Summary
हम astrocytes में ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर धाराओं के electrophysiological रिकॉर्डिंग से astrocytic झिल्ली में ग्लूटामेट का जीवनकाल अनुमान लगाने के लिए एक विश्लेषणात्मक विधि का वर्णन है.
Abstract
मस्तिष्क में ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टरों के उच्चतम घनत्व astrocytes में पाया जाता है. 3 ना + और 1 एच के सह परिवहन + और 1 कश्मीर की जवाबी परिवहन के साथ झिल्ली भर ग्लूटामेट की ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टरों जोड़ी आंदोलन +. परिवहन प्रक्रिया द्वारा उत्पन्न stoichiometric वर्तमान astrocytes से पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग के साथ नजर रखी जा सकती है. दर्ज वर्तमान के समय के पाठ्यक्रम जो astrocytes के सामने आ रहे हैं ग्लूटामेट एकाग्रता प्रोफाइल, ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टरों के कैनेटीक्स, और astrocytic झिल्ली के निष्क्रिय इलेक्ट्रोटोनिक गुणों के समय के पाठ्यक्रम के आकार का है. यहाँ हम astrocytes में ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर धाराओं रिकॉर्ड और astrocytic ट्रांसपोर्टर धाराओं की तरंग को आकार कि अन्य सभी कारकों से ग्लूटामेट निकासी के समय के पाठ्यक्रम को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रयोगात्मक और विश्लेषणात्मक विधियों का वर्णन. यहाँ वर्णित विधि जीवनकाल ओ का अनुमान किया जा सकता हैच फ्लैश Uncaged और स्वास्थ्य और बीमारी के दौरान केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के किसी भी क्षेत्र में astrocytic झिल्ली में ग्लूटामेट synaptically में जारी की.
Introduction
Astrocytes स्टार के आकार और आकृति विज्ञान neuropil में विस्तार और पड़ोसी synaptic संपर्कों 1,2 तक पहुँचने कि ठीक झिल्ली protrusions के साथ दिमाग में सबसे प्रचुर प्रकार की कोशिकाओं में से एक हैं. astrocytes 'कोशिका झिल्ली घनी ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर अणुओं 3 के साथ पैक किया जाता है. शारीरिक शर्तों के तहत, ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टरों तेजी झिल्ली के बाह्य पक्ष में ग्लूटामेट बाँध और सेल cytoplasm को हस्तांतरण. ऐसा करके, ट्रांसपोर्टरों बाह्य अंतरिक्ष 4 में ग्लूटामेट की कम बेसल एकाग्रता बनाए रखें. Synapses के उत्तेजक से सटे ठीक astrocytic प्रक्रियाओं में ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टरों आदर्श इसे दूर synaptic फांक से diffuses रूप अन्तर्ग्रथनी घटनाओं के दौरान जारी ग्लूटामेट बाध्य करने के लिए तैनात कर रहे हैं. ऐसा करके, ट्रांसपोर्टरों भी उत्तेजक संकेत के स्थानिक प्रसार को कम करने, पेरी और अतिरिक्त अन्तर्ग्रथनी क्षेत्रों की दिशा में और पड़ोसी synapses पर ग्लूटामेट spillover सीमा5-7 मस्तिष्क में है.
ग्लूटामेट परिवहन stoichiometrically 3 के आंदोलन करने के लिए मिलकर एक electrogenic प्रक्रिया है ना + और 1 एच उनके विद्युत ढाल के साथ + और 1 + K 8 की जवाबी परिवहन के लिए. (Thiocyanate)> सं 3 - (- नाइट्रेट) ≈ क्लोरीन मोनोऑक्साइड 4 - (perchlorate)> मैं -> बीआर -> सीएल -> एफ - नहीं ग्लूटामेट परिवहन कारण बताओ सूचना को पारगम्य (लेकिन stoichiometrically लिए युग्मित नहीं) एक anionic चालकता के साथ जुड़ा हुआ है (मीथेन सल्फ़ोनेट) और सी 6 एच 11 हे - 7 - (ग्लूकोनेट) 9-11 सीएच 3 तो 3 से. दोनों धाराओं (stoichiometric और गैर stoichiometric) नेत्रहीन acut में Dodt रोशनी या बुनियादी लाल अंतर हस्तक्षेप विपरीत (आईआर डीआईसी) के तहत पहचान astrocytes, से पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के द्वारा दर्ज किया जा सकताई मस्तिष्क स्लाइसें 12. झिल्ली भर ग्लूटामेट परिवहन के साथ जुड़े वर्तमान की stoichiometric घटक सीएच 3 तो 3 का उपयोग कर से अलग किया जा सकता है - या सी 6 एच 11 हे 7 - आधारित इंट्रासेल्युलर समाधान और astrocytes 13,14 पर फ्लैश uncaging ग्लूटामेट द्वारा पैदा किया जा सकता है, या पड़ोसी synapses से ग्लूटामेट रिहाई सक्रिय द्वारा, या तो विद्युत 12 या एक लक्षित optogenetic नियंत्रण के साथ.
