Summary
I den här artikeln presenterar vi snabbt mikro-iontophoresis av signalsubstanser som en teknik för att undersöka integreringen av postsynaptiska signaler med hög rumslig och tidsmässig precision.
Abstract
En av de grundläggande intressena inom neurovetenskap är att förstå integrationen av retande och hämmande insatsvaror längs mycket komplex struktur av dendritiska träd, som så småningom leder till neuronal produktionen av aktionspotentialer på axonet. Inverkan av olika rumsliga och tidsmässiga parametrar specifik synaptisk input på neuronal produktionen är för närvarande under utredning, t.ex. avståndsberoende dämpning av dendritiska ingångar, plats-beroende växelverkan av rumsligt segregerade ingångar, påverkan av GABAergig hämning på excitatoriska integration, linjär och icke-linjära integration lägen, och många fler.
Med snabb mikro-iontophoresis av glutamat och GABA är det möjligt att exakt undersöka rumsliga och tidsmässiga integration av glutamaterg excitation och GABAergic hämning. Kritiska tekniska krav är antingen en utlöst lysrör, lysdioder (LED), eller en två-photon scanning mikroskop för att visualisera dendritiska grenar utan att införa betydande foto-skador på vävnaden. Vidare är det mycket viktigt att ha en mikro-jontofores förstärkare som möjliggör snabb kapacitans ersättning av hög resistans pipetter. En annan viktig punkt är att ingen sändare ofrivilligt frigörs genom pipetten under experimentet.
När etablerade, kommer denna teknik att ge tillförlitliga och reproducerbara signaler med en hög signalsubstans och plats specificitet. Jämfört med glutamat och GABA uncaging, möjliggör snabb iontophoresis använda båda sändarna samtidigt men på mycket avlägsna platser utan begränsning till synfältet. Det finns också fördelar jämfört med fokal elektrisk stimulering av axoner: med mikro-jontofores placeringen av den ingående webbplats är definitivt känd och det är säker på att endast signalsubstansen av intresse släpps. Men det måste beaktas att med mikro-iontophoresis endastpostsynapsen aktiveras och presynaptiska aspekter av neurotransmittorfrisättning är inte löst. I den här artikeln visar vi hur du ställer in micro-jontofores i experiment hjärnan skiva.
Introduction
Nervceller i det centrala nervsystemet får en mängd synaptiska ingångar på sina tunna och förgrenat dendritiska processer 1. Där är majoriteten av de excitatoriska dendritiska ingångar förmedlas av glutamaterg synapser. Dessa synapser kan aktiveras i ett rumsligt fördelad sätt, vilket resulterar i postsynaptiska linjär integration av excitatoriska postsynaptiska potentialer (EPSPs). Om synapser aktiveras samtidigt och rumslig närhet på dendriten, kan dessa excitatoriska ingångar integreras supra-linjärt och generera dendritiska spikar 2-5.
Beror dessutom integrering av excitatoriska ingångar på platsen för ingången på den dendritiska trädet. Signaler som anländer till den bortre tuft regionen är betydligt mer dämpad än proximala ingångar beroende på kabel filtrering 6. I hippocampus, är avlägsna ingångarna till de apikala tuft dendriter genereras av en annan hjärna region än de på proximal dendrites 7. En spännande fråga är därför, hur synaptisk input bearbetas av olika dendritiska fack och om dendritiska integration reglerar inflytandet av dessa skiktade ingångar på neuronaktivitet på olika sätt.
Inte bara de funktionella egenskaperna, morfologiska egenskaper hos dendriten, är på plats och klustring av ingångarna påverkar dendritiska integrering av excitatoriska ingångar, även ytterligare hämmande ingångar från GABAergic terminaler avgörande bestämma effektiviteten av de glutamaterga synapser 8,9. Dessa olika aspekter av synaptisk integration kan idealt undersökas med hjälp av signalsubstansen mikro-iontophoresis, vilket gör rumsligt definierad tillämpning av olika signalsubstanser till dendritiska domäner. Vi visar här hur man framgångsrikt kan etablera mikro-iontophoresis av glutamat och GABA att utreda signal integration i nervceller.
För denna applikation, spetsighög resistans pipetter fyllda med koncentrerade signalsubstans lösningar används. Dessa pipetter är placerade nära den yttre membranet av cellen, där neurotransmittorreceptorer är belägna. En god visualisering av de dendritiska grenarna krävs. Detta uppnås bäst med hjälp av fluorescerande färgämnen, och som införs via plåstret pipetten. Sedan en mycket kort (<1 ms) aktuell puls (i intervallet på 10 - 100 NA) används för att mata de laddade signalsubstansen molekyler. Med dessa korta pulser och effektiv kapacitans ersättning, kan postsynaptiska potentialer och strömmar kan framkallas med hög temporal och rumslig precision, vilket innebär att platsen för den excitatoriska input exakt känd. Glutamat mikro-jontofores kan aktivera synapser i en definierad radie, som är mindre än 6 um som visas här (figur 1 9), men det är också möjligt att nå enda synaps upplösning 10-12.
Heine, M., et al 13. Med snabb mikro-iontophoresis är det lätt möjligt att använda två eller flera jonoforesiska pipetter och placera dem på olika, även avlägsna fläckar på dendritiska träd. På detta sätt kan integrera excitatoriska händelser, inklusive de från olika banor, undersökas. Det är också möjligt att använda en glutamat och GABA fylld jonoforesisk pipett samtidigt. På detta sätt kan effekten av GABA-avgivande hämning vid olika positioner i förhållande till den excitatoriska ingång (på-bana, off-path hämning) kan studeras. Dessutom, effekterna av hämning av interneuronen inriktade på specifika neuronala domäner som distala dendriter, soma eller axoner 14, kan undersökas med hjälp av GABA jontofores. I odlade nervceller, erbjuder snabb mikro-iontophoresis möjlighet att investigate enda synaps distribution och de elementära aspekterna av synaptisk kommunikation i nervceller i mycket mer detalj 10,11.
