הנובע את מהלך הזמן של חיסול גלוטמט עם ניתוח Deconvolution של זרמי Transporter astrocytic

Summary

אנו מתארים שיטה אנליטית להעריך את החיים של גלוטמט בממברנות astrocytic מהקלטות אלקטרו של זרמי טרנספורטר גלוטמט בהאסטרוציטים.

Abstract

הצפיפות הגבוהה ביותר של מובילי גלוטמט במוח נמצאת בהאסטרוציטים. כמה מובילי גלוטמט התנועה של גלוטמט על פני הקרום עם שיתוף ההובלה של 3 Na ⁺ ו 1 ⁺ H ונגד התחבורה של K ⁺ 1. יכול להיות במעקב הנוכחי stoichiometric הנוצרים בתהליך ההובלה עם הקלטות תיקון-מהדק כל התא מתאים כוכביים. כמובן הזמן הנוכחי נרשם מעוצב על ידי את מהלך הזמן של פרופיל גלוטמט הריכוז כדי שהאסטרוציטים חשופים, קינטיקה של מובילי גלוטמט, ואת מאפייני electrotonic הפסיביים של קרומי astrocytic. כאן אנו מתארים את השיטות הניסיוניות ואנליטי, שניתן להשתמש כדי להקליט זרמי טרנספורטר גלוטמט בהאסטרוציטים ולבודד את מהלך הזמן של אישור גלוטמט מכל הגורמים האחרים המעצבים את צורת הגל של זרמי טרנספורטר astrocytic. השיטות שתוארו כאן ניתן להשתמש כדי להעריך את החיים oF פלאש ברח מכלוב וsynaptically-שוחרר גלוטמט בממברנות astrocytic בכל אזור במערכת העצבים המרכזית בבריאות ובחוליים.

Introduction

האסטרוציטים הם אחד מסוגי התאים הנפוצים ביותר במוח עם מורפולוגיה בצורת כוכב ובליטות בממברנה עדינות שמרחיבות לאורך neuropil ולהגיע ^1,2 קשרים סינפטיים השכן. קרום התא של האסטרוציטים הוא ארוז בצפיפות עם מולקולות טרנספורטר גלוטמט ^3. בתנאים פיסיולוגיים, מובילי גלוטמט במהירות לאגד גלוטמט בצד החוץ התאי של הממברנה ולהעביר אותו אל הציטופלסמה התא. בעשותם כך, מובילי לשמור על ריכוז הבסיס הנמוך של גלוטמט ^ב4 השטח תאי. מובילי גלוטמט בתהליכי astrocytic משובחים סמוכים לגירוי הסינפסות ממוקמים באופן אידיאלי כדי לאגד גלוטמט שוחרר במהלך אירועים סינפטיים כפי שהוא מפזר ממרווח הסינפטי. בעשותם כך, מובילי גם להגביל גלישת גלוטמט כיוון ו- פרי אזורים נוסף סינפטי ועל הסינפסות שכנות, צמצום הפער המרחבי של אות מעוררתים במוח ^5-7.

גלוטמט תחבורה היא תהליך electrogenic stoichiometrically מצמידים את התנועה של 3 Na ⁺ ו ⁺ 1 H לאורך השיפוע אלקטרוכימי שלהם וללוחמה בהובלה של 1 K ^{+ 8.} התחבורה גלוטמט קשורה (אבל לא stoichiometrically מצמידים) מוליכות anionic חדירים לSCN ^- (thiocyanate)> מס ^{_'3 -} (ניטראט) ≈ CLO ₄ ^- (פרכלורט)> אני ^-> Br ^-> Cl ^-> F ^-, לא לCH ₃ SO ₃ ^- (מתאן sulfonate) ו-C ₆ H ₁₁ O ₇ ^- (גלוקונאט) ^9-11. שני הזרמים (stoichiometric ולא stoichiometric) ניתן להקליט על ידי קבלת הקלטות תיקון-מהדק כל התא מהאסטרוציטים, שזוהו תחת תאורת Dodt או התערבות ההפרש לעומת זאת אינפרא אדום (IR-DIC) חזותי בacutדואר פרוסות מוח ^12. מרכיב stoichiometric של הנוכחי קשורים לתחבורת גלוטמט על פני הקרום יכול להיות מבודד באמצעות CH ₃ SO ₃ ^-, או ג _{6 11 7} O H ^- פתרונות תאיים מבוסס ויכול להיות עורר על ידי גלוטמט פלאש משחררות רפרוף על האסטרוציטים ^13,14, או על ידי הפעלת שחרור גלוטמט מהסינפסות שכנות, או חשמלי ¹² או עם שליטה ממוקדת optogenetic.

מהלך הזמן של רכיב stoichiometric של נוכחי טרנספורטר מעוצב על ידי חיים שלמים של פרופיל ריכוז הגלוטמט בממברנות astrocytic (אישור גלוטמט כלומר), קינטיקה של מובילי גלוטמט, את מאפייני הקרום הפסיביים של האסטרוציטים, ובמהלך הגירויים הסינפטי, על ידי סינכרוניזציה של שחרור גלוטמט פני סינפסות הופעלה ^13. כאן אנו מתארים בפירוט מלא: (1) appr ניסיוניתאוח לבודד את מרכיב stoichiometric של זרמי טרנספורטר גלוטמט מהקלטות תיקון-מהדק כל התא מהאסטרוציטים באמצעות פרוסות בהיפוקמפוס חריפות עכבר כהכנה ניסיונית דוגמה, (2) גישה אנליטית לגזור את מהלך הזמן של אישור גלוטמט מהקלטות אלה ^{13, 14.} שיטות אלה יכולים לשמש כדי להקליט ולנתח זרמי טרנספורטר גלוטמט מהאסטרוציטים בכל אזור של מערכת העצבים המרכזית.

