biotec, Bielefeld, Germany | ||
| Two-photon laser scanning microscope Ultima IV | Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA | ||
| Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laser | Chameleon Ultra II, Coherent | ||
| 60X Objective, NA 0.9 | Olympus | ||
| Zeiss Axioskop 2 FS upright microscope | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Monochromator | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Micro-iontophoresis system MVCS-02 | NPI Electronics, Tamm, Germany | ||
| Sutter puller P-97 | Sutter Instrument Company, Novato, CA | ||
| Glass filaments (150 GB F 8P) | Science Products, Hofheim, Germany | ||
| Reagent | |||
| Alexa Fluor 488 hydrazide | Molecular Probes life technologies | A-10436 | |
| Alexa Fluor 594 | Molecular Probes life technologies | A-10438 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6297 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C5080 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M2670 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| K-Gluconate | Sigma Aldrich | G4500 | |
| HEPES-acid | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Phosphocreatin | Sigma Aldrich | P7936 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Glutamic acid | Sigma Aldrich | G8415 | |
| GABA | Sigma Aldrich | A5835 | |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | |
| HCl | Merck | 1.09108.1000 |
References
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