I den här artikeln visar vi i detalj hur man kan upprätta glutamat och GABA jontoforesen för användning i akut hjärnan skivor, vilket gör utreder synaptisk integration av retande och hämmande insatsvaror i beroende av input läge, styrkor ingång, och timing, ensam eller i samspel. Vi kommer att påpeka fördelarna och begränsningarna med denna teknik och hur man felsöker framgångsrikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Systemkrav
- Mikroskopsystem: Bra visualisering av dendriten är avgörande. Om tillgängligt, använd en två-photon lasersystem scanning mikroskop. I våra experiment använde vi en TRIM Scope II LaVision Biotec, Bielefeld, Tyskland eller en Ultima IV-system, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin utrustad med en Ti: Sapphire ultrafast-pulsad laser (Chameleon Ultra II, Coherent) och en hög NA objektiv (60X, 0,9 NA, Olympus) att visualisera dendriter som vi hade fyllt med ett fluorescerande färgämne via plåstret pipetten. Även foto-skador tros vara mindre allvarlig med 2-photon scanning, minskar laserns effekt (under 8 mW vid vävnaden) och uppehållstid (mindre än 1 ps) eller så mycket som möjligt.
- En andra möjlighet är att utlösa ett brett fält fluorescens ljuskälla (LED eller lysrör) synkront med förvärv för att minska exponeringstiden så mycket som möjligt. Vi har använt en monokromator med en integrerad ljuskälla (TILLPhotonika, Gräfelfing, Tyskland), på en Zeiss Axioskop 2 FS upprätt mikroskop som var utrustad med Dodt-kontrast infraröd belysning (TILLPhotonics, Gräfelfing, Tyskland). I våra experiment exponeringstider varierade från vanligtvis 10 ms till max. 30 msek.
- Använd en snabb mikro-jontofores förstärkare, t.ex. en två-kanals mikro-jontoforetiskt system MVCS-C-02 (NPI elektroniska, Tamm, Tyskland) med snabb kapacitans ersättning. De spetsig jontofores mikroelektroder har resistanser 25-100 Mohm (ytterst beroende på spetsen storlek och pipett form), och snabba stigtider kan endast uppnås om kapacitans ersättning av den jontoforetiska förstärkaren är optimalt inställd. Denna snabba ersättning är nödvändigt att tillämpa strömpulser med en kort och snabbt insättande i sub-millisekund intervall till den jontoforetiska pipett och därigenom mata ut sändaren med hög rumslig upplösning i spot storlekar under 1 | im 13. Iontophoresis förstärkare är alså tillgängliga från flera andra företag, vilket vi inte har testat i vårt laboratorium. Dessa enheter är att vår kunskap inte är utrustad med kapacitans kompensation kretsar.
2. Förbered Lösningar
- Förbered konstgjorda cerebrospinalvätska (ACSF) och intern lösning när det krävs för den experimentella designen. Det enda tillägget till den interna lösningen, som krävs, är en röd eller grön fluorescerande färgämne (t ex 50 till 200 | iM Alexa Fluor 488 eller 594 hydrazid, Invitrogen), beroende på den optiska utrustningen. Här är ett exempel för ACSF sackaros, som kan användas för dissekering, i mM: 60 NaCl, 100 sackaros, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 1 CaCl2, 5 MgCl2, 20 glukos, och för normal ACSF lösning för patch-clamp experiment i mM: 125 NaCl, 3 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 2,6 CaCl 2, 1,3 MgCl2, 15 glukos.
- Carbogenize (95% O 2, 5% CO 2) alla extracellulära lösningar hela tiden.
- Bered intern lösning, till exempel, i mM: 140 K-glukonat, 7 KCl, 5 HEPES-syra, 0,5 MgCl2, 5 Phosphocreatine, 0,16 EGTA, med 50 - 200 pM Alexa 488.
- För glutamat mikro-jontofores framställa en lösning med 150 mM glutaminsyra och justera pH till 7,0 med NaOH. Lägg 50 -200 iM Alexa Fluor 488 eller 594 hydrazid (Invitrogen) för visualisering.
- För jontofores av GABA bereda en 1 M GABA lösning och justera pH till 5 med HCl 15. Vid detta pH GABA är laddat, först då den kan appliceras med hjälp av jontofores. Observera att det låga pH-värdet i lösningen ut till det extracellulära utrymmet kan påverka GABA överföring själva 16,17.
Skydda GABA lösningen från ljus och ofta förbereda färsk GABA stamlösning, eftersom äldre lösning kan förlora sin verkan. - Om det är svårt att se GABAerga händelser, en high Cl - drivkraft intern lösning, till exempel genom att lämna ut KCl, kan hjälpa till att visualisera de GABAergic händelserna för att se om GABA iontophoresis fungerar, men att undersöka synaptisk integration en fysiologisk drivkraft kan rekommenderas. För allmän detektering av små GABAergiska händelser, kan ett protokoll som visas i figur 8C hjälp.