ट्रांसपोर्टर वर्तमान की stoichiometric घटक के समय पाठ्यक्रम astrocytic झिल्ली (यानी ग्लूटामेट निकासी) में ग्लूटामेट एकाग्रता प्रोफ़ाइल के जीवनकाल के आकार का है, ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टरों, astrocytes के निष्क्रिय झिल्ली गुण के कैनेटीक्स, और द्वारा अन्तर्ग्रथनी stimulations के दौरान सक्रिय synapses के 13 पार ग्लूटामेट रिहाई की समक्रमिकता. यहाँ हम पूर्ण विस्तार से वर्णन है: (1) एक प्रयोगात्मक apprएक उदाहरण के प्रयोगात्मक तैयारी के रूप में तीव्र माउस hippocampal स्लाइस का उपयोग कर astrocytes से पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग से ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर धाराओं के stoichiometric घटक अलग करने के लिए oach, (2) एक विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण इन रिकॉर्डिंग 13 से ग्लूटामेट निकासी के समय पाठ्यक्रम प्राप्त करने के लिए 14. इन विधियों रिकॉर्ड और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के किसी भी क्षेत्र में astrocytes से ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर धाराओं का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
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Protocol
1. स्लाइस तैयारी
- 119 NaCl, 2.5 KCl, 0.5 2 CaCl, 1.3 4 MgSO · 7 2 हे, 4 2 MgCl, 26.2 3 NaHCO, 1 नाह 2 पीओ 4, और 22 ग्लूकोज, 320: युक्त / भंडारण समाधान (मिमी) टुकड़ा करने की क्रिया 500 मिलीलीटर की तैयारी mOsm, 7.4 पीएच
- स्लाइस के लिए एक डुबकी कक्ष तैयार करने के लिए एक 250 मिलीलीटर बीकर का उपयोग करें, / भंडारण समाधान करने की क्रिया के 200 मिलीलीटर के साथ भरने, 34 पर एक पानी के स्नान में गर्म डिग्री सेल्सियस और 95% 2 हे, 5% सीओ 2 के साथ बुलबुला यह.
- 4 पर एक कांच की बोतल में शेष टुकड़ा करने की क्रिया / भंडारण समाधान डिग्री सेल्सियस रखें
- Vibratome नमूना धारक पर एक छोटे से अगर ब्लॉक (6%, ACSF में तैयार) देते हैं और यह 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए एक cyanoacrylate चिपकने का प्रयोग करें
- 30 मिनट टुकड़ा करने की क्रिया शुरू करने से पहले, बर्फ और 95% 2 हे, 5% सीओ 2 के साथ बुलबुला इसके साथ भरी बाल्टी में टुकड़ा करने की क्रिया / भंडारण समाधान युक्त कांच की बोतल रखें.
2. Astrocyte पहचान और रिकॉर्डिंग 3. Pharmacनिरंतर + K-वर्तमान की ological अलगाव 4. मैंsynaptically सक्रिय ट्रांसपोर्टर धाराओं की सुविधा भाग (fSTCs) की solation 5. अवशिष्ट zdustained कश्मीर के घटाव fSTCs से + वर्तमान 6. फ्लैश सक्रिय ट्रांसपोर्टर धाराओं के अलगाव (FTCs) 7. Deconvolution विश्लेषण
नोट: उच्चतम गुणवत्ता वाले स्लाइस प्राप्त करने के लिए, यह मस्तिष्क के दो हिस्सों को मजबूती vibratome बेस प्लेट से चिपके हैं कि महत्वपूर्ण है. ऐसा करने के लिए, बहुत तरल और भी जल्दी बाहर सूखा नहीं है कि नहीं है कि एक cyanoacrylate चिपकने का उपयोग करें.
नोट: सब कुछ सही ढंग से उन्मुख है, तो vibratome मस्तिष्क के पार्श्व पक्ष की ओर उदर की ओर पृष्ठीय से और औसत दर्जे से parasagittal स्लाइस काट दिया जाना चाहिए.
नोट: Astrocytes आम तौर पर कम निवेश resistanc हैई (~ MΩ 10), hyperpolarized आराम झिल्ली क्षमता (~ -90 एम वी), और कोई फायरिंग गतिविधि. astrocytes वोल्टेज दबाना मोड (यानी पकड़े वर्तमान 0 पीए पढ़ना चाहिए) में प्रयोगों के दौरान अपने आराम झिल्ली क्षमता पर रखा जाता है. प्रत्येक उत्तेजना से पहले, वोल्टेज कदम (-3 एम वी) hyperpolarizing एक 10 एमएस अस्थिकणिका की श्रृंखला और इनपुट प्रतिरोध की निगरानी के लिए प्रयोग किया जाता है. 
