Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

اشتقاق مدار الساعة من تخليص الغلوتامات مع تحليل Deconvolution من التيارات الناقل نجمي

Published: August 7, 2013 doi: 10.3791/50708
Automatic Translation
1, 1
1Synaptic Physiology Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

Summary

نحن تصف طريقة تحليلية لتقدير عمر الغلوتامات في الأغشية نجمي من التسجيلات الكهربية من التيارات نقل الغلوتامات في الخلايا النجمية.

Abstract

وتوجد أعلى كثافة من نقل الغلوتامات في الدماغ في الخلايا النجمية. الغلوتامات زوجين نقل الحركة من الغلوتامات عبر الغشاء مع الرئيسين نقل 3 نا + و 1 H + ومكافحة نقل 1 K +. يمكن رصد التيار القياس المتكافئ التي تم إنشاؤها بواسطة عملية النقل مع خلية كاملة التسجيلات التصحيح، المشبك من الخلايا النجمية. يتشكل مدار الساعة من الحالية التي سجلتها مدار الساعة من الملف الشخصي الغلوتامات تركيز التي تتعرض لها الخلايا النجمية، حركية نقل الغلوتامات، وخصائص تيار كهربي السلبي للأغشية نجمي. نحن هنا وصف الطرق التجريبية والتحليلية التي يمكن استخدامها لتسجيل التيارات نقل الغلوتامات في الخلايا النجمية وعزل بالطبع وقت التخليص الغلوتامات من جميع العوامل الأخرى التي تشكل الموجي من التيارات نقل نجمي. الأساليب المذكورة هنا يمكن أن تستخدم لتقدير مدى الحياة سو فلاش uncaged وsynaptically صدر الغلوتامات في الأغشية نجمي في أي منطقة من الجهاز العصبي المركزي أثناء الصحة والمرض.

Introduction

الخلايا النجمية هي واحدة من أنواع الخلايا الأكثر وفرة في الدماغ مع على شكل نجمة التشكل ونتوءات غشاء غرامة التي تمتد في جميع أنحاء neuropil وتصل المجاورة اتصالات متشابك 1،2. هي معبأة غشاء الخلية في الخلايا النجمية "مكتظة مع جزيئات نقل الغلوتامات 3. في ظل الظروف الفسيولوجية، نقل الغلوتامات ربط بسرعة الغلوتامات في الجانب خارج الخلية من غشاء وتحويلها إلى السيتوبلازم الخلية. من خلال القيام بذلك، ونقل حفاظ على انخفاض تركيز القاعدية من الغلوتامات في الفضاء خارج الخلية 4. يتم وضع نقل الغلوتامات في عمليات نجمي غرامة المتاخمة لاستثاري نقاط الاشتباك العصبي في مكان مثالي لربط الغلوتامات صدر خلال الأحداث متشابك كما ينشر بعيدا عن المشقوق متشابك. من خلال القيام بذلك، ونقل أيضا إلى الحد من انتشار الغلوتامات نحو شبه والمناطق خارج متشابك وعلى نقاط الاشتباك العصبي المجاورة، والحد من انتشار المكاني للإشارة مثيرق في الدماغ 5-7.

النقل الغلوتامات هو عملية كهربي بالإضافة إلى stoichiometrically حركة نا 3 + H + 1 وعلى طول بهم الكهروكيميائية والتدرج في مكافحة النقل من 1 K + 8. ويرتبط النقل الغلوتامات مع (ولكن ليس إلى جانب stoichiometrically ل) وهو تصرف أنيوني نفاذا إلى SCN - (ثيوسيانات)> NO 3 - (نترات) ≈ ويتوافق 4 - (بيركلورات)> I -> BR -> الكلورين -> F -، وليس لCH 3 SO 3 - (الميثان سلفونات) وC 6 H 11 O 7 - (غلوكونات) 9-11. كلا التيارين (القياس المتكافئ وغير متكافئة) يمكن تسجيلها من خلال الحصول على كامل الخلية التسجيلات التصحيح، المشبك من الخلايا النجمية، حدد بصريا تحت Dodt الإضاءة أو الأشعة تحت الحمراء الفرق المقابل تدخل (IR-DIC) في acutه شرائح الدماغ 12. المكون متكافئة من التيار المرتبطة بالنقل الغلوتامات عبر الغشاء يمكن أن تكون معزولة باستخدام CH 3 SO 3 -، أو C 6 H 11 O 7 - الحلول المستندة إلى داخل الخلايا ويمكن حركها الغلوتامات فلاش uncaging على الخلايا النجمية 13،14، أو من خلال تفعيل الافراج الغلوتامات من نقاط الاشتباك العصبي المجاورة، إما كهربائيا أو 12 مع جهاز تحكم optogenetic المستهدفة.

يتشكل مدار الساعة من المكون متكافئة من التيار نقل بواسطة عمر الملف الشخصى تركيز الغلوتامات في الأغشية نجمي (أي إزالة الغلوتامات)، حركية نقل الغلوتامات، خصائص الغشاء السلبي من الخلايا النجمية، وخلال التحفيز متشابك، من قبل التزامن من الافراج الغلوتامات عبر نقاط الاشتباك العصبي المنشط 13. نحن هنا وصف بالتفصيل الكامل: (1) على APPR التجريبيةoach لعزل العنصر متكافئة من التيارات نقل الغلوتامات من خلية كاملة التسجيلات التصحيح، المشبك من الخلايا النجمية باستخدام الماوس شرائح الحصين الحادة بمثابة إعداد التجريبية سبيل المثال، (2) نهجا تحليليا لاستخلاص بالطبع وقت التخليص الغلوتامات من هذه التسجيلات 13، 14. هذه الطرق يمكن استخدامها لتسجيل وتحليل التيارات نقل الغلوتامات من الخلايا النجمية في أي منطقة من الجهاز العصبي المركزي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد شريحة