Protocol

1. הכנת פרוסה

1. הכן 500 מיליליטר חיתוך פתרון / אחסון המכיל (מ"מ): 119 NaCl, KCl 2.5, 0.5 CaCl _2, 1.3 MgSO ₄ · 7H ₂ O, 4 MgCl _2, 26.2 NaHCO _3, 1 אא ₂ PO _4, וגלוקוז 22, 320 mOsm, pH 7.4
2. השתמש בכוס 250 מ"ל כדי להכין את חדר טבילה לפרוסות, למלא אותו עם 200 מיליליטר חיתוך פתרון / אחסון, לחמם אותו באמבט מים ב 34 ° C ו בועה אותו עם 95% ₂ O, 5% CO _2.
3. שמור את הפתרון שנותר החיתוך / האחסון בבקבוק זכוכית ב 4 ° C.
4. השתמש בדבק cyanoacrylate לצרף בלוק אגר קטן (6%, שהוכן בACSF) על בעל מדגם vibratome ולאחסן אותו ב 4 ° C.
5. 30 דקות לפני תחילת חיתוך, הנח את בקבוק הזכוכית המכיל את הפתרון / אחסון חיתוך בדלי מלא קרח ואת בועה אותו עם 95% ₂ O, 5% CO _2.

6. להרדים את העכבר (P14-21, C57BL / 6) עם halothane / isoflurane (isoflurane כבר דווח על מנת לשפר את ספיגת גלוטמט astrocytic ^15), לערוף אותו, וטובל את ראשו בכוס 50 מ"ל המכילה חומץ פתרון, קר חיתוך / אחסון.
7. לבצע נתיחה של המוח על שקית קרח עטופה במגבות נייר ומאוחסן ב -20 ° C.
8. השתמש באזמל כדי להפוך את חתך בעור באמצע sagittal בצד הגב של הראש, מקדמי לקצה הזנב, ולחשוף את הגולגולת.
9. מניחים את להב הגזירה התחתון של מספריים קטנים כירורגיות בחור העורפי ולעשות שני חתכים, לכיוון השמאל ועל צד ימין (45 ° זווית).
10. חותכים את הגולגולת לאורך קו אמצע sagittal, מהזנב לקצה הקדמי.
11. הסר את המוח עם מרית ולטבול אותו בחומץ, קר חיתוך / אחסון solutiב.
12. עם אזמל, לעשות חמישה קיצוצים ל: (1) להסיר את נורות חוש הריח וקליפת המוח הקדמית, (2) להסיר את המוח הקטן; (3) להסיר את השמאל ו( 4) אונות הטמפורליות נכונות; (5) להפריד בין שתי האונות במוח עם חתך באמצע sagittal.
13. תמרחי את שני חלקים של המוח עם מגבות נייר כדי להסיר כל פתרון עודף.
14. דבק לרוחב פני השטח של כל חלק במוח לצלחת בסיס vibratome הקר: צד הגבי של המוח צריך להיות מול להב vibratome; הצד הגחוני של המוח צריך להיות במגע עם הבלוק אגר, הרחק מלהב vibratome.
    הערה: כדי לקבל את הפרוסות באיכות הגבוהה ביותר, חשוב ששני החלקים של המוח מודבקים היטב לצלחת בסיס vibratome. כדי לעשות זאת, השתמש בדבק cyanoacrylate שאינו נזילה מדי ושלא יתייבשו מהר מדי.
15. לאבטח את צלחת בסיס vibratome לתא לנתח, להגדיר את ה פרוסהickness 250 מיקרומטר ולהתאים את רוחב טווח הלהב. להמשיך עם החיתוך.
    הערה: אם הכל מכוון כראוי, vibratome צריך להיות חיתוך פרוסות parasagittal מגב לכיוון הגחון וממדיאלי לכיוון הצד לרוחב של המוח.
16. ברגע שהלהב עבר דרך קליפת המוח וההיפוקמפוס, השתמש באזמל כדי לחתוך את הקליפה / היפוקמפוס מהמוח התיכון ומניח כל פרוסה בתא המטבילה 34 ° C.
17. מחק כמה פרוסות הראשונה. בדרך כלל, ניתן לקבל 12 פרוסות (250 מיקרומטר העבה) ממוח P14-21 עכבר.
18. שמור את הפרוסות ב34 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולתת להם להתקרר לטמפרטורת חדר למשך 30 דקות לפני השימוש בהם עבור הקלטות electrophysiology.