नोट: TBOA असंवेदनशील घटक (यानी TBOA की उपस्थिति (50 में दर्ज की गई है कि एक - 100 माइक्रोन)) + वर्तमान निरंतर कश्मीर का प्रतिनिधित्व करता है. अपने समय के पाठ्यक्रम से ऊपर वर्णित मोनो घातीय समारोह द्वारा approximated है.
नोट: रिकॉर्डिंग परिस्थितियों में (यानी इंट्रासेल्युलर सीएच 3 एसओ 3 - या सी 6 एच 11 हे 7 -) यहाँ वर्णित है, उत्तेजक एक्सोन की synaptic stimulations के मौजूदा एक तेजी से बढ़ती क्षणिक आवक stoichiometric और एक धीमी गति से मिलकर जटिल waveforms के साथ astrocytic धाराओं उत्पन्न बढ़ती आवक कश्मीर निरंतर + वर्तमान + K फिर से संतुलन पड़ोसी एक्सोन साथ कार्रवाई संभावित प्रसार का पालन बाह्य अंतरिक्ष में दर्शाती है. यह किसी भी अवशिष्ट वर्तमान रूप में, + वर्तमान में इस निरंतर कश्मीर को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है एक के लिए नेतृत्व करेंगेग्लूटामेट जीवनकाल के overestimate.
नोट: 4.7-4.10 में वर्णित विश्लेषण नियंत्रण की स्थिति में और TBOA (10 माइक्रोन) में प्राप्त औसत निशान पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए कि याद है.
नोट: रिकॉर्डिंग की स्थिति में (यानी इंट्रासेल्युलर सीएच 3 एसओ 3 - या सी 6 एच 11 हे 7 -) यहाँ वर्णित, फ्लैश उत्तेजनाओं तेजी से बढ़ती क्षणिक stoichiometric आवक चालू ही शामिल astrocytic धाराओं उत्पन्न करते हैं.
नोट: 6.7 में वर्णित विश्लेषण नियंत्रण की स्थिति में और TBOA (10 माइक्रोन) में प्राप्त औसत निशान पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए. 
औरकि TBOA (10 माइक्रोन) (चित्रा 3b) में दर्ज की गई ट्रांसपोर्टर वर्तमान की खस्ताहाल चरण सबसे अच्छा वर्णन करता है.
नोट: 7.2 (यानी एच (टी)) में वर्णित समारोह TBOA (10 माइक्रोन) की उपस्थिति में astrocytes से ग्लूटामेट निकासी के समय के पाठ्यक्रम का प्रतिनिधित्व करता है.
नोट: deconvolution (जैसे मैटलैब, अजगर) जैसे कई विश्लेषण सॉफ्टवेयर पैकेज में शामिल एक गणितीय आपरेशन है. IgorPro में, हम आम तौर पर विश्लेषण के इस तरह का प्रदर्शन करने के लिए उपयोग प्रोग्रामिंग कोड, deconvolution संचालन कुशलतापूर्वक असतत तेजी से फूरियर रूपांतरण का उपयोग करके, नीचे वर्णित के रूप में गणना की जा सकती है. सबसे पहले, Di गणना करने के लिए FFT के आपरेशन का उपयोगscrete तेजी से फूरियर 7.2 में प्राप्त मोनो घातीय समारोह की और 7.1 में प्राप्त TBOA में दर्ज ट्रांसपोर्टर वर्तमान के फिट का बदलना. अगला, दो FFT कार्यों के अनुपात के प्रतिलोम असतत तेजी से फूरियर गणना करने IFFT आपरेशन का उपयोग करें. जिसके परिणामस्वरूप समारोह मैं (टी) के रूप में वर्णित किया जा सकता है: 
7.3 में वर्णित कदम TBOA (10 माइक्रोन) (चित्रा -3 सी दाएं) में मौजूदा ट्रांसपोर्टर के फिल्टर पाने की अनुमति देता है. 6 (यानी fSTC या FTC) - फिल्टर वर्गों 4 में अलग ट्रांसपोर्टर वर्तमान में astrocytic झिल्ली में ग्लूटामेट के जीवनकाल में परिवर्तित कि विरूपण कारकों का प्रतिनिधित्व करता है.
नोट: इस चरण नियंत्रण की स्थिति में astrocytes (चित्रा 3 डी दाएं) से ग्लूटामेट निकासी के समय के पाठ्यक्रम पाने की अनुमति देता है. इस deconvolution कदम अंतर्निहित धारणा फिल्टर के अस्थायी प्रोफ़ाइल नियंत्रण की स्थिति में और TBOA (10 माइक्रोन) में स्थिर बनी हुई है. 
जहां जी (टी) तरंग कदम 7.1 में प्राप्त की है. समीकरण से ऊपर वर्णित में, शब्द टी अभिन्न गणना की है जो समय के साथ खिड़की से मेल खाती है.