  1. إعداد 500 مل تشريح الحل / التخزين التي تحتوي على (مم): 119 كلوريد الصوديوم، و 2.5 بوكل، 0.5 و CaCl 2، 1.3 MgSO 4 · 7H 2 O، 4 MgCl 2، 26.2 NaHCO 3، 1 ناه ​​2 ص 4، و 22 الجلوكوز، 320 الميلي أسمول، ودرجة الحموضة 7.4
  2. استخدام كوب 250 مل لإعداد غرفة الانغمار لشرائح، وملء مع تشريح الحل / تخزين 200 مل، الحارة في حمام الماء عند 34 درجة مئوية، وفقاعة مع 95٪ O 2، 5٪ CO 2.
  3. الحفاظ على ما تبقى من تشريح الحل / التخزين في زجاجة في 4 درجات مئوية.
  4. استخدام مادة لاصقة فورية الغراء لإرفاق كتلة آغار الصغيرة (6٪، أعدت في ACSF) على صاحب العينة vibratome وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  5. 30 دقيقة قبل البدء في تشريح، ووضع زجاجة تحتوي على تشريح حل / التخزين في دلو مملوء كريم وفقاعة مع 95٪ O 2، 5٪ CO 2.

  1. تخدير الماوس (P14-21، C57BL / 6) مع هالوثان / isoflurane و(تم isoflurane وذكرت لتعزيز نجمي امتصاص الغلوتامات 15)، قطع رأس ذلك، وتراجع رأسه في كوب مل تحتوي على 50 الاوكسيجين والبرد تشريح الحل / التخزين.
  2. إجراء تشريح الدماغ على وضع كيس من الثلج ملفوفة مع المناشف الورقية وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  3. استخدام مشرط لجعل شق الجلد منتصف السهمي على الجانب الظهري للرأس، من أمامي حتى نهاية الذيلية، وفضح الجمجمة.
  4. ضع شفرة القص أقل من زوج من مقص صغير الجراحية في حفرة القذالي وجعل اثنين من التخفيضات، ونحو اليسار وعلى الجانب الأيمن (زاوية 45 درجة).
  5. قطع الجمجمة على طول خط منتصف السهمي، من الذيلية إلى نهاية الجبهي.
  6. إزالة الدماغ مع ملعقة وتراجع في الاوكسيجين والبرد تشريح / التخزين solutiعلى.
  7. مع مشرط، وجعل خمسة التخفيضات إلى: (1) إزالة بصيلات الشم واللحاء الجبهي، (2) إزالة المخيخ، (3) إزالة الأيسر و(4) الفص الصدغي الأيمن. (5) تفصل بين نصفي الدماغ مع خفض منتصف السهمي.
  8. الداب شطري الدماغ مع المناشف الورقية لإزالة أي حل الزائدة.
  9. الغراء السطح الجانبي من كل قسم الدماغ إلى لوحة vibratome قاعدة الباردة: الجانب الظهري من المخ ينبغي أن تواجه شفرة vibratome، ويتعين على الجانب البطني من الدماغ تكون على اتصال مع كتلة آغار، بعيدا عن شفرة vibratome.
    ملاحظة: للحصول على شرائح عالية الجودة، فمن المهم أن شطري الدماغ يتم لصقها بإحكام على قاعدة لوحة vibratome. للقيام بذلك، استخدم مادة لاصقة فورية الغراء التي ليست سائلة جدا والتي لا تجف بسرعة كبيرة جدا.
  10. تأمين قاعدة لوحة vibratome إلى غرفة تشريح، تعيين ال شريحةickness عشر إلى 250 ميكرومتر وضبط العرض من المدى شفرة. المضي قدما في تشريح.
    ملاحظة: إذا تم كل شيء بشكل صحيح كيفت، وvibratome يجب قطع شرائح مجاور للسهمي من ظهري نحو بطني وسطي من نحو الجانب الوحشي للدماغ.
  11. مرة واحدة وقد مرت النصل من خلال القشرة والحصين، واستخدام مشرط لقطع اللحاء / الحصين من المخ الأوسط ووضع كل شريحة في غرفة الانغمار في 34 ° C.
  12. تجاهل أول زوجين من شرائح. عادة، 12 شريحة (250 ميكرون سميكة) ويمكن الحصول عليها من الدماغ P14-21 الماوس.
  13. الحفاظ على شرائح في 34 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، والسماح لهم يبرد إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة قبل استخدامها للتسجيلات الكهربية.