2. זיהוי והקלטות astrocyte

1. הכן את הפתרון פנימי המכיל (מ"מ): 120 KCH ₃ SO _3, 10 EGTA, 20 HEPES, 2 MgATP, 0.2 NaGTP,5 QX-314Br, ו5 NaCl, 290 mOsm, pH 7.2.
2. הכן את פתרון תאי המכיל הקלטה (מ"מ): 119 NaCl, KCl 2.5, 2.5 CaCl _2, 1.3 MgSO ₄ · 7H ₂ O, 1 MgCl _2, 26.2 NaHCO _3, 1 NaHPO _4, וגלוקוז 22, 300 mOsm, pH 7.4 , רווי 95% ₂ O, 5% CO _2.
3. הוסף את התרופות הבאות לפתרון ההקלטה תאי, כדי לחסום את ההפעלה של GluA, GluN, mGluRII, mGluRIII, GABA, _GABA-B, וקולטניים אדנוזין A1 (במיקרומטר): 10 2,3-Dioxo-6-ניטרו-1, 2,3,4-tetrahydrobenzo [ƒ] quinoxaline-7-sulfonamide disodium מלח (NBQX), 10 (RS) -3 - (2-carboxypiperazin-4-י.ל.)-propyl-1-phosphonic חומצה (CPP), (2S )-2-אמינו-2-[(1S, 2S)-2-carboxycycloprop-1-י.ל.] -3 - (xanth-9-י.ל.) propanoic חומצת מלח disodium (LY341495), 100 (R, S) α-- methylserine-O-פוספט (MSOP), 100 picrotoxin, 5 - 3 [[(3,4-Dichlorophenyl) מתיל] אמין] propyl] diethoxymethyl) חומצת phosphinic (CGP52432), 18-cyclopentyl-1 ,3-dipropylxanthine (DPCPX).
4. הגדר את הטמפרטורה של הפתרון תאי בתא ההקלטה; טמפרטורות אופייניות הן בין 34-36 ° C.
5. הכן אלקטרודות תיקון-מהדק מהתכה של זכוכית בורה נימים (R ≈ 2.5 MΩ) באמצעות כפול במה, זכוכית מיקרו פיפטה חולץ.
6. קח אחת מהפרוסות ומניח אותו בתא ההקלטה. החזק אותו עם נבל מתכת עשה עם חוט פלטינה ומיתרים ניילון.
7. ראייה לבדוק את הפרוסות תחת Dodt תאורה או IR-DIC. יכולים להיות מזוהים על ידי הגוף שלהם האסטרוציטים תאים הקטן (מ = 10 מיקרומטר) וגרעין בולט (איור 1).
8. לגירויים סינפטיים, למקם את האלקטרודה נירוסטה דו קוטבית, ~ 100 מיקרומטר מastrocyte שאתה מתכנן לתיקון.
9. תיקון astrocyte ולשבור בתצורה כל התא על ידי החלת שאיבה עדינה מאוד.
   הערה: יש לי האסטרוציטים resistanc קלט נמוך בדרך כללדואר (~ 10 MΩ), פוטנציאל הממברנה מנוחה hyperpolarized (~ -90 mV), ואין פעילות ירי. את האסטרוציטים נשמרים בפוטנציאל הממברנה מנוחתה לאורך הניסויים במצב מתח-clamp (כלומר הנוכחיים מחזיק צריכה לקרוא 0 הרשות הפלסטינית). לפני כל גירוי, 10 מילישניות hyperpolarizing צעד מתח (mV -3) משמשת כדי לפקח על הסדרה והתנגדות מבוא של astrocyte.
10. מחק את ההקלטות אם שינויי התנגדות הסדרה> 20% או אם פוטנציאל הממברנה של astrocyte הופך depolarized. פוטנציאל הממברנה של astrocyte ניתן למדוד ישירות על ידי מעבר ממתח-clamp למצב נוכחי מהדק. לחלופין, כשהוא במצב מתח מהדק, ניתן לנטר את פוטנציאל הקרום על ידי קריאת הערך של פוטנציאל ההחזקה כי תוצאות 0 הרשות הפלסטינית מחזיקות נוכחית.
11. אם גירויים סינפטיים מועסקים, גירויים חלופיים בודדים ולזווג (למשל 100 אלפיות שנייה בנפרד), בכל 10 - 20 שניות.
12. לexperim photolysis UVמציג, חבר מנורת Xe משחררות רפרוף לנמל epifluorescence של המיקרוסקופ ולהוסיף למתחם כלוב לפתרון תאי. ניתן להשיג זרמי Transporter של ~ משרעת הרשות הפלסטינית 100 כאשר פלאש משחרר רפרוף מיקרומטר משרד תשתיות לאומי-L-גלוטמט 100 בכל שדה הראייה (מ = 662.5 מיקרומטר בעת שימוש אובייקטיבי 40X ^14). גירויים חלופיים עם נתיב האור הפתוח וחסום, כל 10 - 20 שניות.
13. לעורר ארעיים גלוטמט וזרמי טרנספורטר שיא בתנאי בקרה ובנוכחותו של תת להרוות ריכוז של חומצת אנטגוניסט הספקטרום רחב גלוטמט טרנספורטר D, L-β-threo-Benzyloxyaspartic (TBOA; 10 מיקרומטר) כדי להפחית את משרעת הנוכחית טרנספורטר לפחות 30% משווי שליטתה (ראה סעיפים 4, 5), או בנוכחות ריכוז גבוה של TBOA (50 - 100 מיקרומטר) כדי לחסום זרמי טרנספורטר לחלוטין ולבודד את K המתמשך ⁺ שוטף (ראה סעיף 3) .

3. Pharmacבידוד ological של K המתמשכים ⁺ השוטף

1. הקלט זרמי astrocytic בתנאי בקרה ובנוכחות ריכוז להרוות, גבוה של TBOA (50 - 100 מיקרומטר).
2. ממוצע של לפחות 20 במטאטא TBOA (50 - 100 מיקרומטר).
3. תתאים את העקבות הממוצעות על 3.2 התקבלו בעם הפונקציה:
   
   הערה: רכיב TBOA-חסר הרגישות (כלומר אחד שהוא רשם בנוכחות TBOA (50 - 100 מיקרומטר)) מייצג את K-המתמשך ⁺ נוכחית. כמובן הזמן שלה מקורב על ידי הפונקציה מונו מעריכי שתוארו לעיל.
4. חזור על הכושר הזה על פני האסטרוציטים שונים ולהפיק ערך מΤ _עלייה ממוצע (כלומר זמן העלייה הממוצע של K ⁺ המתמשכת השוטפת (ראה סעיף 5)).

4. אניsolation של פרשת בנחייתם של זרמי Transporter synaptically המופעל (fSTCs)