नोट: विधि पहले स्थापित किया गया था जब,<T> 13 स्वेच्छापूर्ण छोड़ दिया गया है कि समय खिड़कियों पर गणना की गई. एकीकरण खिड़की पूरी तरह से वापस आधारभूत ग्लूटामेट निकासी और निकासी तरंग क्षय की अवधि से अधिक व्यापक होना तय है, के रूप में यह दृष्टिकोण लंबे समय के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. यह मामला नहीं है, तथापि, <T> का आकलन करने के इस तरीके के कुछ सीमाओं का सामना करना पड़ता. निकासी तरंग आधारभूत बिल्कुल वापस क्षय नहीं होता है, तो उदाहरण के लिए, तो <T> एकीकरण विंडो की चौड़ाई के साथ बढ़ जाती है. <T> के आकलन के लिए अशुद्धि के किसी भी संभावित स्रोत से बचने के लिए, हम अब इसकी शुरुआत 14 से पहले और बाद में, वर्तमान ट्रांसपोर्टर की चोटी की 10% करने के लिए इसी समय खिड़की पर यह गणना. बाद दृष्टिकोण <T> कोशिकाओं में मापा जाता है, जिसके साथ स्थिरता में सुधार. निकासी के समय के पाठ्यक्रम पर औषधीय उपचार के छोटे प्रभावों का विश्लेषण करते समय यह विशेष रूप से काम में आता है.
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Representative Results
विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण की सफलता को गंभीर रूप से केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के किसी भी क्षेत्र में astrocytes से ट्रांसपोर्टर धाराओं के उच्च गुणवत्ता वाले electrophysiological रिकॉर्डिंग प्राप्त करने पर निर्भर करता है यहां का वर्णन किया. तीव्र माउस hippocampal स्लाइस में, astrocytes आसानी क्योंकि उनके छोटे सेल शरीर (ँ = 10 माइक्रोन) और प्रमुख नाभिक (चित्रा 1) के Dodt रोशनी या आईआर डीआईसी के तहत पहचाना जा सकता है. Intracellular समाधान, (चित्रा 1) एलेक्सा 594 (50 माइक्रोन) की तरह एक fluorophore जोड़ने जब उनकी विशिष्ट स्टार के आकार आकारिकी, कोंफोकल epifluorescence, या दो photon लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी के साथ की सराहना की जा सकती है. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी स्तर पर, astrocytes कम इनपुट प्रतिरोध, hyperpolarized झिल्ली क्षमता (~ -90 एम वी) और कार्रवाई क्षमता उत्पन्न करने की अक्षमता की विशेषता है. Astrocytes पड़ोसी न्यूरॉन्स की बिजली या optogenetic उत्तेजना और क्षमताओं की यूवी photolysis के जवाब में धाराओं उत्पन्नMNI एल ग्लूटामेट तरह GED यौगिकों.
Astrocytic ट्रांसपोर्टर धाराओं सी + या + K आधारित आंतरिक समाधान का उपयोग कर दर्ज किया जा सकता है. सी + +, एक लोकप्रिय कश्मीर + विकल्प, ग्लूटामेट परिवहन का समर्थन करता है लेकिन ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर साइकिल चालन दर 16,17 धीमा कर देती है कि नोट (क्योंकि ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टरों बाँध और / या सरकाना सी + + झिल्ली भर में और अधिक धीरे से कश्मीर +). सी + + में काफी बाध्यकारी ग्लूटामेट के लिए उपलब्ध ट्रांसपोर्टरों की संख्या कम कर देता है, तो यह भी कश्मीर + आधारित आंतरिक समाधान 16,17 के साथ दर्ज की गई लोगों की तुलना में छोटे / धीमी ट्रांसपोर्टर धाराओं की ओर जाता है.
या सी 6 एच 11 हे - 7 - मुख्य इंट्रासेल्युलर आयनों के रूप में, astrocytes में ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टरों द्वारा उत्पन्न वर्तमान, 1 ग्लूटामेट की stoichiometrically मिलकर आंदोलन की वजह से है 3 ना सीएच 3 तो 3 का उपयोग करते समय
ग्लूटामेट की synaptic रिहाई evoking जब astrocytes में दर्ज मौजूदा एक अधिक जटिल तरंग है. यह ऊपर वर्णित stoichiometrically मिलकर ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर वर्तमान के कारण एक तेजी से बढ़ रहे हैं, क्षणिक आवक घटक से बना है. इसके अलावा, यह कश्मीर की बाढ़ की वजह से एक धीमी गति से बढ़ रहे हैं, निरंतर आवक + K-वर्तमान + संभावित कार्रवाई के बाद बाह्य अंतरिक्ष में जमा हुए शामिलपड़ोसी axons के साथ प्रचार. एक औषधीय दृष्टिकोण निरंतर + K-वर्तमान से मौजूदा ट्रांसपोर्टर को अलग किया और प्रयोग 12 के अंत में व्यापक स्पेक्ट्रम ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर प्रतिपक्षी TBOA (100 माइक्रोन) की उच्च सांद्रता के उपयोग की आवश्यकता हो सकती है. यहाँ वर्णित विधि + वर्तमान और इसलिए कम प्रयोगों (चित्रा 2) के लिए अनुमति देता है निरंतर कश्मीर से वर्तमान ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर अलग करने के लिए एक विशुद्ध विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण का उपयोग करता है.