2. تحديد نجمية وتسجيلات

  1. إعداد الحل الداخلي التي تحتوي على (مم): 120 KCH 3 SO 3، 10 EGTA، 20 HEPES، 2 MgATP، 0.2 NaGTP،5 QX-314Br، و 5 كلوريد الصوديوم، 290 الميلي أسمول، ودرجة الحموضة 7.2.
  2. يعد حل خارج الخلية التي تحتوي على تسجيل (مم): 119 كلوريد الصوديوم، و 2.5 بوكل، 2.5 و CaCl 2، 1.3 MgSO 4 · 7H 2 O، 1 MgCl 2، 26.2 NaHCO 3، 1 NaHPO 4، و 22 الجلوكوز، 300 الميلي أسمول، ودرجة الحموضة 7.4 ، مشبعة 95٪ O 2، 5٪ CO 2.
  3. إضافة الأدوية التالية إلى الحل تسجيل خارج الخلية، لمنع تفعيل GluA، GluN، mGluRII، mGluRIII، GABA A، B GABA، ومستقبلات الأدينوزين A1 (في ميكرومتر): 10 2،3-Dioxo-6-نيترو-1، 2،3،4-tetrahydrobenzo [ƒ] quinoxaline-7-السلفوناميد الصوديوم الملح (NBQX)، 10 (RS) -3 - (2-carboxypiperazin-4-YL)-بروبيل-1-الفوسفونيك حامض (CPP)، (2S )-2-الأمينية-2-[(1S، 2S)-2-carboxycycloprop-1-YL] -3 - (xanth-9-YL) propanoic حامض الصوديوم الملح (LY341495)، و 100 (R، S)-α- methylserine-O-الفوسفات (MSOP)، و 100 بيكروتوكسين، 5 3 - [[(3،4-Dichlorophenyl) الميثيل] الأمينية] ن] diethoxymethyl) حمض phosphinic (CGP52432)، 18 cyclopentyl-1 ،3-dipropylxanthine (DPCPX).
  4. ضبط درجة الحرارة من الحل خارج الخلية في غرفة تسجيل؛ درجات الحرارة النموذجية هي ما بين 34-36 درجة مئوية.
  5. إعداد أقطاب التصحيح، المشبك من البورسليكات الزجاج الشعيرات الدموية (R ≈ 2.5 MΩ) باستخدام ثنائي المرحلة، والزجاج الصغيرة ماصة مجتذب.
  6. تأخذ واحدة من شرائح ووضعه في غرفة تسجيل. عقد عليه مع القيثارة المعدن المصنوع من سلك البلاتين وخيوط النايلون.
  7. تفقد البصر شرائح تحت Dodt إضاءة أو IR-DIC. يمكن التعرف على الخلايا النجمية التي كتبها أجسامهم زنزانة صغيرة (O = 10 ميكرون) ونواة بارزة (الشكل 1).
  8. لالتحفيز متشابك، ووضع ثنائي القطب غير القابل للصدأ الصلب الكهربائي، ~ 100 ميكرومتر بعيدا عن نجمية التي تخطط لرأب الصدع.
  9. تصحيح نجمية وكسر في تكوين خلية كاملة من خلال تطبيق الشفط لطيف جدا.
    ملاحظة: النجمية وعادة ما يكون منخفض مقاومه مدخلاته (~ 10 MΩ)، hyperpolarized غشاء المحتملة يستريح (~ -90 بالسيارات)، وأي نشاط اطلاق النار. يتم الاحتفاظ الخلايا النجمية في إمكاناتها غشاء يستريح طوال التجارب في وضع الجهد المشبك (أي الحالية عقد يجب قراءة 0 باسكال). قبل كل التحفيز، يتم استخدام 10 مللي hyperpolarizing خطوة الجهد (فولت -3) لرصد سلسلة والمقاومة مدخلات نجمية.
  10. تجاهل التسجيلات إذا كانت التغييرات سلسلة المقاومة> 20٪ أو إذا كان غشاء المحتملة من نجمية يصبح استقطابها. غشاء المحتملة من نجمية يمكن قياسها مباشرة عن طريق التحول من الجهد المشبك إلى الوضع الحالي، المشبك. بدلا من ذلك، أثناء وجوده في وضع الجهد المشبك، وإمكانات غشاء يمكن رصدها من خلال قراءة قيمة احتمال عقد ينتج عنه 0 باسكال عقد الحالي.
  11. إذا كنت تعمل التحفيز متشابك، المحفزات بديل واحد وإقران (على سبيل المثال 100 ميللي ثانية بعيدا)، كل 10-20 ثانية.
  12. للأشعة فوق البنفسجية experim التحلل الضوئيالوالدان، توصيل مصباح اكس uncaging إلى ميناء epifluorescence من المجهر وإضافة مركب قفص إلى حل خارج الخلية. التيارات نقل من ~ 100 باسكال سعة يمكن الحصول عليها عندما فلاش uncaging 100 ميكرومتر MNI-L-الغلوتامات في المجال الكامل للعرض (O = 662.5 ميكرومتر عند استخدام هدفا 40X 14). التحفيز تتناوب مع مسار الضوء المفتوحة والمحظورة، كل 10-20 ثانية.
  13. استحضار العابرين الغلوتامات والتيارات نقل سجل في ظروف الرقابة وفي وجود تركيز تشبع الفرعية للواسعة الطيف الغلوتامات نقل خصم D، L-threo-β-Benzyloxyaspartic حمض (TBOA، و 10 ميكرومتر) للحد من السعة الحالية نقل إلى 30٪ على الأقل من قيمة سيطرتها (انظر القسمين 4 و 5) أو في وجود تركيز عال من TBOA (50-100 ميكرون) لمنع التيارات نقل تماما وعزل K +-مستمرة الحالية (انظر القسم 3) .

3. Pharmacعزل ological من K +-المطرد الحالي

  1. تسجيل التيارات نجمي في ظروف السيطرة وبحضور عالية، وتركيز تشبع من TBOA (50-100 ميكرون).
  2. متوسط ​​لا يقل عن 20 الاحتلالات في TBOA (50-100 ميكرون).
  3. تناسب آثار بلغ متوسط ​​حصلت في 3.2 مع وظيفة:
    المعادلة 1
    ملاحظة: المكون TBOA الأحرف (أي واحد التي يتم تسجيلها في وجود TBOA (50-100 ميكرون)) يمثل K +-المستدام الحالية. ويقترب بالطبع وقتها بواسطة الدالة أحادية الأسي هو موضح أعلاه.
  4. كرر هذا مناسبا عبر الخلايا النجمية المختلفة واستخلاص قيمة متوسط ​​ارتفاع Τ (أي متوسط ​​زمن صعود مستمر + K-الحالية (انظر القسم 5)).

4. أناتحلول من الجزء الميسر من التيارات الناقل Synaptically المنشط (fSTCs)