1. ממוצע לפחות 20 מטאטא שהושג עם גירויים לזווג, בתנאי בקרה ובTBOA (10 מיקרומטר) (משמאל איור 2a).
2. מספר זהה ממוצע של מטאטא שהושג עם גירויים בודדים, בתנאי בקרה ובTBOA (10 מיקרומטר) (איור 2a באמצע).
3. השווה את המשרעת של התגובה הנוכחית הממוצעת לצעד מתח mV -3 בארבע עקבות הממוצע (דופק השליטה יחיד, בקרה לזווג קטניות, דופק יחיד TBOA, TBOA לזווג פולסים).
4. אם את המשרעת של התגובה הנוכחית היא אותו הדבר בכל ארבע העקבות, המשך לשלב 4.7.
5. אם את המשרעת של התגובה הנוכחית הממוצעת היא שונה בכל אחד מארבע העקבות, לבדוק שכל העקבות הבודדות היו מתאימים להיכלל בממוצע.
6. אם את המשרעת של הזרם הממוצע היא שונה בכל אחד מארבע העקבות, אבל בסךעקבות dividual מתאימות להיכלל בממוצע, לוודא שכל עקבות הגודל של קשקשי fSTC ליניארי עם הגודל של התגובה הנוכחית לצעד מתח הבדיקה. אם זה המקרה, בקנה מידה כל העקבות בכבוד זה לזה, כך שהתגובות השוטפות לצעד מתח המבחן כולם שווים באמפליטודה.
   הערה: בתנאי ההקלטה שתואר כאן (כלומר תאי CH ₃ SO ₃ ^- או C ₆ H ₁₁ O ₇ ^-), גירויים סינפטיים של אקסונים מעוררים ליצור זרמי astrocytic עם צורות גל מורכבות בהיקף של stoichiometric עולה במהירות חולף זרם פנימה ואיטי -עולה, ספג K פנימה ⁺ נוכחי משקף K ⁺ מחדש איזון במרחב תאי בעקבות התפשטות פוטנציאל פעולה לאורך האקסונים שכנים. זה קריטי כדי להסיר K המתמשך הזה ⁺ שוטף, כמו כל זרם שיורי יוביל ללהפריז בהערכה של החיים גלוטמט.
7. הפחת את העקבות הממוצעת שהושגו עם גירויים בודדים מהזכר הממוצע שהושג עם גירויים לזווג (איור 2a מימין). שלב זה מאפשר בידוד stoichiometric והמתמשך K ⁺ הנוכחי עורר על ידי הגירוי השני.
8. Shift העקבות הממוצעת שהושגו עם גירויים בודדים במרווח זמן שמתאים למרווח בין הדופק המשמש להעברה לזווג קטניות (כלומר 100 אלפיות שנייה) (איור 2b).
9. הפחת את התגובה בזמן השתנה הממוצע שהושגה עם גירויים בודדים מהתגובה הממוצעת לגירוי השני שהושג ב4.7 (איור 2 ג). צעד זה מבודד את חלק הקל של טרנספורטר הנוכחי עורר על ידי הגירוי השני (fSTC).
10. ברוב המקרים, השלב הקודם מסיר לחלוטין K המתמשך ⁺ הנוכחי. אם זה המקרה, את הבידוד של fSTC הושלם ואתה יכול proceאד עם ניתוח deconvolution ולגזור את מהלך הזמן של אישור גלוטמט מהאסטרוציטים. בחלק מהמקרים, לעומת זאת, K מתמשך קטן ^+-נוכחי הוא עדיין קיים (איור 2) ונדרש ניתוח נוסף (סעיף 5 ראה מסגרת).
    הערה: לזכור שהניתוח שמתואר ב4.7-4.10 חייב להתבצע על העקבות הממוצעות שהושגו בתנאי בקרה ובTBOA (10 מיקרומטר).

5. חיסור של K ⁺ zdustained שיורי שוטף מfSTCs

1. מדוד את המשרעת של K ⁺ המתמשכת השוטפת שנותרה לאחר ביצוע הניתוח האמור בסעיף 4.
2. הרחב את המשרעת של הפונקציה מונו מעריכי שמתוארת ב3.3 למשרעת של K המתמשך שיורי ⁺ שוטף נמדד ב5.1 (איור 2 שמאל ואמצע). כדי לעשות זאת, במשוואה 3.3, להגדיר את המונח שווה למשרעת של K ⁺ המתמשכת השוטףasured ב5.1 והטווח Τ _העלייה שווה לערך הממוצע של Τ _עלייה המוערכת ב3.4.
3. להחסיר את הפונקציה מונו מעריכי כתוצאה מK fSTC ומתמשך ⁺ שוטף המתקבל ב4.10 (איור 2 מימין). צעד זה משלים את הבידוד של fSTC.

6. בידוד של זרמי Transporter פלאש המופעל (FTCs)

1. ממוצע לפחות 20 מטאטא שהושג עם נתיב האור הפתוח, בתנאי בקרה ובTBOA (10 מיקרומטר).
2. מספר זהה ממוצע של מטאטא שהושג עם נתיב האור סגור, בתנאי בקרה ובTBOA (10 מיקרומטר).
3. השווה את המשרעת של התגובה הנוכחית לצעד מתח mV -3 בארבע עקבות הממוצע (דופק השליטה יחיד, בקרה לזווג קטניות, דופק יחיד TBOA, TBOA לזווג פולסים).
4. אם את המשרעת של התגובה הנוכחית היא אותו הדבר בכל ארבע העקבות, המשך לשלב 6.7.
5. אם את המשרעת של הזרם הממוצע היא שונה בכל אחד מארבע העקבות, אבל כל העקבות הבודדות מתאימות להיכלל בממוצע, לוודא שכל עקבות עם נתיב האור לפתוח את גודלו של ה-FTC הקשקשים באופן ליניארי עם הגודל של התגובה הנוכחית לצעד מתח הבדיקה. אם זה המקרה, בקנה מידה כל העקבות בכבוד זה לזה, כך שהתגובות השוטפות לצעד מתח המבחן כולם שווים באמפליטודה.
   הערה: בתנאי ההקלטה שתואר כאן (כלומר תאי CH ₃ SO ₃ ^- או C H ₁₁ O ₆ ^- _7), גירויי פלאש ליצור זרמי astrocytic המורכבים רק מחולף stoichiometric הזרם פנימה עולה במהירות.
6. הפחת את העקבות הממוצעת שהושגו עם אור טפיחהשעות חסומות מהזכר הממוצע שהושג עם נתיב האור הפתוח. שלב זה מאפשר הסרת חפץ הגירוי ולבודד את FTCs.
   הערה: הניתוח שתואר ב6.7 חייב להתבצע על העקבות הממוצעות שהושגו בתנאי בקרה ובTBOA (10 מיקרומטר).

7. ניתוח deconvolution

1. Fit טרנספורטר הנוכחי (fSTC או FTC) נרשם בתנאי בקרה (איור 3 א שמאל) ובTBOA (10 מיקרומטר) (איור 3 א מימין) ומבודדת כפי שתואר בסעיפים 4 - 6, עם הפונקציה רבת מעריכי:
   
2. ליצור פונקציה באופן מיידי עולה כי דועך מונו באופן אקספוננציאלי, בהתאם לפונקציה:
   