20 सेकंड, और एकल और बनती पल्स उत्तेजनाओं के साथ प्राप्त स्वीप की औसत संख्या बराबर - पहले कदम के रूप में, हम एकल और बनती पल्स अन्तर्ग्रथनी stimulations (अलावा 100 मिसे), हर 10 बिछा. बनती उत्तेजनाओं के द्वारा पैदा की पहली वर्तमान के आयाम भी उत्तेजना के द्वारा पैदा की वर्तमान के आयाम से मेल खाना चाहिए. हम द्वारा पैदा की है कि से एक उत्तेजना के द्वारा पैदा की मौजूदा घटाकर इस विश्लेषण शुरूबनती उत्तेजनाओं. इस घटाव भी मौजूदा एक तेजी से बढ़ रहे हैं, क्षणिक ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर और एक धीमी गति से बढ़ रहे हैं, निरंतर + K-वर्तमान (चित्रा 2a दाएं). से बना है, जो दूसरे प्रोत्साहन के जवाब अलग करने की अनुमति देता है अगला, हम भी जवाबी कार्रवाई की शुरुआत के समय से ऊपर पृथक दूसरी प्रतिक्रिया की शुरुआत के समय से मेल खाता है, ताकि बनती उत्तेजनाओं की अंतर - नाड़ी अंतराल को इसी समय अंतराल से ही प्रोत्साहन की प्रतिक्रिया पारी (चित्रा 2b ). इन दो धाराओं घटाकर करके, हम fSTC (चित्रा 2c) कॉल यहां जो ट्रांसपोर्टर वर्तमान, की मदद की हिस्से को अलग. fSTC के कैनेटीक्स ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर प्रतिपक्षी TBOA (100 माइक्रोन) 13 की उच्च सांद्रता के साथ औषधीय पृथक वर्तमान synaptically सक्रिय ट्रांसपोर्टर (STCs) के कैनेटीक्स के समान हैं. इस कारण से और सादगी के लिए, पिछले काम में, हम fSTC में भेजाएसटीसी 13,14 के रूप में. इसी तरह की संपत्ति के साथ धाराओं होने के बावजूद, fSTCs और STCs ही चालू नहीं कर रहे हैं. इस कारण से और सटीकता के लिए, इस काम में, हम fSTCs और STCs के रूप में उन्हें स्पष्ट रूप से करने के लिए संदर्भित करेंगे. यहाँ वर्णित घटाव विधि सबसे रिकॉर्डिंग में fSTCs की सटीक अलगाव के लिए अनुमति देता है. हालांकि, कुछ मामलों में, एक अवशिष्ट निरंतर + K-वर्तमान अभी भी मौजूद है. इस मामले में, यह TBOA की उच्च सांद्रता (- 100 माइक्रोन 50) का उपयोग कर अलग प्रयोगों में + वर्तमान निरंतर कश्मीर को अलग करने के लिए आवश्यक है. औषधीय पृथक निरंतर + K-वर्तमान के समय के पाठ्यक्रम के रूप में एक मोनो घातीय समारोह द्वारा वर्णित किया जा सकता है:
विभिन्न कक्षों में astrocytic धाराओं रिकॉर्डिंग करके, हम Τ वृद्धि की औसत मूल्य का अनुमान है. हम अगले creatएक तरह ईए मोनो घातीय समारोह Τ वृद्धि विभिन्न astrocytes में प्रयोगात्मक मापा Τ वृद्धि के औसत मूल्य से मेल खाती है और एक हम निकालना चाहते + वर्तमान कि अवशिष्ट निरंतर कश्मीर के आयाम (चित्रा 2 से मेल खाती है, जिसमें उपरोक्त वर्णित ).
synapses को सुविधाजनक बनाने से ग्लूटामेट रिहाई evoking और भी बनती पल्स अवसाद से गुजरना है कि synapses से ग्लूटामेट रिहाई का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जब हम सिर्फ fSTCs अलग करने के लिए वर्णित विधि अच्छी तरह से काम करता है. अध्ययन के तहत glutamatergic synapses अल्पकालिक सरलीकरण या अवसाद के किसी भी स्पष्ट फार्म नहीं दिखा है जब बहरहाल, यह थोड़ा काम का नहीं है. इस मामले में, TBOA की उच्च सांद्रता (100 माइक्रोन) के साथ ट्रांसपोर्टर धाराओं के औषधीय अलगाव stoichiometrically मिलकर, synaptically पैदा ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर वर्तमान अलग करने के लिए सबसे व्यावहारिक समाधान बनी हुई है.