  1. متوسط ​​لا يقل عن 20 الاحتلالات التي تم الحصول عليها مع التحفيز المقترنة، في ظروف السيطرة وفي TBOA (10 ميكرومتر) (الشكل 2A اليسار).
  2. متوسط ​​عدد مماثل من الاحتلالات التي تم الحصول عليها مع التحفيز واحد، في ظروف السيطرة وفي TBOA (10 ميكرومتر) (الشكل 2A الأوسط).
  3. مقارنة السعة من متوسط ​​الاستجابة الحالية إلى الجهد بالسيارات -3 خطوة في أربعة آثار بلغ متوسط ​​(مراقبة نبض واحد، ومراقبة المقترنة-البقول، TBOA نبض واحد، TBOA تقرن-البقول).
  4. إذا كان مدى الاستجابة الحالي هو نفسه في كل آثار أربعة، انتقل إلى الخطوة 4.7.
  5. إذا اتساع متوسط ​​الاستجابة الحالية يختلف في أي من آثار أربعة، والتحقق من أن كل آثار الفردية كانت مناسبة لإدراجها في المتوسط.
  6. إذا كانت السعة من المتوسط ​​الحالي يختلف في أي من آثار أربعة، ولكن كل فيآثار dividual مناسبة لإدراجها في المتوسط، تحقق من أن تتبع في كل من حجم موازين fSTC خطيا مع حجم الاستجابة الحالية إلى الجهد خطوة الاختبار. إذا كان هذا هو الحال، توسيع نطاق كل آثار مع الاحترام لبعضهما البعض بحيث الاستجابات الحالية للجهد الخطوة اختبار متساوون جميعا في السعة.
    ملاحظة: في ظروف التسجيل الموضحة هنا (أي الخلايا CH 3 SO 3 - أو C 6 H 11 O 7 -)، التحفيز متشابك من المحاور مثير توليد التيارات نجمي مع الطول الموجي المعقدة التي تتكون من حالة ارتفاع سريع متكافئة الداخل عابر الحالية وبطيئة -ارتفاع، أصيب K +-الداخل الحالي يعكس K + إعادة موازنة في الفضاء خارج الخلية بعد انتشار العمل المحتملة على طول محاور عصبية مجاورة. فمن الأهمية بمكان لإزالة هذا K + المطرد في الحالي، مثل أي الحالية المتبقية من شأنه أن يؤدي إلىالمبالغة في تقدير مدى الحياة الغلوتامات.
  7. طرح متوسط ​​التتبع التي تم الحصول عليها مع التحفيز واحدة من المتوسط ​​التتبع التي تم الحصول عليها مع التحفيز الاقتران (الشكل 2A اليمين). تسمح هذه الخطوة عزل متكافئة ومستدامة + K-الحالية التي حركها التحفيز الثانية.
  8. تحويل متوسط ​​التتبع التي تم الحصول عليها مع التحفيز من جانب واحد فاصل زمني يطابق الفاصل الزمني بين نبضة المستخدمة لتقديم المقترنة-البقول (أي 100 ميللي ثانية) (الشكل 2B).
  9. طرح في الوقت تحولت متوسط ​​الاستجابة التي تم الحصول عليها مع التحفيز واحد من الاستجابة متوسط ​​إلى تحفيز ثانية حصلت في 4.7 (الشكل 2C). هذه الخطوة يعزل جزء سهلت للتيار نقل التي حركها التحفيز الثاني (fSTC).
  10. في معظم الحالات، فإن الخطوة السابقة يزيل تماما K +-المستدام الحالية. إذا كان هذا هو الحال، عزلة fSTC كاملة ويمكنك اإلجراءاتإد مع تحليل deconvolution واشتقاق بالطبع وقت التخليص الغلوتامات من الخلايا النجمية. في بعض الحالات، ومع ذلك، K +-المستدام الصغيرة الحالية لا تزال موجودة (الشكل 2D) ومطلوب مزيد من التحليل (انظر القسم 5).
    ملاحظة: تذكر أن التحليل هو موضح في 4،7-4،10 يجب أن يؤديها على متوسط ​​آثار التي تم الحصول عليها في ظروف الرقابة وفي TBOA (10 ميكرومتر).

5. الطرح من K +-zdustained المتبقية الحالية من fSTCs

  1. قياس السعة للK + المستدام المتداولة المتبقية بعد إجراء تحليل وصفها في القسم 4.
  2. مقياس السعة من وظيفة أحادية الأسي هو موضح في 3.3 إلى اتساع مستمر K +-المتبقية الحالية في قياس 5.1 (الشكل 2D اليسار والوسط). للقيام بذلك، في المعادلة 3.3، تعيين الأجل A يساوي اتساع مستمر K + متداولة عنيasured في 5.1 و على المدى Τ ارتفاع يساوي متوسط ​​قيمة Τ ارتفاعا مقداره 3.4 في.
  3. طرح الناتج وظيفة أحادية الأسي من K fSTC ومستدامة +-الحالية التي تم الحصول عليها في 4.10 (الشكل 2D اليمين). هذه الخطوة يكمل عزلة fSTC.

6. عزل التيارات الناقل فلاش المنشط (FTCs)

  1. متوسط ​​لا يقل عن 20 الاحتلالات التي تم الحصول عليها مع مسار الضوء مفتوحة، في ظروف السيطرة وفي TBOA (10 ميكرومتر).
  2. متوسط ​​عدد مماثل من الاحتلالات التي تم الحصول عليها مع مسار الضوء مغلقة، في ظروف السيطرة وفي TBOA (10 ميكرومتر).
  3. مقارنة مدى الاستجابة الحالية إلى الجهد بالسيارات -3 خطوة في أربعة آثار بلغ متوسط ​​(مراقبة نبض واحد، ومراقبة المقترنة-البقول، TBOA نبض واحد، TBOA تقرن-البقول).
  4. إذا كان مدى الاستجابة الحالي هو نفسه في كل آثار أربعة، انتقل إلى الخطوة 6.7.
  5. إذا كانت السعة من المتوسط ​​الحالي يختلف في أي من آثار أربعة، ولكن كل آثار الفردية هي مناسبة لإدراجها في المتوسط، تحقق من أن في كل التتبع مع مسار الضوء فتح حجم موازين FTC خطيا مع حجم الاستجابة الحالية إلى الجهد خطوة الاختبار. إذا كان هذا هو الحال، توسيع نطاق كل آثار مع الاحترام لبعضهما البعض بحيث الاستجابات الحالية للجهد الخطوة اختبار متساوون جميعا في السعة.
    ملاحظة: في ظروف التسجيل الموضحة هنا (أي الخلايا CH 3 SO 3 - أو C 6 H 11 O 7 -)، المحفزات فلاش توليد التيارات نجمي يتكون فقط للارتفاع سريع عابر متكافئة الداخل الحالي.
  6. طرح متوسط ​​التتبع التي تم الحصول عليها مع بات ضوءح منعت من متوسط ​​التتبع التي تم الحصول عليها مع مسار الضوء مفتوح. تسمح هذه الخطوة إزالة قطعة أثرية التحفيز وعزل FTCs.
    ملاحظة: يجب إجراء تحليل وصفها في 6.7 في المتوسط ​​آثار التي تم الحصول عليها في ظروف الرقابة وفي TBOA (10 ميكرومتر).