Tre. Dra och testa jontoforesen Pipetter
- I allmänhet, dra rätt pipetter är kanske det mest kritiska steget för att uppnå kontrollerad signalsubstans iontophoresis. Vid användning av jontofores i cellkultur, är det möjligt att dra mycket fina elektroder liknar vassa mikroelektroder 10. I patch-clamp experiment i akut skivor, men dessa är mycket tunna pipetter böja på skiva ytan när de sänks ner i vävnaden med en vinkel, vilket gör det omöjligt att nå djupare dendriter.
- Därför dra en pipett med en mycket liten spets, så att ingen neurotransmitter kan läcka ut, men spetsen måste vara fortfarande tillräckligt styv för att penetrera in i vävnaden (figur 2). Till exempel, använd 150 GB F 8P klass pipetter (Science Products, Hofheim, Tyskland) och en horisontell avdragare (t.ex. en DMZ-Universal Avdragare, Zeitz-Instruments GmbH, Martinsried, Tyskland, eller en P-97 Avdragare, Sutter Instrument Company , Novato, CA) med flera dragande steg för att nå en liten öppning, men också en kort gängtappen med en brant vinkel (figur 2 och tabell 2).
- Det är också möjligt att använda kvarts glaspipetter att dra jonoforesiska pipetter 10. Dessa är tänkta att ha bättre mekaniska egenskaper och att vara mer tillförlitlig, men speciella laser avdragare krävs. Men det är också möjligt att uppnå goda resultat med normala glaspipetter, som vanligtvis används för att dra patch pipetter.
- Testa pipett prestanda och motstånd i en kammare utan vävnad, innan du använder dem för förstatid, kunde sedan läckage av glutamat skadar vävnaden.
- Ställ in jontoforesen förstärkaren korrekt. Sedan fylla pipetten med signalsubstansen och färgämne innehållande lösningen och placera den i badet (ACSF).
- Kompensera kapacitansen (Figur 3). Vanligtvis mycket skarpa pipetter kommer att ha en högre kapacitans än trubbiga sådana.
- Kontrollera resistansen i pipetten: Mikro-iontophoresis förstärkare används här har en inbyggd funktion för mätning av pipetten motståndet. Det väcker korta rektangulära testpulserna, som kan övervakas med ett standard oscilloskop eller en A / D-kortet ansluts till en dator med förvärvet mjukvara. Beroende på formen och spetsen storlek, bör spetsen ha en resistans mellan 25-90 Mohm.
- Fokus på spetsen med ett 60X eller 40X nedsänkning i vatten mål och byta till fluorescerande avbildning och om möjligt, in i. Om fluorescerande färgämne läcker ut ur pipettspetsen, applicera en liten positiv (i fallet med gluTamate) eller negativ (i fallet av GABA, figur 4) bibehåller ström (<0,02 pA). Om det inte hjälper att avbryta läckage, ändra pipett.
- Applicera en stark steg ström eller använda manuella avtryckaren och övervaka spetsen i den fluorescerande bilden för att se om lösningen kan matas ut ur pipetten. Såsom nämnts ovan, är polariteten hos strömpulsen beroende på laddningen av molekylen som är tänkt för att matas ut. Att mata glutamat det är en negativ ström och för GABA en positiv ström (Figur 4).
- Luftbubblor i pipetten som blockerar utstötning av färgämne och sändare, kan clearas av att tillämpa en hög utstötning löpande flera gånger.
- Taget tillsammans, om det inte finns något synligt läckage och testa utstötning lyckades kompensera kapacitans och starta experimentet.
- Varning: Eftersom kapacitans kompensation åstadkommes genom en återkopplingskrets, denna krets kan överskott eller oscillera om det är overcompensated. Försiktigt använda ratten inställningen för kapacitans ersättning.
- Beroende på avdragare stabiliteten är det ibland nödvändigt att justera de puller inställningar från tid till annan, eftersom glödtråden kan ha ändrats egenskaper. Men om en gång en god pipett är utformad, kan den användas i flera dagar. Därför, efter att ha avslutat experimentet lagra den jontoforetiska pipetten i en sluten behållare utan att skada dricks.
- För nästa experiment fylla pipetten med signalsubstansen lösning, tillämpa flera starka eject pulser att rensa spetsen och sedan kontrollera om de egenskaper (t.ex. resistens) förändras avsevärt. Sedan kompensera kapacitansen och använd pipetten igen. Använd inte en enda pipett med olika signalsubstans lösningar.
4. Förbered hjärnan skivor
- Om mikro-jontofores används för första gången definitivt förbereda skivorna efter att ha etablerat ett tillförlitligt arbetar avdragare programmet. <li> Utför anestesi och halshuggning förfaranden i enlighet med djurskötsel riktlinjer för din institution eller lokal myndighet.
- Efter avlägsnandet av hjärnan, överför den till iskallt ACSF sackaros (se protokoll 2.1).
- Skär regionen av intresse i skivor med lämplig tjocklek (t ex 300 ^ m).
- Inkubera skivor i ACSF sackaros vid 35 ° C under 30 min. Därefter, överföra dem till en nedsänkt anläggning kammare innehållande normal ACSF vid rumstemperatur.
- Under beredningen och experimentera carbogenize ACSF omger skivor med 95% O2, 5% CO2.
Fem. Upprätta en hel-cell inspelning
- Placera jontofores pipett (s) redan nära slice ytan innan patchning en cell, för att undvika långvarig placering, efter inrättandet av hela cellen läge.
- Dra en låg resistans fläckpipetten (3 - 5 MQ), fyll den med dye innehållande intern lösning och applicera positivt tryck till pipetten (30 - 60 mbar).