   ו -בצורה הטובה ביותר מתארת ​​את השלב הנוכחי של מתפורר טרנספורטר נרשם בTBOA (10 מיקרומטר) (איור 3).
   הערה: הפונקציה שמתוארת ב7.2 (כלומר H (t)) מייצגת את מהלך הזמן של אישור גלוטמט מהאסטרוציטים בנוכחות TBOA (10 מיקרומטר).
3. Deconvolve הפונקציה מונו מעריכי שהושגו ב7.2 (איור 3 וג 3 באמצע) מההתקף של טרנספורטר הנוכחי נרשם בTBOA (10 מיקרומטר) המתקבל ב7.1 (איור 3 א נכון, ג משמאל).
   הערה: deconvolution הוא פעולה מתמטית כלולה בחבילות תוכנת ניתוח רבות כמו (למשל Matlab, Python). בIgorPro, קוד תכנות, כי בדרך כלל אנו משתמשים כדי לבצע סוג זה של ניתוח, ניתוח deconvolution ניתן לחשב ביעילות כפי שיתואר להלן, על ידי שימוש פורייה מהיר הופך דיסקרטית. ראשית, להשתמש בפעולת FFT כדי לחשב את דיscrete מהיר התמרה פורה של הפונקציה מונו מעריכי שהושגה ב7.2 ושל ההתקף של טרנספורטר הנוכחי נרשם בTBOA הושג ב7.1. בשלב הבא, השתמש בפעולת IFFT כדי לחשב את המהירות ההפוכה דיסקרטי ההתמרה של היחס של שתי פונקציות FFT. ניתן לתאר את הפונקציה אני כתוצאה (t) באופן הבא:
   
   הצעד המתואר ב7.3 מאפשר נובע מסנן של טרנספורטר הנוכחי בTBOA (10 מיקרומטר) (איור 3 ג מימין). המסנן מייצג את גורמי העיוות כי להמיר את חייו של גלוטמט בממברנות astrocytic לטרנספורטר הנוכחי מבודד בסעיפים 4 - 6 (כלומר fSTC או ה-FTC).
4. Deconvolve המסנן (איור 3 ג הנכון, איור 3D באמצע) מההתקף של טרנספורטר הנוכחי בתנאי בקרה (איור 3 א איור 3D משמאל).
   הערה: שלב זה מאפשר הנובע כמובן עת שחרור גלוטמט מהאסטרוציטים בתנאי בקרה (איור 3D מימין). ההנחה העומדת בבסיס צעד deconvolution זה היא שהפרופיל הזמני של המסנן נותר ללא שינוי בתנאי בקרה ובTBOA (10 מיקרומטר).
5. כדי לקבל אומדן כמותי של מהלך הזמן הכולל של אישור גלוטמט, לחשב centroid (<t>) של צורת הגל המתקבל בשלב 7.4. הדבר נעשה על ידי חישוב <t> כ:
   
   כאשר G (t) הוא צורת הגל המתקבל בשלב 7.1. במשוואה שתוארה לעיל, לא המונח מתאים לחלון הזמן שבו נפרד מחושב.
   שים לב: כאשר השיטה הייתה ראשונה שהוקמה,<t> חושב על חלונות זמן שנותרו בלתי מוגבל ^13. גישה זו יכולה לשמש כל עוד חלון האינטגרציה מוגדר להיות רחב יותר מאשר משך הזמן של אישור גלוטמט ודועך צורת גל הסיקול לחלוטין חזרה לנקודת התחלה. אם זה לא המקרה, עם זאת, שיטה זו של הערכת <t> פוגשת כמה מגבלות. לדוגמה, אם צורת גל הסיקול אינה להירקב בדיוק חזרה לנקודת התחלה, ולאחר מכן עם <t> מגדיל את הרוחב של חלון האינטגרציה. כדי להימנע מכל מקור אפשרי לחוסר דיוק לאומדן <t>, עכשיו אנחנו מחשבים אותו על פני חלון זמן מקביל ל -10% מהשיא של טרנספורטר הנוכחי, לפני ואחרי ¹⁴ הופעת המחלה. הגישה השנייה משפרת את העקביות שבי <t> נמדדת על פני תאים. זה שימושי במיוחד בעת ניתוח השפעות קטנות של טיפולים תרופתיים על המהלך של שחרור.

Representative Results

ההצלחה של הגישה אנליטית שתוארה כאן באופן ביקורתי תלויה בהשגת הקלטות אלקטרו באיכות גבוהה של זרמי טרנספורטר מהאסטרוציטים בכל אזור של מערכת העצבים המרכזית. בחתכי היפוקמפוס עכבר חריפים, האסטרוציטים ניתן לזהות בקלות תחת Dodt תאורה או IR-DIC בגלל הגוף שלהם תאים הקטן (O מיקרומטר = 10) וגרעין בולט (איור 1). המורפולוגיה בצורת כוכב הייחודית שלהם יכולה להיות מוערכת עם epifluorescence, confocal, או מיקרוסקופ סריקת לייזר שני פוטונים, בעת הוספת fluorophore כמו אלכסה 594 (50 מיקרומטר) לפתרון תאי, (איור 1). ברמת electrophysiology, האסטרוציטים מאופיינים בהתנגדות נמוכה קלט, פוטנציאל הממברנה hyperpolarized (~ -90 mV) וחוסר יכולת לייצר פוטנציאל פעולה. האסטרוציטים ליצור זרמים בתגובה לגירוי חשמלי של תאי עצב או optogenetic השכנים וphotolysis UV של CAתרכובות GED כמו משרד התשתיות הלאומי-L-גלוטמט.

ניתן להקליט באמצעות זרמי טרנספורטר astrocytic Cs ⁺ או K ⁺ פתרונות פנימיים מבוסס. שים לב שCs ^+, K ⁺ תחליף פופולרי, תומכת בתחבורת גלוטמט אבל מאט את קצב רכיבה על אופניים טרנספורטר גלוטמט ^16,17 (כי לאגד גלוטמט מובילים ו / או translocate Cs ⁺ דרך הממברנה לאט יותר K ^+). אם Cs ⁺ מפחית באופן משמעותי את מספר המובילים זמינים לגלוטמט המחייב, זה מוביל גם לזרמים קטנים יותר טרנספורטר / איטיים יותר מאלה שנרשמו עם K ⁺ פתרונות פנימיים מבוסס ^16,17.