7. تحليل Deconvolution

  1. تناسب نقل الحالية (fSTC أو FTC) سجلت في ظروف التحكم (الشكل 3A اليسار) وTBOA (10 ميكرومتر) (الشكل 3A اليمين) ومعزولة كما هو موضح في الأقسام 4-6، مع وظيفة متعددة الأسي:
    المعادلة 2
  2. إنشاء وظيفة ارتفاع الفور أن يضمحل أحادية أضعافا مضاعفة وفقا للوظيفة:
    المعادلة 3
    وأن أفضل وصف للمرحلة المتحللة من التيار نقل المسجلة في TBOA (10 ميكرومتر) (الشكل 3B).
    ملاحظة: وظيفة وصفها في 7.2 (أي H (T)) يمثل بالطبع وقت التخليص الغلوتامات من الخلايا النجمية في حضور TBOA (10 ميكرومتر).
  3. Deconvolve وظيفة أحادية الأسي التي تم الحصول عليها في 7.2 (الشكل 3B 3C والأوسط) من نوبة من التيار نقل المسجلة في TBOA (10 ميكرومتر) التي تم الحصول عليها في 7.1 (يمين، يسار ج الشكل 3A).
    ملاحظة: deconvolution هو عملية حسابية تضمنت في العديد من حزم برامج التحليل مثل (على سبيل المثال مطلب، بيثون). في IgorPro، رمز البرمجة التي نستخدمها عادة لتنفيذ هذا النوع من التحليل، وعملية deconvolution يمكن حسابها بكفاءة كما هو موضح أدناه، وذلك باستخدام فورييه السريع منفصلة يحول. أولا، استخدام عملية الاتحاد الفرنسي للتنس على حساب ديscrete تحويل فورييه السريع وظيفة أحادية الأسي التي تم الحصول عليها في و7.2 من نوبة من التيار نقل المسجلة في TBOA حصلت في 7.1. المقبل، استخدم العملية IFFT لحساب معكوس المنفصلة تحويل فورييه السريع من نسبة وظائف الاتحاد الفرنسي للتنس اثنين. وظيفة الناتجة الأول (ر) يمكن وصفها على النحو التالي:
    المعادلة 4
    الخطوة موضح في 7.3 يسمح اشتقاق مرشح للنقل الحالي في TBOA (10 ميكرومتر) (الشكل 3C اليمين). مرشح يمثل عوامل التشويه التي تحول عمر الغلوتامات في الأغشية نجمي في نقل معزولة الحالي في الأقسام 4-6 (أي fSTC أو FTC).
  4. Deconvolve مرشح (الشكل 3C الحق، الشكل 3D الأوسط) من نوبة من الناقل الحالي في ظروف التحكم (الشكل 3A الشكل 3D اليسار).
    ملاحظة: هذه الخطوة تتيح اشتقاق بالطبع وقت التخليص الغلوتامات من الخلايا النجمية في ظروف التحكم (الشكل 3D اليمين). الافتراض الأساسي هذه الخطوة deconvolution هو أن ملف التعريف الزمني للمرشح يبقى دون تغيير في ظروف الرقابة وفي TBOA (10 ميكرومتر).
  5. للحصول على تقدير كمي للدورة الوقت الكلي لإزالة الغلوتامات، وحساب النقطه الوسطى (<T>) من الموجي حصلت عليه في الخطوة 7.4. ويتم ذلك عن طريق حساب <T> على النحو التالي:
    المعادلة 5
    حيث G (T) هو الموجي حصلت عليه في الخطوة 7.1. في المعادلة المذكورة أعلاه، فإن مصطلح تي يتوافق مع الإطار الزمني الذي يتم احتساب يتجزأ.
    ملاحظة: عندما تأسست الأسلوب الأول،تم حساب <T> عبر Windows الوقت الذي تركت غير المقيدة 13. هذا النهج يمكن استخدامها طالما تم تعيين إطار التكامل لتكون أوسع من مدة التخليص الغلوتامات ويضمحل الموجي التخليص يعود تماما إلى خط الأساس. إذا لم تكن هذه هي الحالة، ومع ذلك، وهذه الطريقة لتقدير <T> واجه بعض القيود. على سبيل المثال، إذا كان الموجي التخليص لا تتحلل تماما مرة أخرى إلى خط الأساس، ثم <T> يزيد مع عرض النافذة التكامل. لتجنب أي مصدر محتمل لعدم دقة لتقدير <T>، ونحن الآن حساب ذلك خلال نافذة زمنية الموافق 10٪ من ذروة نقل الحالية، قبل وبعد 14 بدايته. هذا النهج الأخير يحسن الاتساق مع الذي يقاس <T> عبر الخلايا. هذا يأتي في متناول اليدين وخاصة عند تحليل آثار صغيرة من العلاجات الدوائية على مدار الساعة من التطهير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نجاح النهج التحليلي الموصوفة هنا يتوقف بصورة حاسمة على الحصول على التسجيلات الكهربية ذات جودة عالية من التيارات نقل من الخلايا النجمية في أي منطقة من الجهاز العصبي المركزي. في الماوس شرائح الحصين الحادة، والخلايا النجمية يمكن تحديدها بسهولة تحت Dodt إضاءة أو IR-DIC لما لها من جسم الخلية الصغيرة (O = 10 ميكرون) ونواة بارزة (الشكل 1). يمكن تقدير المميز على شكل نجمة التشكل مع epifluorescence، متحد البؤر، أو ليزر ثنائي الفوتون المجهر، عند إضافة fluorophore مثل اليكسا 594 (50 ميكرومتر) إلى حل داخل الخلايا، (الشكل 1). على الصعيد الكهربية، وتتميز الخلايا النجمية التي كتبها منخفضة المقاومة المدخلات، غشاء المحتملة hyperpolarized (~ -90 بالسيارات) وعدم القدرة على توليد إمكانات العمل. الخلايا النجمية توليد التيارات ردا على التحفيز الكهربائي أو optogenetic من الخلايا العصبية المجاورة والتحلل الضوئي للأشعة فوق البنفسجية من كاليفورنيامركبات GED مثل MNI-L-الغلوتامات.