- Ange badet och förhållningssätt cellen under visuell vägledning (infraröd Dodt kontrast eller två photon gradient kontrast bild).
- Övervaka pipetten motståndet med ett test puls (t.ex. -10 mV, 20 ms) i spänningsklämma läget. När vidröra vävnaden korrigera offset potential.
- Närma cellen och tryck försiktigt pipettspetsen in det tills en "grop" kan ses tydligt. Omedelbart släppa trycket på pipetten, tillämpas 40 - 60 För mbar undertryck och byta membranet potential till -65 mV.
- När hållströmmen når värden under 100 Pa, släpp det negativa trycket.
- Efter upprättande av en giga tätning (resistans> 1 GΩ), spräcka membranet med en kort, stark sug till pipett eller korta överkompensation av kapacitans kompensationskretsen.
- Beroende på vilket läge (spänning eller strömtång) krävsför experimentell design, lämplig ersättning.
- Börja med att föra jonoforesiska pipetten i sitt slutliga läge. Om en mer detaljerad beskrivning av hur man framgångsrikt utföra inspelningar patch clamp behövs, det finns flera utmärkta riktlinjer tillgängliga 18,19.
6. Placera Jontoforetisk pipett och generera en Postsynaptisk lontophoretic Potential
- I allmänhet kan jontoforetiska evenemang att evoked en viss bestämd position beroende på den önskade experimentet, till exempel vid en taggig dendrit för glutamat mikro-jontofores, vid den dendritiska axeln, soma eller axon initial segment för GABA mikro-jontofores.
- Närma cellen upp till cirka 1 um avstånd utan att röra den. Efter att ha nått positionen av intresse är det viktigt att någon signalsubstans läcker ut och att pipetten kapacitans kompenseras korrekt.
- Om närmar sig cellen med en glutamat fyllt jonoforesisk pipette orsakar påvisbar depolarisation av membranet potential, justera behålla strömmen om möjligt, eller ändra pipett.
- Ansök korta negativa strömpulser, med början från noll och öka den nuvarande systematiskt (t.ex. 0,1 till 0,4 msek, 0,01-1 iA pulser). Detta hjälper till att ta reda på i vilket område den jontoforetiska strömmen väcker de önskade svaren i specifika experimentella set-up.
- Om det inte finns något svar detekteras, lyfta pipetten flera hundra mikrometer och tillämpa en stark eject ström (> 0,1 iA) för att rengöra spetsen. Justera kapacitans ersättning, närmar cellen, och försök igen.
- Om det fortfarande inget svar, minska behålla strömmen. Var mycket försiktig med ratten inställningar eftersom detta förfarande kan orsaka okontrollerad neurotransmittorfrisättning. Därför, ständigt övervaka inspelningen att upptäcka respektive förändringar i membranpotential.
- Om det är svårt att detektera GABAergic händelser, kan det vara bra att använda enn intern lösning sammansättning ger en hög Cl - drivkraft. För att uppnå detta, reducera Cl - koncentrationen i pipetten lösning (se protokoll avsnitt 2.6.). Detta kommer att resultera i större GABAergic händelser på vila membranpotential på grund av en högre drivkraft.
- Alternativt, injicera långa aktuella stegen resulterar i membran potentiella chanser från -100 mV till -48 mV (figur 8C). Med detta protokoll Cl - är drivkraft ökas vid hyperpolarized potentialer orsakar en depolariserande GABA svar.
- Det är också möjligt att använda steget nuvarande injektionsprotokollet att bestämma återföring potential framkallade händelser, som hjälper till att bestämma GABA naturen av händelserna. Läckage av GABA är svårare att upptäcka än läckage av glutamat. I detta fall kan en konstant övervakning av ingångsmotståndet hjälpa, när GABA fyllda pipetten närmade. Om ingången motståndet minskar, den behåller strömmen kan be ökas eller en annan pipett bör användas.
- Som kontrollexperiment för glutamat jontofores, föreslår vi en Ca 2 + avbildning experiment, med användning av 200 pM OGB-1 och ingen EGTA i pipetten lösningen att visualisera lokal kalciuminflöde som kan orsakas av läckande glutamat.