अर्थात्). यहाँ लक्ष्य रिकॉर्डिंग के शोर से यह भेद करने की क्षमता खोने के बिना मौजूदा ट्रांसपोर्टर की काफी समय पाठ्यक्रम को धीमा करने के लिए है. अंतर्निहित धारणा astrocytes की तेज क्षमता कम हो जाती है जब TBOA, के एक छोटे से एकाग्रता की उपस्थिति में, ट्रांसपोर्टर वर्तमान के क्षय को आकार देने के मुख्य कारक astrocytic झिल्ली 12,18 में ग्लूटामेट एकाग्रता की क्रमिक गिरावट है. हम बहु घातीय समारोह के साथ (10 माइक्रोन) नियंत्रण की स्थिति में और TBOA में ट्रांसपोर्टर वर्तमान फिट:
(चित्र 3a). हम लगभग मोनो घातीय क्षय (चित्रा 3b) और हम TBOA (10 माइक्रोन, चित्रा -3 सी) में मौजूदा ट्रांसपोर्टर का वर्णन बहु घातीय समारोह से यह deconvolve साथ एक तत्क्षण बढ़ती समारोह के साथ TBOA (10 माइक्रोन) में ग्लूटामेट मंजूरी. परिणामस्वरूप तरंग "फिल्टर" है, और कारकों के संयोजन का प्रतिनिधित्व करता है कि बिगाड़ना (यानी फिल्टर) वर्तमान ट्रांसपोर्टर (चित्रा -3 सी) में ग्लूटामेट एकाग्रता प्रोफ़ाइल. नियंत्रण की स्थिति में वर्तमान ट्रांसपोर्टर की बहु घातीय फिट से फिल्टर Deconvolving नियंत्रण की स्थिति में दर्ज अस्थिकणिका (चित्रा 3 डी) में ग्लूटामेट एकाग्रता प्रोफ़ाइल के समय के पाठ्यक्रम का आकलन करने की अनुमति देता है. इस deconvolution विश्लेषण के लिए, हम मान लें कि कैनेटीक्सके फिल्टर अभाव में और TBOA (10 माइक्रोन) की उपस्थिति में अनछुए बने हुए हैं. (यानी ट्रांसपोर्टर कैनेटीक्स, इलेक्ट्रोटोनिक फ़िल्टरिंग, और synaptic stimulations के दौरान, synapses भर में ग्लूटामेट की अतुल्यकालिक विज्ञप्ति) फिल्टर में योगदान देने वाले सभी कारकों TBOA की उपस्थिति संख्या कम कर देता है कि एक परिसर से प्रभावित होने की संभावना नहीं है क्योंकि यह एक उचित धारणा है बाध्यकारी ग्लूटामेट के लिए उपलब्ध ट्रांसपोर्टरों की. हम विभिन्न कक्षों में astrocytic झिल्ली में ग्लूटामेट जीवन भर के एक उपाय के रूप में केन्द्रक (<T>) का उपयोग करें. <T> निकासी तरंग का "द्रव्यमान का केंद्र" का प्रतिनिधित्व करता है, और की वृद्धि समय और क्षय दोनों में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील है ग्लूटामेट निकासी तरंग. केन्द्रक के रूप में व्यक्त किया जाता है:
ई 1 "के लिए: सामग्री चौड़ाई =" 3in "के लिए: src =" / "src =" / files/ftp_upload/50708/50708fig1.jpg "/ files/ftp_upload/50708/50708fig1highres.jpg>
चित्रा 1. तीव्र hippocampal स्लाइस में astrocytes की पहचान. (अब) सीए 1 परत radiatum में हिप्पोकैम्पस astrocytes के Dodt छवियों. Dodt रोशनी और आईआर डीआईसी के तहत, astrocytes उनके छोटे सेल शरीर और प्रमुख नाभिक से पहचाना जा सकता है. लाल तीर स्लाइस तैयारी में पहचाना जा सकता है कि कई astrocytes के लिए बिंदु. पीले तीर (देखें नीचे) एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ समझौता और भर गया था कि अस्थिकणिका से पता चलता है. Hippocampal स्लाइस और में एक पीले तीर (अब) के साथ प्रकाश डाला समझौता astrocytes के दो फोटोन की (सीडी) मढ़ा Dodt छवि. एलेक्सा 594 (50 माइक्रोन) के साथ जोड़ा आधारित आंतरिक समाधान - इस प्रयोग के लिए, astrocytes एक KCH 3 एसओ 3 के साथ समझौता और भर गया. astrocytic प्रक्रियाओं दूर टी से माइक्रोन की कुछ दसियों का विस्तारवह सेल शरीर. बाएं का एनोटेशन स्लाइस में पहचाना जा सकता है कि हिप्पोकैम्पस सीए 1 के गठन के तीन मुख्य सेलुलर परतों की पहचान.