يمكن تسجيل التيارات نقل نجمي باستخدام جيم + أو K + الحلول الداخلية القائمة. علما بأن خدمات العملاء +، وهو K + شعبية بديلا، ويدعم نقل الغلوتامات ولكن يؤدي إلى إبطاء معدل الغلوتامات الدراجات نقل 16،17 (لأن نقل الغلوتامات ربط و / أو نقل من جيم + عبر الغشاء ببطء أكثر من K +). إذا سيزيوم + يقلل بشكل ملحوظ من عدد من شركات النقل متاحة للالغلوتامات ملزم، فإنه يؤدي أيضا إلى التيارات نقل أصغر / أبطأ من تلك التي سجلت مع K + الحلول الداخلية القائمة على 16،17.

عند استخدام CH 3 SO 3 - أو C 6 H 11 O 7 - كما أنيون داخل الخلايا الرئيسية، والحالية الناتجة عن نقل الغلوتامات في الخلايا النجمية ويرجع ذلك إلى حركة stoichiometrically يقترن من 1 الغلوتامات، 3 نا + K + و 1 عبر الغشاء. هذا التيار القياس المتكافئ ليست سوى واحدة من الخلايا النجمية سجلت في التجارب التحلل الضوئي ونشير إلى أنها لجنة التجارة الاتحادية. عند تنفيذ التجارب التحلل الضوئي، فمن المستحسن أن التحفيز للأشعة فوق البنفسجية بديلة تم الحصول عليها مع مسار الضوء المفتوحة والمحظورة. آثار التي تم الحصول عليها مع مسار الضوء سدت هي مفيدة لعزل قطعة أثرية التحفيز التي تم إنشاؤها بواسطة مصباح فلاش، ويمكن أن تطرح من تلك التي تم الحصول عليها مع مسار الضوء مفتوحة لعزل تماما FTC.

التيار سجلت في الخلايا النجمية عندما تستحضر الافراج متشابك من الغلوتامات ديه الموجي أكثر تعقيدا. وهو يتألف من سرعة والارتفاع، مكون الداخل عابرة نظرا لstoichiometrically يقترن الغلوتامات الحالي نقل الموصوفة أعلاه. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يضم بطيئة الارتفاع، K +-الداخل مستمرة الحالي بسبب تدفق K + المتراكمة في الفضاء خارج الخلية بعد إمكانات العملالانتشار على طول محاور عصبية مجاورة. نهج الدوائية يمكن استخدامها لعزل نقل الحالية من K + المطرد في الحالية، ويتطلب استخدام تركيزات عالية من واسع الطيف الغلوتامات نقل خصم TBOA (100 ميكرومتر) في نهاية التجربة 12. الطريقة الموصوفة هنا يستخدم النهج التحليلي بحتة لعزل نقل الغلوتامات الحالي من K + المطرد في الحالية، وبالتالي يسمح للتجارب أقصر (الشكل 2).

كخطوة أولى، ونحن تعشيق التحفيز واحد وإقران النبض متشابك (100 ميللي ثانية بعيدا)، كل 10-20 ثانية، ومتوسط ​​عدد متساو من الاحتلالات التي تم الحصول عليها مع المثيرات واحد وإقران النبض. ينبغي أن السعة للتيار الأول التي حركها المحفزات تقرن تتناسب مع اتساع الحالية التي حركها التحفيز واحد. نبدأ هذا التحليل من خلال طرح الحالية التي حركها التحفيز واحدة من تلك التي حركهاالمنبهات المقترنة. هذا الطرح يسمح عزل استجابة لحافز الثاني، الذي يتكون أيضا من سرعة والارتفاع، عابر نقل الغلوتامات الحالية وبطيئة نحو مطرد ومستدام K +-الحالية (الشكل 2A اليمين). المقبل، ونحن تحويل استجابة لحافز واحد عن طريق فترة زمنية المقابلة للفاصل الزمني بين نبضة من المنبهات المقترنة، بحيث وقت بداية ردا واحدا يطابق وقت بداية الرد الثاني معزولة أعلاه (الشكل 2B ). من خلال طرح هذين التيارين، ونحن عزل جزء سهلت للتيار الناقل، الذي نسميه هنا fSTC (الشكل 2C). حركية من fSTC متشابهة إلى حركية الناقل synaptically تنشيط الحالية (اللجان الفنية المتخصصة) معزولة دوائيا مع تركيزات عالية من خصم نقل الغلوتامات TBOA (100 ميكرومتر) 13. لهذا السبب وبساطة، في العمل السابق، أشرنا إلى fSTCكما STC 13،14. على الرغم من كونها التيارات مع خصائص مماثلة، fSTCs واللجان الفنية المتخصصة ليست هي نفسها الحالية. لهذا السبب وللتأكد من دقتها، في هذا العمل، وسوف نشير إليها صراحة كما fSTCs واللجان الفنية المتخصصة. أسلوب الطرح وصفها هنا يسمح لعزل دقيقة من fSTCs في معظم التسجيلات. ومع ذلك، في بعض الحالات، K +-المستدام المتبقية الحالية لا تزال موجودة. في هذه الحالة، من الضروري عزل K + المستدام متداولة في تجارب منفصلة باستخدام تركيزات عالية من TBOA (50-100 ميكرون). على مدار الساعة من دوائيا معزولة K +-حقت الحالية يمكن وصفها من قبل وظيفة أحادية الأسي في شكل:

معادلة 6

من خلال تسجيل التيارات نجمي في خلايا مختلفة، ونحن نقدر متوسط ​​قيمة Τ الارتفاع. نحن يخلق المقبل EA وظيفة أحادية الأسي مثل واحد هو موضح أعلاه، التي ترتفع في Τ يتوافق مع متوسط ​​قيمة Τ ارتفاع تقاس تجريبيا في الخلايا النجمية المختلفة ويتوافق مع اتساع مستمر K +-المتبقية الحالية التي نريد لإزالة (الشكل 2D ).