- I allmänhet, för att uppnå en stabil reaktion är det mycket viktigt att ha en mekaniskt stabil pipett för att undvika avdrift med tiden. Drift kan orsakas av temperaturförändringar, därför rekommenderas att slå på utrustningen minst en halvtimme före mätningarna för att undvika termisk drift. Var noga med att använda bra patrontätningar i pipetten hållaren och spetsen är verkligen fast. Hållaren i sig kan dessutom fixeras med Teflon tejp, och dessutom vara säker på att det inte finns någon spänning på kablarna från headstage eller manipulator, vilket också är en potentiell källa till drift.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En enkel metod för att fastställa den rumsliga utbredningen av jontofores är att dra tillbaka den jontoforetiska pipetten stegvis från dendriten, och samtidigt hålla den utskjutna glutamat konstant. Vi fann att den geografiska omfattningen av en mikro-jonoforesisk stimulering hade en diameter på ca 12 nm (Figur 1 visar radie). Hur djupt i vävnaden jontoforesen kan användas beror på styvheten av pipetten. De jontoforetiska pipetter som behövs för experiment i skivor (figur 2), som används här, är inte begränsande inträngningsdjupet. Snarare det optiska systemet och den minskande upplösningen i djupet av hjärnan skiva är den begränsande faktorn. För en god kvalitet inspelning är det viktigt att någon sändare läcker ut ur pipetten. I fallet med glutamat, kan ett läckage kan identifieras om det finns en plötslig depolarisation när dendriten närmar med pipettspetsen eller om baslinjen plötsligt blirinstabil (Figur 5). Efter upprättandet av en stabil inspelning, är det möjligt att framkalla EPSPs av definierade amplituder, dendritiska spikar eller potentialer åtgärder med denna teknik på någon plats i hela dendritiska träd (Figur 6). Genom att tillämpa glutamat med snabb mikro-iontophoresis, samtidigt egenskaper EPSPs, deras utbredning och summering, vid olika även avlägsna platser, kan undersökas (Figur 7). GABAergic händelser kan framkallas ensamma eller tillsammans till glutamat med en andra pipett genom att fylla den jontoforetiska pipetten med en mycket koncentrerad GABA-lösning (se: protokoll avsnitt 2) och en positiv eject ström. Det är ett enkelt protokoll för att bekräfta GABA naturen av händelserna och att göra GABAerga händelser lättare att upptäcka, om du inte använder en hög drivkraft intern lösning: Injicera negativa strömmar (ca 1 sek, amplituden beror på bidrag motstånd cell) som resulterar i hyperpolarising voltage steg, med början vid omkring -100 mV och sedan öka under 5 mV steg (Figur 8). Vid mycket negativa potentialer de GABAergic händelser är lättare att upptäcka, på grund av den högre drivkraft. Och om signalerna vända runt den beräknade Cl - återföring potential för de lösningar, är det mycket troligt att de är GABAergic i naturen (Figur 8). Med en extra GABA mikro-jonoforesisk pipett, är det möjligt att utreda, till exempel effekten av GABA-avgivande hämning på glutamaterg händelser, som dendritiska natrium / kalcium spikar, med en varierande relativa timingen av dendritiska spik och IPSP (figur 9), den relativa placeringen av de båda händelserna, eller deras amplituder. (Alla djurförsök har utförts i enlighet med riktlinjerna i Animal Care och användning kommittén vid universitetet i Bonn, den tyska Centrum för neurodegenerativa sjukdomar och staten Nordrhein-Westfalen.)
Figur 1. Rumslig omfattning jontoforetiskt utkastade glutamat bestäms av pipett dementi. A) Maximal intensitet projektion av en två-photon bild av en CA1 pyramidal cell dendrite fylld med 100 iM Alexa 594 och jontoforetiska pipett i utgångsläget (skala bar 8 pm). Inläggningar visar indragning av jontoforetiska pipett och motsvarande jontoforetiska EPSP registreras vid soma. Pil indikerar positionen för den jontoforetiska pipettspetsen. B) Avstånd beroendet hos EPSP amplituder förhållande till den ursprungliga positionen för den jontoforetiska pipettspetsen (≤ 1 ^ m bort från Dendrite, n = 6 filialer). Med detta kunde vi uppskatta radien på glutamat sprids genom att systematiskt tillbakadragning av pipetten. Infällda bilden visar representativa exempel skrivs. Felstaplar representerarmedelvärde ± SEM. (Anpassad från Müller et al. 2012 9, återges med tillstånd från Elsevier).
Figur 2. Hur en jontoforetisk pipett bör se ut. A) Infraröd CCD-bild av en jontoforetisk pipett jämföras med en liten 5,5 Mohm fläckpipetten med användning av en 60X objektiv. B) lontophoretic pipett med skala med användning av en 60X objektiv. Kalibrering: minsta = 10 mikrometer.
Figur 3. Kapacitans ersättning av jontoforetiska pipett med build i test-puls (10 nA, 10 ms, NPI elektroniskt, Tamm,Tyskland). Det är viktigt att kompensera kapacitansen korrekt att övervaka höger pipett motstånd och för att säkerställa snabb och korrekt neurotransmittor ansökan.
Figur 4. Principer för mikro-jontofores. A) Schematisk bild av en CA1 pyramidala neuron i hela cell patch-clamp konfiguration och en jontoforetisk pipett fylld med glutamat. Glutamat är negativt laddat, varför en positiv ström som appliceras på pipetten kommer att hålla den från att läcka ut ur pipetten: Den behåller strömmen är positiv (vänstra panelen). För att mata ut glutamat från pipetten, tillämpa en negativ ström (högra panelen). På detta sätt glutamat tvingas ut ur pipetten och kan framkalla excitatoriska händelser i den postsynaptiska cellen. B) Schematisk ritning av CA1 pyramidal neuron i hela cell patch-clamp konfiguration och en jontoforetisk pipett fylld med GABA. GABA är positivt laddad vid ett lågt pH. Därför kommer en negativ ström hålla den från att läcka ut ur pipetten (vänstra panelen). Att mata GABA tillämpa en positiv ström (högra panelen). På detta sätt GABA kommer ut ur pipetten och kan framkalla inhibitoriska händelser i den postsynaptiska cellen.
Figur 5. Goda och dåliga jontoforetiska pipetter. A) Ett representativt exempel på en jontoforetisk glutamaterg EPSP genereras på ett dendritiska gren av en CA1 pyramidal neuron. B) Ett representativt exempel på en jontoforetisk dendritiska spik genererat en dendritiska filial i CA1 område av hippocampus med pågående mild glutamat läckage från pipettspetsen.