בעת שימוש בCH ₃ SO ₃ ^- או C ₆ H ₁₁ O ₇ ^- כאניון תאי העיקרי, הזרם שנוצר על ידי מובילי גלוטמט בהאסטרוציטים הוא עקב תנועת stoichiometrically-שילוב של גלוטמט 1, 3 Na + ו ⁺ 1 K על פני הקרום. נוכחי stoichiometric זה הוא היחיד שנרשם מהאסטרוציטים בניסויים photolysis ואנחנו מתייחסים אליו כאליו ה-FTC. בעת ביצוע ניסויי photolysis, מומלץ לגירויי UV חלופיים שהושגו עם נתיב האור הפתוח וחסום. את העקבות שהושגו עם נתיב האור החסום שימושיות לבודד את חפץ הגירוי שנוצר על ידי מנורת הבזק ויכול להיות מופחת מאלה שהושגו עם נתיב האור הפתוח לבודד לחלוטין ה-FTC.

יש הנוכחיים נרשם בהאסטרוציטים כאשר לעורר שחרור הסינפטי של גלוטמט צורת גל מורכב יותר. הוא מורכב ממרכיב פנימה עלייה מהירה, חולף בשל הנוכחי טרנספורטר גלוטמט stoichiometrically המצמידים שתוארו לעיל. בנוסף, הוא כולל K איטי בעליה, מתמשך פנימה ⁺ שוטף עקב זרם של K ⁺ הצטברו בחלל החוץ התאי לאחר פוטנציאל פעולההתפשטות לאורך האקסונים שכנים. גישה תרופתית יכולה לשמש כדי לבודד את טרנספורטר הנוכחי מK ⁺ המתמשך השוטף ומחייבת השימוש בריכוזים גבוהים של הספקטרום רחב גלוטמט טרנספורטר אנטגוניסט TBOA (100 מיקרומטר) בסוף הניסוי ^12. השיטה המתוארת כאן משתמשת בגישה אנליטית טהור לבודד טרנספורטר גלוטמט הנוכחי מK ⁺ המתמשך שוטף ולכן מאפשר לניסויים קצרים יותר (איור 2).

כצעד ראשון, אנו Interleave גירויים בודדים ולזווג דופק סינפטיים (100 אלפיות שנייה בנפרד), בכל 10 - 20 שניות, ומספר זהה ממוצע של מטאטא שהושג עם גירויים בודדים ולזווג את הדופק. המשרעת של הזרם הראשון עורר על ידי הגירויים לזווג צריכה להתאים את המשרעת של הזרם עורר על ידי הגירוי היחיד. אנחנו מתחילים את הניתוח הזה על ידי הפחתה הנוכחית עורר על ידי הגירוי היחיד שמעורר על ידיהגירויים לזווג. זה חיסור מאפשר בידוד התגובה לגירוי השני, שגם הוא מורכב מטרנספורטר עלייה המהירה, חולף גלוטמט הנוכחי ואיטית בעליה, ^K-+ מתמשך נוכחי (איור 2a מימין). בשלב בא, אנחנו משמרת את התגובה לגירוי אחד על ידי מרווח זמן מתאים למרווח בין הדופק של הגירויים לזווג, כך שזמן תחילתה של תגובה אחת תואם את זמן תחילתה של התגובה השנייה מעל מבודדת (איור 2b ). על ידי הפחתת שני זרמים אלה, אנו לבודד את חלק הקל של טרנספורטר הנוכחי, שאנחנו קוראים כאן fSTC (איור 2 ג). קינטיקה של fSTC דומה לקינטיקה של טרנספורטר synaptically המופעל הנוכחי (STCs) מבודדים פרמקולוגית עם ריכוזים גבוהים של טרנספורטר אנטגוניסט TBOA גלוטמט (100 מיקרומטר) ^13. מסיבה זו ולפשטות, בעבודה קודמת, התייחסנו לfSTCכSTC ^13,14. למרות היותו זרמים עם מאפיינים דומים, וfSTCs STCs הם לא אותו הדבר הנוכחי. מסיבה זו ועל דיוק, בעבודה זו, נתייחס אליהם באופן מפורש כfSTCs וSTCs. שיטת החיסור המתוארת כאן מאפשרת בידוד מדויק של fSTCs ברוב ההקלטות. עם זאת, במקרים מסוימים, K מתמשך שיורי ^+-נוכחי הוא עדיין קיים. במקרה זה, יש צורך לבודד את ^K-+ המתמשך נוכחי בניסויים נפרדים בשימוש בריכוזים גבוהים של TBOA (50 - 100 מיקרומטר). מהלך הזמן של K ספג פרמקולוגית מבודד ⁺ נוכחי יכול להיות מתואר על ידי פונקציה מונו בצורה מעריכית:

על ידי הקלטת זרמי astrocytic בתאים שונים, אנו מעריכים את הערך הממוצע של Τ _עלייה. בשלב הבא אנו creat פונקציה מונו מעריכי EA כמו זה שתוארה לעיל, שבו _עליית Τ תואמת את הערך של Τ _עלייה הממוצע שנמדד באופן ניסיוני בהאסטרוציטים שונים ותואם את המשרעת של K המתמשך שיורי ⁺ שוטפים שאנחנו רוצים להסיר (איור 2 ).

השיטה שתוארנו למעלה כדי לבודד fSTCs עובדת יפה כאשר לעורר שחרור גלוטמט מהקלת סינפסות והוא יכול לשמש גם כדי ללמוד לשחרר גלוטמט מהסינפסות שעוברות דיכאון לזווג דופק. עם זאת, הוא שימוש מועט כאשר סינפסות glutamatergic תחת מחקר לא מראות שום צורה ברורה של סיוע לטווח קצר או דיכאון. במקרה זה, הבידוד התרופתי של זרמי טרנספורטר עם ריכוז גבוה של TBOA (100 מיקרומטר) נשאר הפתרון ריאלי ביותר לבודד את טרנספורטר גלוטמט stoichiometrically מצמיד, synaptically-עורר נוכחי.