الأسلوب وصفنا فقط لعزل fSTCs يعمل بشكل جيد عندما تستحضر الافراج الغلوتامات من تيسير نقاط الاشتباك العصبي، ويمكن أن تستخدم أيضا لدراسة الافراج عن الغلوتامات من نقاط الاشتباك العصبي التي تخضع الاكتئاب إقران النبض. ومع ذلك، فإنه هو من فائدة تذكر عند نقاط الاشتباك العصبي الجلوتاميرجي قيد الدراسة لا تظهر أي شكل واضح من التيسير على المدى القصير أو الاكتئاب. في هذه الحالة، فإن العزلة الدوائية من التيارات نقل مع تركيزات عالية من TBOA (100 ميكرومتر) لا تزال هي الحل الأكثر جدوى لعزل نقل الغلوتامات stoichiometrically يقترن، synaptically أثار الحالي.

"jove_content"> لإجراء تحليل deconvolution وقياس مدى الحياة من الغلوتامات في الأغشية نجمي من الضروري عزل FTCs أو fSTCs في ظروف التحكم في وجود تركيز تشبع الفرعية من TBOA (10 ميكرومتر)، للحد من نقل السعة الحالية إلى 30٪ على الأقل من قيمتها في ظروف التحكم (أي دون منع ذلك تماما). والهدف هنا هو أن يتباطأ بشكل ملحوظ مدار الساعة من نقل الحالية دون أن تفقد القدرة على تمييزه عن الضوضاء من التسجيلات. الافتراض الأساسي هو أنه في وجود تركيز قليل من TBOA، عندما تتقلص قدرة امتصاص الخلايا النجمية، فإن العامل الرئيسي تشكيل اضمحلال التيار الناقل هو الانخفاض التدريجي لتركيز الغلوتامات في الغشاء نجمي 12،18. نحن تناسب الحالي نقل في ظروف الرقابة وفي TBOA (10 ميكرومتر) مع وظيفة متعددة الأسي:

(الشكل 3A). نحن تقريبي إزالة الغلوتامات في TBOA (10 ميكرومتر) مع وظيفة على الفور، مع ارتفاع الاضمحلال أحادية الأسي (الشكل 3B) ونحن deconvolve عليه من وظيفة متعددة الأسي واصفا نقل الحالية في TBOA (10 ميكرومتر؛ الشكل 3C). الموجي الناتج هو "فلتر"، وتمثل مزيجا من العوامل التي تشوه (أي التصفية) بيان التركيز الغلوتامات في نقل الحالية (الشكل 3C). Deconvolving مرشح من صالح متعدد الأسي للنقل الحالية في ظروف السيطرة يسمح تقدير مدار الساعة من بيان التركيز الغلوتامات في نجمية سجلت في ظروف التحكم (الشكل 3D). لهذا التحليل deconvolution، ونحن نفترض أن حركيةمن مرشح تبقى دون تغيير في ظل غياب وبحضور TBOA (10 ميكرومتر). هذا هو افتراض معقول لأن كل العوامل التي تساهم في تصفية (أي حركية نقل، وتصفية تيار كهربي، وخلال التحفيز متشابك، وإطلاق سراح غير المتزامن من الغلوتامات عبر نقاط الاشتباك العصبي) من غير المرجح أن يتأثر وجود TBOA، وهو المركب الذي يقلل من عدد من النقل المتاحة للالغلوتامات ملزمة.

نحن نستخدم النقطه الوسطى (<T>) كمقياس لعمر الغلوتامات في الأغشية نجمي في خلايا مختلفة. <T> يمثل "مركز الكتلة" من ​​الموجي التخليص، وغير حساسة للتغيرات في كل وقت صعود واضمحلال الموجي إزالة الغلوتامات. وأعرب عن النقطه الوسطى على النحو التالي:

المعادلة 5

الطبقة = "jove_content"> هناك طريقتان لتحديد الفاصل الزمني الذي يمكننا حساب التكاملات في البسط والمقام من هذا التعبير. لأن الموجي التخليص ترتفع من ويضمحل الى نقطة الصفر، عندما تأسست الأسلوب الأول، لم يكن هناك مواصفات المحرز بشأن كيفية تعيين إطار التكامل، في واقع الأمر تم ذلك بدلا فضفاضة 13. طريقة واحدة للتغلب على هذه المشكلة للحد من نافذة التكامل إلى الوقت الذي يستغرقه للوصول إلى نسبة التعسفي من ذروة FTC / fSTC، على سبيل المثال 10٪ 14. يسمح هذا المعيار بسيط كونها تتفق عند تنفيذ هذا التحليل في خلايا مختلفة، ويحسن الدقة في تقديرات <T> عندما الموجي التخليص لا تتحلل تماما إلى الصفر، ويحسن من حساسية من تحليل للاختلافات صغيرة في الطول الموجي التخليص التي قد تحدث في مجموعات مختلفة من الخلايا.

ه 1 "FO: محتوى العرض =" 3in "FO: SRC =" / files/ftp_upload/50708/50708fig1highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50708/50708fig1.jpg "/>
الشكل 1. تحديد الخلايا النجمية في قرن آمون شرائح الحادة. (AB) الصور Dodt من الخلايا النجمية في قرن آمون CA1 الطبقة المشععة. تحت Dodt الإضاءة وIR-DIC، يمكن تحديد الخلايا النجمية التي كتبها أجسامهم زنزانة صغيرة ونواة بارزة. تشير الأسهم الحمراء إلى الخلايا النجمية المتعددة التي يمكن تحديدها في إعداد شرائح. يظهر السهم الأصفر نجمية التي تم تصحيحها ومليئة صبغة الفلورسنت (انظر أدناه). (CD) مضافين صورة Dodt من شرائح قرن آمون واثنين من الفوتون من الخلايا النجمية مرقع، أبرزت مع السهم الأصفر في (AB). لهذه التجربة، ومصححة الخلايا النجمية ومليئة KCH 3 SO 3 - حل داخلي يستند إلى واضاف مع اليكسا 594 (50 ميكرومتر). عمليات نجمي توسيع نطاق بضع عشرات من ميكرومتر بعيدا عن رانه خلية الجسم. شروح من اليسار تحديد الطبقات الخلوية الثلاث الرئيسية في تشكيل CA1 الحصين التي يمكن المعترف بها في شرائح.