Figur 6. Representativa resultat för enstaka glutamat mikro-jontofores. A) Schematisk bild av en lappad CA1 pyramidal neuron och en jontoforetisk pipett fylld med glutamat. B) EPSP framkallade i en CA1 pyramidal neuron med glutamat jontofores.) C Dendritiska Na + / Ca2 + spik framkallat på en proximal dendrit av en CA1 pyramidal neuron, visar lägre spår lutningen av spänning spår, indikerar topp toppen sluttningen av den dendritiska spetsen. D) Vid ökning av ström som tillförs den jontoforetiska amplituden hos EPSP att öka tills den korsar aktionspotentialen tröskeln.
"Fo: src =" / files/ftp_upload/50701/50701fig7highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50701/50701fig7.jpg "/>
Figur 7. Representativa resultat för dubbel glutamat mikro-jontofores på olika platser på dendritiska träd. A) Schematisk bild av en korrigerad CA1 pyramidala neuron och två jontoforetiska pipetter fylldes med glutamat, som är placerade på en proximal och en distal dendrit, respektive. B) lontophoretic EPSP framkallat på en proximal dendrit av en CA1 pyramidala neuron (1). C) Jontoforetisk EPSP framkallat vid en distal dendrit (2).
Figur 8. Representativa resultat GABA mikro-jontofores. A) Schematisk bild av en lappad CA1 pyramidal neuron och en jontoforetisk pipett fylld med GABA.B) Jontoforetisk IPSP framkallat på en proximal dendrit av en CA1 pyramidal neuron. C) Lång ströminjektion av systematiskt ändra amplituder till en CA1 pyramidal neuron via plåstret pipetten, att bestämma återföring potential framkallade händelsen (nuvarande injektioner från -400 pA till 0 Pa). Artifact indikerar tidpunkt, av GABA jontofores. Den framkallade händelsen indikerar en återföring potential på ca -70 mV (pil).
Figur 9. Representativa resultat av samtidig glutamat och GABA iontophoresis att undersöka integreringen av hämning och excitation. A) Schematisk bild av en lappad pyramidal neuron och en pipett fylld med glutamat (grön) och på med GABA (orange). B) frammanade jontoforetisktdendritiska spikar ensam, i efterföljande svep, lägre spår visar dV / dt, toppar indikerar dendritiska spikar. C) jontoforetiskt framkallat IPSP ensam. D) Både glutamaterga och GABAerga händelser tillsammans.
| Plats specificitet | Sändare specificitet | Toxicitet / biverkningar | Presynaptiska stimulering | Långsiktig experiment | Kostnader / komplexitet | |
| Micro-iontophoresis | + + | + + + | + + | - | + + | + + |
| 2-photon uncaging | + + + | + + + | + | - | + | + |
| Synaptic stimulering | - | - | + + + | + + + | + + + | + ++ |
Tabell 1. . Jämförelse av olika tekniker Fördelar och nackdelar med tekniker för att stimulera nervceller enligt olika kriterier (- = dåligt, + = inte optimalt, + + = bra, + + + = bäst).
| Patch pipetter | Jontoforetiska pipetter | |||
| Pre-drar P (A) enda drag | Senaste Pull P (B) | Pre-drar P (A) Single Pull | Senaste Pull P (B) | |
| Heat H | 700 | 480 | 510 | 600 |
| Force Pre Pull F (TH) | 018 | 035 | 018 | 008 |
| Avstånd Tröskel s (TH) | 017 | 012 | 025 | 015 |
| Fördröjning VÄRMESTOPP t (H) | 050 | 030 | 050 | 030 |
| Avstånd VÄRMESTOPP s (H) | 030 | 000 | 030 | 000 |
| Fördröjning F (F1) | 000 | 136 | 000 | 050 |
| Force Pull en F1 | 000 | 065 | 200 | 400 |
| Avstånd Pull 2 s (F2) | 000 | 005 | 000 | 001 |
| Force Pull 2 F2 | 000 | 080 | 000 | 095 |
| Justera (AD) | 121 | 000 | 121 | 000 |
Tabell 2. Exemplariskt avdragare protokollet. För en horisontell avdragare (DMZ-Universal Avdragare, Zeitz-Instruments GmbH, Martinsried, Tyskland), med GB150F-8P filament (Science Products, Hofheim, Tyskland) för både patch och jontoforetiska pipetter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här förklarar vi hur man ansöker snabb mikro-iontophoresis av signalsubstanser att undersöka synaptisk integration på dendriter. Denna teknik har framgångsrikt använts för att undersöka glutamaterg och GABAergic synaptisk transmission i olika områden i hjärnan in vitro och in vivo 9,20-22. Micro-jontofores har använts i mer än 60 år, men under de första åren var det mest för att antingen lokalt tillämpa signalsubstanser och droger vid långsamma eller mellanliggande tidsramar 23 eller mikroinjektion av ämnen in i cellerna 24.
Micro-iontophoresis blev ett särskilt intressant verktyg för att studera dendritiska integration sedan införandet av förstärkare, som är utrustade med en snabb kapacitans kompensation för hög resistans elektroderna 10,11. Med denna förbättring det blev möjligt att tillämpa korta rektangulära jontoforetiska strömmar resulterar i postsynaptiska svar, som Resembled mer realistiskt tidsförloppet av synaptiska händelser 10,25.