चित्रा 2. Astrocytes में दर्ज synaptically सक्रिय ट्रांसपोर्टर धाराओं से fSTCs का अलगाव. Astrocytes में दर्ज synaptically सक्रिय ट्रांसपोर्टर धाराओं से fSTCs को अलग करने के लिए आवश्यक विश्लेषणात्मक कदम की (एसी) योजना. (घ) (अनुभाग 5 देखें) fSTCs से + वर्तमान अवशिष्ट निरंतर कश्मीर को दूर करने के लिए इस्तेमाल किया विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
ईएनटी चौड़ाई = "6.5in" के लिए: src = src = "/ files/ftp_upload/50708/50708fig3.jpg" / "/ files/ftp_upload/50708/50708fig3highres.jpg">
चित्रा 3. करने के लिए इस्तेमाल deconvolution विश्लेषण astrocytes से ग्लूटामेट निकासी के समय पाठ्यक्रम प्राप्त नियंत्रण शर्तों (बाएं) और TBOA की उपस्थिति (10 माइक्रोन, दाएं) में अलग fSTC / FTC के (एक) मोनो घातीय फिट.. (ख) TBOA में ग्लूटामेट निकासी (10 माइक्रोन) के समय पाठ्यक्रम मोनो घातीय क्षय के साथ एक तत्काल बढ़ती समारोह द्वारा approximated है. (ग) TBOA में मौजूदा ट्रांसपोर्टर की बहु घातीय फिट (10 माइक्रोन) से TBOA में ग्लूटामेट निकासी (10 माइक्रोन) के समय पाठ्यक्रम Deconvolving फिल्टर का आकलन करने की अनुमति देता है. (घ) नियंत्रण की स्थिति में वर्तमान ट्रांसपोर्टर की बहु घातीय फिट से फिल्टर Deconvolving नियंत्रण की स्थिति में astrocytes से ग्लूटामेट निकासी के समय के पाठ्यक्रम का आकलन करने की अनुमति देता है.files/ftp_upload/50708/50708fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
यहाँ हम astrocytes से electrophysiological रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए एक प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का वर्णन, astrocytes में ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर धाराओं को अलग करने के लिए एक विश्लेषणात्मक प्रोटोकॉल और करने के लिए एक गणितीय विधि astrocytic ट्रांसपोर्टर धाराओं से ग्लूटामेट निकासी के समय पाठ्यक्रम निकाले जाते हैं.
विश्लेषण की सफलता astrocytes से उच्च गुणवत्ता वाले पैच दबाना रिकॉर्डिंग प्राप्त करने की क्षमता पर और ट्रांसपोर्टर धाराओं का वर्णन किया ढाले एल्गोरिदम की सटीकता पर निर्भर करता है. deconvolution विश्लेषण निम्नलिखित दो मान्यताओं पर निर्भर करता है. (1) प्रयोगात्मक दर्ज ट्रांसपोर्टर वर्तमान में ग्लूटामेट निकासी के समय पाठ्यक्रम बिगाड़ना कि कई प्रक्रियाओं एक रेखीय प्रणाली के रूप में प्रतिनिधित्व किया जा सकता है. पूर्ण रूप में यद्यपि आकार ट्रांसपोर्टर धाराओं अरैखिक प्रणाली (सिद्धांत ग्लूटामेट बाध्यकारी और परिवहन में दोनों संतृप्ति गुजरना कर सकते हैं), प्रयोगात्मक सबूत इंडिका हैं कि कारकों में से कईउनके रैखिक शासन व्यापक है कि tes है. तदनुसार, ट्रांसपोर्टर धाराओं के और ग्लूटामेट निकासी के समय के पाठ्यक्रम प्रेरणा शक्ति, रिलीज की संभावना है, और ग्लूटामेट सांद्रता 13,14,18 की एक विस्तृत रेंज पर ही रहता है. इस सन्निकटन हमारे प्रयोगात्मक शर्तों के लिए वैध हो रहा है, यह अलग प्रयोगात्मक तैयारी में इस विश्लेषण दोहराए जाने से पहले मान्य किया जाना चाहिए. (2) फिल्टर की विशेषताओं TBOA (10 माइक्रोन) की उपस्थिति से अप्रभावित रहे हैं. (यानी ट्रांसपोर्टर कैनेटीक्स, इलेक्ट्रोटोनिक फ़िल्टरिंग, और synaptic stimulations के दौरान, synapses भर में ग्लूटामेट की अतुल्यकालिक विज्ञप्ति) फिल्टर में योगदान देने वाले सभी कारकों TBOA की उपस्थिति से प्रभावित होने की संभावना नहीं है क्योंकि यह धारणा उचित लगता है.
