Summary
Processen als proliferatie, patroon, differentiatie en axon begeleiding kan gemakkelijk worden gemodelleerd in de zebravis ruggenmerg. In dit artikel beschrijven we een montageprocedure voor zebravis embryo's die visualisatie van deze gebeurtenissen optimaliseert.
Abstract
De zebravis ruggenmerg is een effectieve onderzoeksjournalistiek model voor zenuwstelsel onderzoek om verschillende redenen. Ten eerste kan de genetische, transgene en gen knock-down benaderingen worden gebruikt om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan ontwikkeling van het zenuwstelsel te onderzoeken. Ten tweede, grote klauwen van ontwikkelingsgebied gesynchroniseerde embryo's bieden grote experimentele steekproeven. Ten derde, de optische helderheid van de zebravis embryo laat onderzoekers voorlopercellen, gliale en neuronale populaties te visualiseren. Hoewel de zebravis embryo's zijn transparant, kan monsterdikte effectieve microscopische visualisatie belemmeren. Een reden hiervoor is de tandem ontwikkeling van het ruggenmerg en overliggende somiet weefsel. Een andere reden is de grote dooier bal, die nog steeds aanwezig tijdens periodes van vroege neurogenese. In dit artikel tonen we aan microdissection en het verwijderen van de dooier in vaste embryo's, die microscopische visualisatie mogelijk maakt met behoud van omliggende somiet weefsel. We ALSo tonen semi-permanente montage van zebravis embryo's. Dit maakt observatie van neurodevelopment in de dorso-ventrale en anterior-posterior assen, en vrijwaart het drie-dimensionaliteit van het weefsel.
Introduction
Visualisatie van het ruggenmerg in zebravis wordt geremd door een aantal factoren. Door de dikte van de bovenliggende somieten en interne locatie van het ruggenmerg, wordt een aanzienlijk lange werkafstand vereist voor hoge cellulaire resolutie. De dooier bal (die nog steeds aanwezig is tijdens de vroege stadia van neurogenese) verhoogt verder de werkafstand nodig, en kan gemakkelijk beschadigd raken door de druk van een dekglaasje. Daarnaast puin van beschadigde dooier verbiedt duidelijke visualisatie van weefsels. Hoewel dwarsdoorsneden in de dorso-ventrale (DV)-as zijn mogelijk, ze niet gemakkelijk toestaan gelijktijdige visualisatie in de anterior-posterior (AP) as 1.
Om deze hindernissen te overwinnen, worden embryo's ontleed en gemonteerd op dia's. Deze procedure biedt een aantal voordelen. Eerste, zebravis embryo gemakkelijk liggen met de zijkant naar boven, die AP as visualisatie vergemakkelijkt. Ten tweede, het verwijderen van de dooier ball vermindert de vereiste werkafstand, en beperkt puin. Ten derde, deze montage procedure kan zowel voor TL-en helderveld microscopie. Vierde gemonteerde embryo stabiel maanden bij 4 ° C, waardoor langdurige specimen visualisatie. Tenslotte, de progressie van de ontwikkeling vindt plaats in die voorste segmenten zijn volwassener dan achterste segmenten. Om ervoor te zorgen dat afgestemd spinale hemisegments geënsceneerd worden vergeleken tussen embryo's, wordt bovenliggende somiet weefsel als leidraad gebruikt. Bijvoorbeeld, de tiende meest achterste somite ligt over de tiende spinale hemisegment, wat ontwikkelingsgebied gelijkwaardig stadium embryo afgestemd. Deze montage procedure van intacte embryo maakt een eenvoudige identificatie van de somieten.