"Jove_content"> כדי לבצע את ניתוח deconvolution ולמדוד את אורך החיים של גלוטמט בממברנות astrocytic יש צורך לבודד את FTCs או fSTCs בתנאי בקרה ובנוכחותו של תת להרוות ריכוז TBOA (10 מיקרומטר), כדי להפחית את טרנספורטר משרעת נוכחית ללפחות 30% מהערך שלה בתנאי בקרה (כלומר מבלי לחסום אותו לחלוטין). המטרה כאן היא להאט באופן משמעותי את מהלך הזמן של טרנספורטר הנוכחי מבלי לאבד את היכולת להבחין בינו לבין הרעש של ההקלטות. הנחת היסוד היא, כי בנוכחות של ריכוז קטן של TBOA, כאשר יכולת הספיגה של האסטרוציטים היא פחתה, הגורם העיקרי בעיצוב הדעיכה של טרנספורטר הנוכחי הוא הירידה ההדרגתית של ריכוז הגלוטמט בקרום astrocytic ^12,18. אנחנו בכושר הנוכחי טרנספורטר בתנאי בקרה ובTBOA (10 מיקרומטר) עם הפונקציה רבת מעריכי:

(איור 3 א). אנו משוערים אישור גלוטמט בTBOA (10 מיקרומטר) עם פונקציה באופן מיידי-עולה עם דעיכה מונו מעריכי (איור 3) ואנחנו deconvolve אותו מהפונקציה רבת מעריכי המתארים את טרנספורטר הנוכחי בTBOA (10 מיקרומטר; איור 3 ג). צורת הגל המתקבלת הוא "המסנן", ומייצג את השילוב של גורמים המעוות (כלומר מסנן) את פרופיל ריכוז הגלוטמט לטרנספורטר הנוכחי (איור 3 ג). Deconvolving המסנן מהכושר רב מעריכי של טרנספורטר הנוכחי בתנאי בקרה מאפשר לאמוד את מהלך הזמן של פרופיל ריכוז הגלוטמט בastrocyte נרשם בתנאי בקרה (איור 3D). לניתוח deconvolution זה, אנו מניחים כי קינטיקהשל המסנן יישאר ללא שינוי, בהעדר ובנוכחותו של TBOA (10 מיקרומטר). זו הנחה סבירה, כי כל הגורמים שתורמים למסנן (קינטיקה כלומר טרנספורטר, סינון electrotonic, ובמהלך הגירויים סינפטיים, שחרור אסינכרוני של גלוטמט פני סינפסות) צפויים להיות מושפע על ידי הנוכחות של TBOA, תרכובת המפחיתה את המספר של מובילים זמינים לגלוטמט המחייב.

אנו משתמשים בcentroid (<t>) כמדד לחי גלוטמט בממברנות astrocytic בתאים שונים. <t> מייצג את "מרכז המסה" של צורת גל הסיקול, והוא רגיש לשינויים בשניהם זמן עלייה ודעיכה של צורת גל סיקול גלוטמט. Centroid מבוטאת:

class = "jove_content"> ישנן שתי דרכים כדי להחליט על מרווח הזמן שבו אנו יכולים לחשב את אינטגרל במונה וגם במכנה של ביטוי זה. בגלל צורת הגל עולה מאישור ודועך חזרה לאפס, כאשר השיטה הייתה ראשונה שהוקם, לא היה מפרט עשה על איך להגדיר את חלון האינטגרציה, ובעובדה שדבר נעשה באופן רופף ולא ^13. אחת דרכים לעקוף בעיה זו היא להגביל את חלון האינטגרציה לזמן שנדרש כדי להגיע לשיעור שרירותי של ה-FTC / fSTC השיא, למשל 10% ^14. קריטריון זה מאפשר פשוט להיות עקבי בעת ביצוע ניתוח זה בתאים שונים, משפר את רמת הדיוק באומדני <t> כאשר גל הסיקול אינו ריקבון בצורה מושלמת לאפס, ומשפר את הרגישות של הניתוח להבדלים קטנים בגל סיקול שאולי מתרחש בקבוצות של תאים שונות.

דואר 1 "עבור: תוכן-width =" 3in "עבור: src =" / files/ftp_upload/50708/50708fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50708/50708fig1.jpg "/>
איור 1. זיהוי של האסטרוציטים בפרוסות בהיפוקמפוס חריפות. (AB) תמונות Dodt של האסטרוציטים ביפוקמפוס CA1 השכבה radiatum. תחת Dodt תאורה וIR-DIC, יכולים להיות מזוהים על ידי האסטרוציטים גוף התא הקטן שלהם וגרעין בולט. החיצים האדומים מצביעים על האסטרוציטים מרובים שיכול להיות מזוהה בהכנת פרוסות. החץ הצהוב מראה את astrocyte שתוקן ומלא בצבע פלואורסצנטי (ראה להלן). (CD) תמונת Dodt מעולף מהפרוסות בהיפוקמפוס ושני הפוטונים של האסטרוציטים המטולאים, הדגישו עם חץ צהוב ב( AB). לצורך ניסוי זה, האסטרוציטים תוקנו ומלא KCH ₃ SO ₃ - פתרון פנימי מבוסס הוסיף עם אלקסה 594 (50 מיקרומטר). תהליכי astrocytic להאריך כמה עשרות מיקרומטר מן tהוא התא בגוף. את ההסברים של השמאל לזהות שלוש השכבות הסלולריות העיקריות של היווצרות CA1 בהיפוקמפוס, כי ניתן להכיר בפרוסות.

איור 2. בידוד של fSTCs מזרמי טרנספורטר synaptically המופעל נרשמו בהאסטרוציטים. (AC) תכנית של צעדי האנליטיות הנדרשים כדי לבודד את fSTCs מזרמי טרנספורטר synaptically המופעל נרשמו בהאסטרוציטים. (ד) גישה אנליטית המשמשת להסרת K המתמשך שיורי ⁺ שוטפת מfSTCs (סעיף 5 ראה מסגרת). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

ent-width = "6.5in" עבור: src = "/ files/ftp_upload/50708/50708fig3highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/50708/50708fig3.jpg" />
איור 3. ניתוח deconvolution נהג לגזור את מהלך הזמן של אישור גלוטמט מהאסטרוציטים (א) כושר מונו מעריכי של fSTC / FTC מבודד בתנאי בקרה (משמאל) ובנוכחותו של TBOA (10 מיקרומטר; ימין).. (ב) מהלך הזמן של אישור גלוטמט בTBOA (10 מיקרומטר) מקורב על ידי פונקציה באופן מיידי-עולה עם דעיכה מונו מעריכי. (ג) Deconvolving את מהלך הזמן של אישור גלוטמט בTBOA (10 מיקרומטר) מהכושר רב מעריכי של טרנספורטר הנוכחי בTBOA (10 מיקרומטר) מאפשר לאמוד את המסנן. (ד) Deconvolving המסנן מהכושר רב מעריכי של טרנספורטר הנוכחי בתנאי בקרה מאפשר לאמוד את מהלך הזמן של אישור גלוטמט מהאסטרוציטים בתנאי בקרה.files/ftp_upload/50708/50708fig3large.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