Vilka tekniska krav och svårigheter att hantera, när upprättandet mikro-iontophoresis? En jontoforetisk förstärkare behövs som möjliggör kompensation av hög kapacitans av de fina jontoforetiska pipetter. Den korrekta tonart av kapaciteten ersättningen är mycket viktigt om hög hastighet i kombination med hög resistans mikroelektroder krävs. Okompenserade strökapacitanser debiteras från jontoforetiska strömmen som levereras av instrumentet, och därför saktar ansökan. Kompensera kapacitans ordentligt är avgörande och förklaras i detalj i videon. Dessutom, är det kritiskt att det optiska systemet ger en bra fluorescerande bild av dendrit och den jontoforetiska pipetten utan att inducera bild-skada av vävnaden. Optimalt använder en två-foton-systemet och minska lasereffekt och uppehållstider så mycket som är förenligt meden anständig bildkvalitet. Om en mer konventionell ljuskälla används, se till att minska exponeringstiden så mycket som möjligt, till exempel genom användning av mekaniska fönsterluckor eller elektrisk utlösningsanordning. Förmodligen den mest kritiska punkten är pipetten design, vilket kommer att möjliggöra en definierad och specifik tillämpning av den använda signalsubstansen. Detta steg kräver viss ansträngning och tid att hitta de optimala inställningarna. Här presenterar vi protokoll för glutamat och GABA jontofores, om andra signalsubstanser, blockerare eller modulatorer används, är det nödvändigt att ämnet är mycket koncentrerad och ännu viktigare att det har laddats. Till exempel, eftersom GABA har en nettoladdning på noll vid ett pH på 0, har pH-värdet justeras (se protokoll avsnitt 2), vilket resulterar i en netto positiv laddning.
När mikro-jontofores är etablerad, kommer det att ge en utökad uppsättning verktyg för att studera synaptisk integration i nervceller. Det låter stimulerande synapser av intresse selektivt meden särskild signalsubstans. Använda en vald signalsubstans på definierade platser, postsynaptiska strömmar och möjligheter och deras utbredning kan undersökas. Vidare är det möjligt att använda flera jontoforetiska elektroder samtidigt undersöker integrering av flera glutamaterga ingångar eller systematiskt ändra den relativa timingen eller styrkan av händelser.
Några generella kritiska punkter måste beaktas när man använder micro-jontofores. Profilen för signalsubstansen koncentration efter mikro-iontophoresis skiljer sig från endogen frisättning. Murnick och andra 10 rapporterade att hastigheten för övergång från jontofores spets (ca 1 ms) kommer sannolikt att vara betydligt långsammare än synaptisk frisättning från vesiklar, vilket sker på bråkdelar av en millisekund (0,2 msek) 26. Dessutom är diffusion till och från den synaptiska spalten saktar sannolikt koncentration uppgång och sönderfallet av jontoforetiskt tillämpade neurotransmittorer.Dessutom är volymen av utkastade signalsubstans sannolikt högre än fysiologiskt släppt volymer, dock med hög resistans elektroder, singel glutamaterga och GABAerga postsynapses kan aktiveras med hjälp av mikro-iontophoresis 10-12. En rumslig selektivitet i intervallet några få mikrometer har också nyligen uppnåtts genom två-photon uncaging av neurotransmittorer 3,4,27.
Medan betydligt mer kostnadseffektivt intensivt, har två-photon uncaging flera fördelar jämfört med mikro-jontofores. I synnerhet kan användas för att frisätta signalsubstans samtidigt vid multipla synaptiska ställen och inte kräver exakt positionering av ett fint elektrodspetsen. Men det har också några viktiga nackdelar som måste beaktas när man väljer en metod för ett visst experiment. Många bur föreningar har oönskade biverkningar såsom blockaden av neurotransmittorreceptorer 28. Till exempel har många glutamat och GABA burarhar rapporterats att störa GABAergic hämning. Dessutom kan den relativt höga lasereffekt som krävs för två-foton-uncaging resultera i foto-skador av den postsynaptiska neuronen, särskilt när stimuleringen appliceras upprepade gånger under flera minuter. Dessutom, medan mikro-jontofores är begränsad i antalet stimulerade platser, kan dessa platser väljas fritt på hela dendritiska träd av en neuron, exempelvis på distala och basala dendriter, för att simulera skiktade synaptisk input från olika områden i hjärnan. Två-foton uncaging, eftersom det för närvarande används av de flesta grupperna, kommer att begränsas till synaptiska platser i en viss fokalplan och i synfältet, vilket beror på syftet används (typiskt 40X eller 60X vatten nedsänkning). Det måste anses att båda teknikerna alltid leder till aktivering av extrasynaptic receptorer, vilket kan göra att tolkningen av resultaten svårare.
En annan nackdel med mikro-iontophoresis är att ondast den postsynapsen kan aktiveras. Om presynaptiska funktion och roll vesikler släppt-signalsubstans måste sättas in i den experimentella inriktningen, kan lokal elektrisk synaptiska stimuleringen vara en metod som föredras. Men nackdelarna med elektrisk synaptisk stimulering jämfört med mikro-jontofores är okänd plats av de aktiverade synapser och co-aktivering av axoner från olika neuronala populationer, eventuellt tillhör andra neurotransmittorsystemen (tabell 1).