We maken gebruik van genetica en gen knock-down technologieën om de mechanismen van axon begeleiding studeren in de ontwikkeling van het ruggenmerg. In het bijzonder, hebben wij vastgesteld dat robo2, robo3 en DCC zijn vereist voor commissurale Primaire AsceNding (COPA) axon pathfinding. Met behulp van de montage-procedure hier beschreven, konden we ventrale groei, middellijn kruising, commissuur breedte-, rug-en anterieure groei 2,3 onderzoeken. Deze montageprocedure kan ook worden toegepast op DV of AP patroonvorming van het ruggenmerg. Wij hebben deze procedure gebruikt om uiteenlopende rollen van stroomafwaartse effectoren Wnt DV patroonvorming van het ruggenmerg bepalen. Met behulp van deze bevestiging, waren we in staat om de resolutie van DV markers te verkrijgen bij de enkele cel niveau, en bepalen minuut patronen verschuivingen als gevolg van veranderde Wnt signaalontvangst 4,5. Deze montage-procedure maakt het ook voor de mitotische index berekening door middel van anti-phosphohistone 3 of BrdU etikettering (voorlopercellen proliferatie) differentiatie 5.
Protocol
1. Montage Embryo's (na voltooiing van Selected Visualisatie Techniek, zoals Immunocytochemie, in situ hybridisatie, enz.)
- Plaats embryo's in een schotel 35 mm Petri gevuld met buffer keuze (figuur 1A). De keuze van buffer is gebaseerd op de labelingsprocedure. Typisch PBS-gebaseerde buffers geschikt.
- Onder een microscoop ontleden, en met behulp van een tang, zet de kop met een pincet en trek de dooier weg met het andere paar (Figuur 1B). U kunt ook een insect pin in een insect penhouder om zachtjes weg te trekken van de dooier.
- Met behulp van de embryo poker (vislijn (0,41 mm diameter) gelijmd om ofwel een capillaire buis of een Pasteur pipet) bewegen de embryo's om een deel van de petrischaal die niet beschikt over veel dooier puin (Figuren 1C-D).
- Met behulp van een glas Pasteur pipet, zuig het embryo in zo weinig mogelijk vocht, en gze ently pipet op een dia (figuur 1E).
- Zachtjes lont overtollige vloeistof met behulp van een laboratorium doekje. Vermijd contact met embryo's.
- Voeg een druppel montage medium om embryo's. Voor fluorescente labels, gebruik een antifade reagens keuze. Voor colorimetrische signalen kan 70% glycerol gebruikt als een fixeermiddel.
- Met behulp van de embryo poker, oriënteren de embryo's op hun kant in rijen (Figuur 1F).
- Voeg een "schar" vaseline of hoog vacuüm vet aan elke hoek van een dekglaasje (figuur 1G). Dit voorkomt beschadiging van het embryo van overmatige compressie.
- Plaats dekglaasje (vaseline naar beneden) bovenop embryo (Figuur 1H).
- Tik op de dekglaasje op elke hoek zachtjes tot de montage media (70% glycerol of anti-fade montage reagens) raakt het dekglaasje (Figuur 1H).
- , Voeg meer montage media door pipetteren direct naast de cov indien nodigerslip behulp van een pipet in het traject van 20-200 ml. Het zal onder lont.
- Met behulp van een laboratorium te vegen, helemaal schoon rond het dekglaasje. Wees zeker niet druk op het dekglaasje, omdat deze embryo beschadigen. Dit gebied moet droog zijn en geen vaseline of montage media op.
- Gebruik nagellak voor afdichting rond de rand van het dekglaasje (Figuur 1I).