Discussion

כאן אנו מתארים גישה ניסויית להשיג קלטות אלקטרו מהאסטרוציטים, פרוטוקול אנליטי לבודד את זרמי טרנספורטר גלוטמט בהאסטרוציטים ושיטה מתמטית כדי להפיק את מהלך הזמן של אישור גלוטמט מזרמי טרנספורטר astrocytic.

ההצלחה של הניתוח מסתמכת על היכולת להשיג הקלטות מהדק תיקון באיכות גבוהה מהאסטרוציטים ועל הדיוק של האלגוריתמים הולמים כדי לתאר את זרמי טרנספורטר. ניתוח deconvolution מסתמך על שתי ההנחות הבאות. (1) התהליכים מרובים שמעוותים את מהלך הזמן של גלוטמט אישור לניסוי הנוכחי טרנספורטר מוקלט יכולים להיות מיוצג כמערכת ליניארית. אמנם במונחים אבסולוטיים רבים מהגורמים שזרמי טרנספורטר צורה הם מערכות שאינן ליניארי (בכריכת גלוטמט עיקרון ותחבורה יכול גם לעבור רוויה), ניסיוני ראיות אינדיקהTES שמשטר יניארי שלהם הוא רחב. בהתאם לכך, את מהלך הזמן של זרמים של מובילים ושל אישור גלוטמט נשאר אותו הדבר על פני טווח רחב של עוצמת גירוי, הסתברות שחרורו, וריכוזי הגלוטמט ^13,14,18. למרות שנראה שהקירוב זה כדי להיות לגיטימי לתנאי הניסוי שלנו, זה צריך להיות מאומת לפני הניתוח הזה חוזר בהכנות ניסיוניות שונות. (2) המאפיינים של המסנן אינם מושפעים על ידי הנוכחות של TBOA (10 מיקרומטר). הנחה זו נראית סבירה, כי כל הגורמים שתורמים למסנן (קינטיקה כלומר טרנספורטר, סינון electrotonic, ובמהלך הגירויים סינפטיים, שחרור אסינכרוני של גלוטמט פני סינפסות) צפויים להיות מושפע על ידי הנוכחות של TBOA.

על ידי הנובע מצורת גל סיקול גלוטמט fSTCs וFTCs, נקבל שני סוגים שונים של מידע. על ידי ניתוח fSTCs, אנחנו מודדים את הזמן שastrocyממברנות טיקים חשופות לגלוטמט שוחררו מהסינפסות. על ידי לעורר FTCs עם תאורת UV שדה מלאה (כלומר, על ידי גלוטמט משחרר רפרוף על פני השטח כולו astrocytic), אנחנו מודדים את הזמן שקרומי astrocytic חשופים לגלוטמט שברח מכלוב. בניסויים אלה משחררים רפרוף כל מולקולות גלוטמט משתחררות (כלומר ברח מכלוב) באותו הזמן וכל המובילים מופעלים באותו הזמן, על ידי אותו ריכוז גלוטמט. לכן, על ידי ניתוח FTCs, אנחנו יכולים להשיג readout עקיף של יכולת ספיגת גלוטמט astrocytic.

חשוב לציין כי השיטות שתוארו כאן יאפשר לאמוד את מהלך הזמן של אישור גלוטמט, לא את הערך הממשי של ריכוז הגלוטמט מעורר זרמי טרנספורטר. כמובן הזמן המשוער היא מידה ממוצעת של מהלך הזמן של אישור גלוטמט בכל תחומי קרום astrocytic שיש לנו גישה אלקטרו: אין זהלא רגיש לheterogeneities בספיגת גלוטמט באתרים שונים בתוך קרום astrocytic ^19. מידע זה יש יותר סיכוי להתקבל עם מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה של ²⁰ כתבים גלוטמט הרגישים ניאון. עם זאת, הכתבים גלוטמט הרגישים הזמינים כרגע תערוכת טווחים דינמיים צרים יחסית. זה יכול להציג את עיוותים שאינן ליניארי בין פרופיל ריכוז גלוטמט ואות הניאון, להגביל את השימוש בבדיקות אלה כדי לחלץ מידע זמני על ריכוז גלוטמט החולף. לכן, זה כנראה על ידי שילוב של כל אלה הגישות שונות, כי אחד יכול לקבל את ההבנה המקיפה ביותר של הדינמיקה של אותות glutamatergic בממברנות astrocytic.

לסיכום, ניתן להשתמש בשיטות שהוצגו כאן כדי להעריך את מהלך זמן השחרור של גלוטמט synaptically-שוחרר או ברח מכלוב פלאש בממברנות astrocytic. הם מספקים כלים חשובים שcan לשמש כדי להעריך את החיים של גלוטמט במרחב תאי בשלבי ההתפתחות שונים ¹³ במגוון רחב של ¹⁴ מינים של בעלי החיים ואזורים מוחיים בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים ^21.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CGP52432	Tocris	1246
(R,S)-CPP	Tocris	173
DPCPX	Tocris	439
LY341495 disodium salt	Tocris	4062
MSOP	Tocris	803
NBQX disodium salt	Tocris	1044
D,L-TBOA	Tocis	1223
Picrotoxin	Sigma	P1675
MNI-L-glutamate	Tocris	1490
Alexa 594	Life Technologies	A10438	Optional
Matrix electrodes	Frederick Haer Company	MX21AES(JD3)
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments	PG10165-4
Dual-stage glass micro-pipette puller	Narishige	PC-10
Loctite 404 instant adhesive	Ted Pella	46551
Xe lamp	Rapp OptoElectronic	FlashMic
Igor Pro 6	Wavemetrics