Sammanfattningsvis är den viktigaste fördelen med mikro-jontofores är, enligt vår uppfattning, att det är möjligt att använda flera olika signalsubstanser och studera deras samspel på neuronala fack som dendriter 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Hans Reiner Polder, Martin Fuhrmann och Walker Jackson för att noggrant läsa manuskriptet. Författarna erhöll finansiering som tillhandahålls av ministeriet för forskning MIWF av staten Nordrhein-Westfalen (SR), den BMBF-Projekträger DLR US-tyskt samarbete i teoretisk neurovetenskap (CRCNS, SR), Centers of Excellence i neurodegenerativa sjukdomar (COEN; SR), och universitetet i Bonn intramural finansieringsprogram (BONFOR, SR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin) | LaVision Biotec, Bielefeld, Germany | ||
| Two-photon laser scanning microscope Ultima IV | Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA | ||
| Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laser | Chameleon Ultra II, Coherent | ||
| 60X Objective, NA 0.9 | Olympus | ||
| Zeiss Axioskop 2 FS upright microscope | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Monochromator | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Micro-iontophoresis system MVCS-02 | NPI Electronics, Tamm, Germany | ||
| Sutter puller P-97 | Sutter Instrument Company, Novato, CA | ||
| Glass filaments (150 GB F 8P) | Science Products, Hofheim, Germany | ||
| Reagent | |||
| Alexa Fluor 488 hydrazide | Molecular Probes life technologies | A-10436 | |
| Alexa Fluor 594 | Molecular Probes life technologies | A-10438 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6297 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C5080 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M2670 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| K-Gluconate | Sigma Aldrich | G4500 | |
| HEPES-acid | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Phosphocreatin | Sigma Aldrich | P7936 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Glutamic acid | Sigma Aldrich | G8415 | |
| GABA | Sigma Aldrich | A5835 | |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | |
| HCl | Merck | 1.09108.1000 |
References
- Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neuroscience. 102, 527-540 (2001).
- Gasparini, S., Migliore, M., Magee, J. C. On the initiation and propagation of dendritic spikes in CA1 pyramidal neurons. J. Neurosci. 24, 11046-11056 (2004).
- Losonczy, A., Magee, J. C. Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuron. 50, 291-307 (2006).
- Remy, S., Csicsvari, J., Beck, H. Activity-dependent control of neuronal output by local and global dendritic spike attenuation. Neuron. 61, 906-916 (2009).
- Stuart, G., Schiller, J., Sakmann, B. Action potential initiation and propagation in rat neocortical pyramidal neurons. J. Physiol. 505 (Pt. 3), 617-632 (1997).
- Magee, J. C. Dendritic integration of excitatory synaptic input. Nat. Rev. Neurosci. 1, 181-190 (2000).
- Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31, 571-591 (1989).
- Miles, R., Toth, K., Gulyas, A. I., Hajos, N., Freund, T. F. Differences between somatic and dendritic inhibition in the hippocampus. Neuron. 16, 815-823 (1996).
- Muller, C., Beck, H., Coulter, D., Remy, S. Inhibitory control of linear and supralinear dendritic excitation in CA1 pyramidal neurons. Neuron. 75, 851-864 (2012).
- Murnick, J. G., Dube, G., Krupa, B., Liu, G. High-resolution iontophoresis for single-synapse stimulation. J. Neurosci. Methods. 116, 65-75 (2002).
- Liu, G., Choi, S., Tsien, R. W. Variability of neurotransmitter concentration and nonsaturation of postsynaptic AMPA receptors at synapses in hippocampal cultures and slices. Neuron. 22, 395-409 (1999).
- Renger, J. J., Egles, C., Liu, G. A developmental switch in neurotransmitter flux enhances synaptic efficacy by affecting AMPA receptor activation. Neuron. 29, (2001).
- Heine, M., et al. Surface mobility of postsynaptic AMPARs tunes synaptic transmission. Science. 320, 201-205 (2008).
- Somogyi, P., Klausberger, T. Defined types of cortical interneurone structure space and spike timing in the hippocampus. J. Physiol. 562, 9-26 (2005).
- Pugh, J. R., Jahr, C. E. Axonal GABAA receptors increase cerebellar granule cell excitability and synaptic activity. J. Neurosci. 31, 565-574 (2011).
- Mozrzymas, J. W., Zarnowska, E. D., Pytel, M., Mercik, K. Modulation of GABA(A) receptors by hydrogen ions reveals synaptic GABA transient and a crucial role of the desensitization process. J. Neurosci. 23, 7981-7992 (2003).
- Pasternack, M., Smirnov, S., Kaila, K. Proton modulation of functionally distinct GABAA receptors in acutely isolated pyramidal neurons of rat hippocampus. Neuropharmacology. 35, 1279-1288 (1996).
- Single-Channel Recording. , Springer. (2009).
- Davie, J. T., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nat. Protoc. 1, 1235-1247 (2006).
- Major, G., Polsky, A., Denk, W., Schiller, J., Tank, D. W. Spatiotemporally graded NMDA spike/plateau potentials in basal dendrites of neocortical pyramidal neurons. J. Neurophysiol. 99, 2584-2601 (2008).
- Rose, G. J. Combining pharmacology and whole-cell patch recording from CNS neurons, in vivo. J. Neurosci Methods. , (2012).
- Behrends, J. C., Lambert, J. C., Jensen, K. Repetitive activation of postsynaptic GABA(A )receptors by rapid, focal agonist application onto intact rat striatal neurones in vitro. Pflugers Arch. 443, 707-712 (2002).
- Hahnel, C. Practical Electrophysiological methods. Kettenmann, H., Grantyn, R. , Wiley-Liss. (1992).
- Wetzel, C. H., et al. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. J. Neurosci. 19, 7426-7433 (1999).
- Cash, S., Yuste, R. Linear summation of excitatory inputs by CA1 pyramidal neurons. Neuron. 22, 383-394 (1999).
- Eccles, J. C., Jaeger, J. C. The relationship between the mode of operation and the dimensions of the junctional regions at synapses and motor end-organs. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 148, 38-56 (1958).
- Kwon, H. B., Sabatini, B. L. Glutamate induces de novo growth of functional spines in developing cortex. Nature. 474, 100-104 (2011).
- Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Front Neural Circuits. 3, 2 (2009).