Representative Results
Wanneer ophelderen van de mechanismen die ten grondslag liggen diverse ontwikkelingsprocessen zoals cellulaire patroon, differentiatie en axon begeleiding is belangrijk om cellen te visualiseren in de context van hun weefsels. Dorsoventral patroonvorming gebreken meestal aanwezig als een ventrale of dorsale verschuiving in de expressie domein van transcriptiefactoren in de pax, NKX of dbx gezinnen 4. Soms kunnen veranderingen subtiel zijn, omvattende enkele cel diameters 4. Dwarsdoorsnede analyse mogelijk dit type analyse. Echter, reagentia zwakkere signalen of dwarsdoorsneden die niet loodrecht op de as staan AP interpretatie beperkt. Verder heeft dwarsdoorsnede analyse niet direct rekening gehouden met de vraag of veranderingen volharden in het AP-as, en is gebaseerd op de beschikbaarheid van een cryostaat. Deze beperking wordt omzeild door een zijdelings uitzicht op het ruggenmerg. Zoals te zien in figuur 2B, Nkx6.1 mRNA distributed in ruwweg de ventrale helft van het ruggenmerg bij 24 uur na de bevruchting (HPF), binnen de stamvader domein. Progenitorcellen worden onderscheiden ontslag mitotische cellen door de aanwezigheid van de vloerplaat, die is gevonden in het mediale deel van het ruggenmerg. Bekeken met DIC optiek, individuele cellen zijn duidelijk te onderscheiden, en een gedefinieerde grens tussen het uiten en niet tot expressie brengende cellen is evident.
Progenitor celcyclus uitgang is gekenmerkt door veranderingen in genexpressie. Bijvoorbeeld, alle post-mitotische neuronen uiten HuC / D die detecteerbaar is met immunocytochemie 1,5. mRNA probes voor eilandje, gata, en VSX families label specifieke post-mitotische neuronen van consistente positie en het aantal binnen elk ruggenmerg hemisegment 6. Daarnaast worden axon begeleiding receptoren zoals in de Robo familie uitgedrukt in beperkte populaties van postmitotische neuronen (figuur 2C)
Op 24 HPF, kunnen axonen van de volgende postmitotische neuronen worden gevisualiseerd met verschillende methoden, en zijn te onderscheiden op de enkele cel niveau: Dorsale Lateral oplopend (Dola), commissural Primaire Oplopend (COPA), commissural Secundaire Oplopend (COSA), Ventral Longitudinale Aflopend (veld), Kolmer-Agdur (KA), commissural bifurcating / Longitudinale (COB / L), Circumferential Oplopend (CIA), Circumferential Aflopend (CID), en unipolaire commissural Aflopend (UCoD), Rohon-Beard (RB), motoneuronen ( M) 9. Axonen strekken zich uit van deze neuronen in de dorsale, ventrale, anterieure en posterieure richtingen. Ze tak, steek de middellijn, en sluit zowel de dorsaleen ventrale ruggenmerg. In combinatie met confocale laser scanning microscopie, die verschillende cellulaire gedragingen zijn duidelijk zijdelings gemonteerde embryo, met immunocytochemie en genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten zoals GFP 2. In figuur 2D, is ZNP-1 immunocytochemie gebruikt voor het ontwikkelen motoneuronen label. Motoneuronen verlaten het ruggenmerg ventraal naar de omliggende ontwikkelen van spiermassa innerveren.
Figuur 1. Dissection en lateraal monteren van zebravis embryo. (A) na verwerking voor immunofluorescentie, in situ hybridisatie, enz., worden embryo's in een schotel 35 mm Petri gevuld met PBT (PBS met 0,5% Triton X-100) of PTW (PBS met geplaatste 0,1% Tween-20). De dooierbal (YB) is evident. (B) De dooier verwijderd geplaatst door de kop van het embryo, gevolgd door zorgvuldige dissectie. (C) Een embryo poker (vislijn verlijmd op een Pasteur pipet) wordt gebruikt om afzonderlijke embryo's en dooier puin (D). Gereinigde embryo gepipetteerd op een objectglaasje (E) en lijn (F). (G) Vaseline wordt toegepast op de hoeken van het dekglaasje. (H) Het dekglaasje wordt voorzichtig bovenop de embryo's fixeermiddel. (I) Nagellak wordt gebruikt om de randen van het dekglaasje te dichten. Klik hier voor grotere afbeelding .