FSTCs और FTCs से ग्लूटामेट निकासी तरंग पाने से, हम सूचना के दो विभिन्न प्रकार प्राप्त करते हैं. FSTCs का विश्लेषण करके, हम समय को मापने कि astrocyटिक झिल्ली synapses से रिहा ग्लूटामेट को उजागर कर रहे हैं. पूरा क्षेत्र पराबैंगनी रोशनी के साथ FTCs evoking तक (पूरी astrocytic सतह पर ग्लूटामेट uncaging द्वारा अर्थात्), हम astrocytic झिल्ली Uncaged ग्लूटामेट को उजागर कर रहे हैं कि समय को मापने. इन uncaging प्रयोगों में सभी ग्लूटामेट अणु एक ही समय में (यानी Uncaged) जारी कर रहे हैं और सभी ट्रांसपोर्टरों ही ग्लूटामेट एकाग्रता से, एक ही समय में सक्रिय हैं. इसलिए, FTCs विश्लेषण करके, हम astrocytic ग्लूटामेट तेज क्षमता का एक अप्रत्यक्ष readout के प्राप्त कर सकते हैं.
यह तरीकों ग्लूटामेट निकासी, नहीं ट्रांसपोर्टर धाराओं evoking ग्लूटामेट एकाग्रता के वास्तविक मूल्य के समय के पाठ्यक्रम का आकलन करने की अनुमति यहाँ वर्णित है कि यह नोट करना महत्वपूर्ण है. अनुमानित समय बेशक जो हम electrophysiological उपयोग किया है astrocytic झिल्ली के सभी क्षेत्रों में ग्लूटामेट निकासी के समय के पाठ्यक्रम के एक औसत उपाय है: यह है कोईastrocytic झिल्ली 19 भीतर विभिन्न स्थलों पर ग्लूटामेट तेज में विषमताओं के प्रति संवेदनशील टी. यह जानकारी ग्लूटामेट के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट संवाददाताओं 20 के उच्च संकल्प माइक्रोस्कोपी के साथ प्राप्त होने की संभावना है. हालांकि, वर्तमान में उपलब्ध ग्लूटामेट के प्रति संवेदनशील पत्रकारों अपेक्षाकृत संकीर्ण गतिशील पर्वतमाला दिखा रहे हैं. यह क्षणिक ग्लूटामेट एकाग्रता पर अस्थायी जानकारी निकालने के लिए इन जांच के उपयोग को सीमित करने, ग्लूटामेट एकाग्रता प्रोफाइल और फ्लोरोसेंट संकेत के बीच गैर रेखीय विकृतियों को पेश कर सकते हैं. इसलिए, यह एक astrocytic झिल्ली पर glutamatergic संकेतों की गतिशीलता का सबसे व्यापक समझ प्राप्त कर सकते हैं कि इन सभी अलग अलग दृष्टिकोण के संयोजन से शायद है.
संक्षेप में, यहाँ प्रस्तुत तरीकों astrocytic झिल्ली पर synaptically में जारी या फ्लैश Uncaged ग्लूटामेट की निकासी के समय पाठ्यक्रम का अनुमान किया जा सकता है. वे कीमती उपकरण प्रदान कि सीएएन शारीरिक और रोग की स्थिति 21 के तहत पशु प्रजातियों के 14 और मस्तिष्क क्षेत्रों की एक किस्म में विकास 13 के विभिन्न चरणों में बाह्य अंतरिक्ष में ग्लूटामेट के जीवनकाल का अनुमान किया जा.
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Disclosures
लेखक ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा.
Acknowledgments
इस काम मस्तिष्क संबंधी विकार और स्ट्रोक के अंदर का रिसर्च प्रोग्राम (NS002986) के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था. के रूप में पांडुलिपि लिखा था और deconvolution विश्लेषण लागू किया है. JSD deconvolution विश्लेषण के प्रारंभिक संस्करण विकसित और पाठ पर टिप्पणी की.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CGP52432 | Tocris | 1246 | |
| (R,S)-CPP | Tocris | 173 | |
| DPCPX | Tocris | 439 | |
| LY341495 disodium salt | Tocris | 4062 | |
| MSOP | Tocris | 803 | |
| NBQX disodium salt | Tocris | 1044 | |
| D,L-TBOA | Tocis | 1223 | |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | |
| MNI-L-glutamate | Tocris | 1490 | |
| Alexa 594 | Life Technologies | A10438 | Optional |
| Matrix electrodes | Frederick Haer Company | MX21AES(JD3) | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | PG10165-4 | |
| Dual-stage glass micro-pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| Loctite 404 instant adhesive | Ted Pella | 46551 | |
| Xe lamp | Rapp OptoElectronic | FlashMic | |
| Igor Pro 6 | Wavemetrics |
References
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