< strong> Figuur 2. Analyse van genexpressie patronen en axon pathfinding zijdelings gemonteerd zebravis embryo's. (A) Tekening van een zebravis embryo op 24 hpf. BD, zijn ruwweg vier hemisegments boven de dooierzak uitbreiding gevisualiseerd (boxed gebied). (B) Nkx6.1 wordt uitgedrukt in de ventrale ruggenmerg, inclusief de bodemplaat (FP). (C) robo3 wordt uitgedrukt in postmitotische neuronen (PMN). De vloerplaat en voorlopercellen zone is niet duidelijk in deze meer zijdelingse focal plane. In B, C, het ruggenmerg wordt begrensd door een beugel aan de linkerkant van het beeld. (D) confocale microscopie werd gebruikt om beelden ZNP-1 immunofluorescentie, welke motor axonen ventraal verlaten van het ruggenmerg labels. In alle afbeeldingen, anterior naar links en dorsale up. Een 40X lange werkafstand, werd onderdompeling in water (NA 0,8) gebruikte lens (3.3 mm).oad/50703/50703fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor grotere afbeelding.
Discussion
Laterale montage van vaste zebravis embryo steun visualisatie van ruggenmerg ontwikkeling. Door het verwijderen van de dooier bal, is de werkafstand nodig is voor uitzonderlijke microscopische beeldvorming gereduceerd. De representatieve resultaten zijn beperkt tot de 24 HPF stadium echter kan deze techniek al 18 HPF worden gebruikt, maar eerder embryo zijn moeilijker te ontleden vanwege de grootte van de embryo en de kwetsbaarheid van het weefsel. Deze techniek is ook toepasbaar op embryo's ouder dan 24 HPF. Geholpen door de optische helderheid van de embryonale zebravis, de mogelijkheid om voorwaartse genetische screens uitvoeren reverse genetica en transgene benaderingen kunnen diverse ontwikkelingsprocessen onderzocht. Dit omvat mitotische indexen van neuronale voorlopercellen met markers zoals BrdU en anti-fosfo-histon 04-06 maart en patroonvorming door expressie van neuronale en gliale voorlopercellen markers in de pax, NKX, dbx, en olig families 1,4-6. Reagentia die gliale en neuronale bepaling (zoals gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP) en HuC / D) bericht 1,4,5,10 worden gebruikt. Neuronale subtype differentiatie kan worden geanalyseerd door middel van expressie van eilandje, VSX, engrailed en gata genen 1,4-6. Tenslotte analyse van axon begeleiding mogelijk door antilichamen zoals anti-geacetyleerd tubuline, 3A10 en ZNP-1 2,11,12. Hoewel andere vertebrate modelsystemen (muis en kuiken) worden gebruikt ruggenmerg ontwikkeling bestuderen, alleen de zebravis toelaat gelijktijdig bekijken van alle ontwikkelings assen in het intacte embryo.
De duidelijke beperking van deze benadering is dat de embryo's worden vastgesteld met live imaging uitsluit. In feite, verwijderen (of beschadiging) van de dooier resulteert in een snelle embryonale sterfte, dus is het niet mogelijk de werkafstand in levende embryo's met deze techniek te verminderen. Echter, een hoge vergrotingsfactor spinale cord beeldvorming in levende embryo's is mogelijk. Om de dooier in levende beeldvorming sparen, embryo depressie dia, die een grotere ruimte tussen het monster en het dekglaasje voorzien worden geplaatst. Als alternatief kan een aantal 22 mm x 22 mm dekglaasjes worden gelijmd aan elke dia van een 3 in 1 x in microscopisch preparaat. De dekglaasjes dienen als een "brug" voor de bovenliggende dekglaasje. Als embryo's ouder dan 18 HPF, wordt tricaïne gebruikt om embryo's te verdoven om verplaatsing te voorkomen. Terwijl een werkafstand van 0,288 mm is vereist voor deyolked embryo's in 24 HPF, bij het werken met levende embryo's ingebed in agarose, met intacte dooiers, een microscopische lens met een werkafstand van 3,3 mm is voldoende. Alternatief kan explantkweken ontleend deyolked embryo worden gevisualiseerd met behulp van een plasma stolsel immobilisatietechniek 13. Verschillende populaties van cellen kan worden waargenomen door het gebruik van genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten zoals GFP, mCherry of de photoconconverteerbare kleurstof Kaede (om een paar te noemen). Verder kan fluorescent gelabelde cellen in chimère embryo ook gezien met deze benadering 14.
Een consistente montage techniek die is stabiel gedurende maanden is een essentieel instrument voor de ontwikkelingsbiologie en celbiologen. Deze eenvoudige techniek is reproduceerbaar, zodat u gemakkelijk de vergelijking tussen verschillende experimentele studies. Bovendien is de uitlijning van embryo's in rijen gemakkelijk maakt dat specifieke embryo voor latere analyse.
Disclosures
Geen concurrerende financiële belangen bestaan voor zowel auteur.
Acknowledgments
Skidmore Faculty Development Grant financierde de voorbereiding en publicatie van dit manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
Petri dishes 35 mm x 10 mm |
VWR | 25373-041 |
|
| Dumont Forceps #3 |
Fisher Scientific | NC9839169 |
|
| Cover glass |
Fisher Scientific | 12-541-B22X22-1.5 |
|
| Slides |
Fisher Scientific | 12-550-343 |
|
| SlowFade Gold |
Fisher Scientific | S36936 |
|
| ProLong Gold |
Life Technologies | P36934 |
|
| Petroleum Jelly |
any grocery store |
|
|
| Loop Holders |
VWR | 80094-482 |
|
| Insect Pins |
Fine Science Tools | 26002-10 |
|
| Nickel Plated Pin Holders |
Fine Science Tools | 26016-12
|
|
Olympus Stereomicroscope |
Olympus | SZ61 |
References
- Gribble, S. L., Nikolaus, O. B., Dorsky, R. I. Regulation and function of Dbx genes in the zebrafish spinal. Dev. Dyn. 236 (12), 3472-3483 (2007).
- Bonner, J., et al. Midline crossing is not required for subsequent pathfinding decisions in commissural neurons. Neural Dev. 7 (1), 18 (2012).
- Ross, A. B. J. Activation of Wnt signaling using Lithium Chloride: Inquiry-Based Undergraduate Laboratory Exercises. Zebrafish. , In Press. (2012).
- Bonner, J., et al. Proliferation and patterning are mediated independently in the dorsal spinal cord downstream of canonical Wnt signaling. Dev. Biol. 313 (1), 398-407 (2008).
- Gribble, S. L., et al. Tcf3 inhibits spinal cord neurogenesis by regulating sox4a expression. Development. 136 (5), 781-789 (2009).
- England, S., et al. Roles of Hedgehog pathway components and retinoic acid signalling in specifying zebrafish ventral spinal cord neurons. Development. 138 (23), 5121-5134 (2011).
- Challa, A. K., Beattie, C. E., Seeger, M. A. Identification and characterization of roundabout orthologs in zebrafish. Mech Dev. (1-2), 101-101 (2001).
- Lee, J. S., Ray, R., Chien, C. B. Cloning and expression of three zebrafish roundabout homologs suggest roles in axon guidance and cell. 221 (2), 216-230 (2001).
- Downes, G. B., Waterbury, J. A., Granato, M. Rapid in vivo labeling of identified zebrafish neurons. Genesis. 34 (3), 196-202 (2002).
- Kim, H., et al. Notch-regulated oligodendrocyte specification from radial glia in the spinal cord of zebrafish embryos. Dev. Dyn. 237 (8), 2081-2089 (2008).
- Sylvain, N. J., Brewster, D. L., Ali, D. W. Zebrafish embryos exposed to alcohol undergo abnormal development of motor neurons and muscle fibers. Neurotoxicol. Teratol. 32 (4), 472-480 (2010).
- de Soysa, T. Y., et al. Macondo crude oil from the Deepwater Horizon oil spill disrupts specific developmental processes during zebrafish embryogenesis. BMC Biol. 10 (40), (2012).
- Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants. Dev Dyn. 228 (3), 464-474 (2003).
- Deschene, E. R., Barresi, M. J. Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation. J. Vis. Exp. (31), (2009).