الشكل 2
الشكل 2. عزل fSTCs من التيارات نقل synaptically تنشيط سجلت في الخلايا النجمية. (AC) مخطط من الخطوات التحليلية اللازمة لعزل fSTCs من التيارات نقل synaptically تنشيط سجلت في الخلايا النجمية. (د) نهج التحليلية المستخدمة لإزالة K +-المستدام المتبقية الحالية من fSTCs (انظر القسم 5). انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الشكل (3) ENT-العرض = "6.5in" FO: SRC = "/ files/ftp_upload/50708/50708fig3highres.jpg" SRC = "/ files/ftp_upload/50708/50708fig3.jpg" />
الشكل (3). تحليل Deconvolution المستخدمة في اشتقاق بالطبع وقت التخليص الغلوتامات من الخلايا النجمية (أ) صالح أحادي الأسي من fSTC / FTC معزولة في ظروف التحكم (يسار) وبحضور TBOA (10 ميكرومتر، والحق). (ب) يتم تقريب مدار الساعة من إزالة الغلوتامات في TBOA (10 ميكرومتر) التي كتبها وظيفة على الفور، مع ارتفاع الاضمحلال أحادية الأسي. (ج) Deconvolving أثناء وقت التخليص الغلوتامات في TBOA (10 ميكرومتر) عن صالح متعدد الأسي للنقل الحالي في TBOA (10 ميكرومتر) يسمح تقدير التصفية. (د) Deconvolving مرشح من صالح متعدد الأسي للنقل الحالية في ظروف السيطرة يسمح تقدير بالطبع وقت التخليص الغلوتامات من الخلايا النجمية في ظروف السيطرة.files/ftp_upload/50708/50708fig3large.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لعرض أكبر شخصية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نحن هنا وصف نهج تجريبي للحصول على التسجيلات الكهربية من الخلايا النجمية، بروتوكول التحليلية لعزل التيارات نقل الغلوتامات في الخلايا النجمية وطريقة رياضية لاشتقاق بالطبع وقت التخليص الغلوتامات من التيارات نقل نجمي.

نجاح التحليل يعتمد على القدرة على الحصول على نوعية عالية تسجيلات المشبك التصحيح من الخلايا النجمية وعلى دقة خوارزميات المناسب يستخدم لوصف التيارات نقل. يعتمد التحليل deconvolution على الافتراضات التالية اثنين. (1) العمليات المتعددة التي تشوه بالطبع وقت التخليص الغلوتامات في نقل التجربة الحالية المسجلة يمكن أن تكون ممثلة كنظام خطي. وعلى الرغم من حيث القيمة المطلقة العديد من العوامل التي التيارات نقل الشكل هي أنظمة غير الخطية (من حيث المبدأ الغلوتامات ملزمة والنقل على حد سواء يمكن الخضوع التشبع)، الأدلة التجريبية إنديكاTES أن نظامهم الخطية واسع. وفقا لذلك، وبالطبع الوقت من التيارات نقل والتخليص الغلوتامات لا يزال هو نفسه على طائفة واسعة من قوة التحفيز، والإفراج عن احتمال، وتركيزات الغلوتامات 13،14،18. على الرغم من هذا التقارب يبدو أن المشروعة للظروف تجريبية لدينا، وينبغي التحقق من صحة ذلك من قبل تكرار هذا التحليل في التحضيرات تجريبية مختلفة. (2) والخصائص من مرشح لا تتأثر وجود TBOA (10 ميكرومتر). هذا الافتراض يبدو معقولا لأن كل العوامل التي تساهم في تصفية (أي حركية نقل، وتصفية تيار كهربي، وخلال التحفيز متشابك، وإطلاق سراح غير المتزامن من الغلوتامات عبر نقاط الاشتباك العصبي) من غير المرجح أن يتأثر وجود TBOA.

بواسطة اشتقاق الموجي إزالة الغلوتامات من fSTCs وFTCs، نحصل على نوعين مختلفين من المعلومات. من خلال تحليل fSTCs، نقيس الوقت الذي astrocyويتعرض الأغشية عرة إلى الغلوتامات أفرج عنه من نقاط الاشتباك العصبي. بواسطة تستحضر FTCs مع كامل الحقل إضاءة الأشعة فوق البنفسجية (أي من قبل uncaging الغلوتامات على سطح نجمي كامل)، نقيس الوقت الذي تتعرض الأغشية نجمي إلى الغلوتامات uncaged. في هذه التجارب uncaging يتم الافراج عن جزيئات الغلوتامات (أي uncaged) في نفس الوقت ويتم تنشيط جميع الناقلين في نفس الوقت، من خلال تركيز الغلوتامات نفسه. لذلك، من خلال تحليل FTCs، يمكننا الحصول على قراءات غير المباشرة للنجمي قدرة امتصاص الغلوتامات.

ومن المهم أن نلاحظ أن الأساليب المذكورة هنا تسمح تقدير بالطبع وقت التخليص الغلوتامات، وليس القيمة الفعلية للتركيز الغلوتامات تستحضر التيارات نقل. وبالطبع الوقت المقدر هو مقياس لمتوسط ​​الحال وقت التخليص الغلوتامات في جميع مجالات الغشاء نجمي التي لدينا إمكانية الوصول الكهربية: ليسر حساسة للالتغاير في امتصاص الغلوتامات في مواقع مختلفة داخل غشاء نجمي 19. من المرجح أن يكون تم الحصول عليها مع المجهري عالية الدقة من صحفيين الفلورسنت حساسة الغلوتامات 20 هذه المعلومات. ومع ذلك، فإن للصحفيين حساسة الغلوتامات المتاحة حاليا تظهر نطاقات ضيقة نسبيا ديناميكية. وهذا يمكن أن تحدث تشوهات غير خطية بين تركيز الشخصي الغلوتامات وإشارة الفلورسنت، والحد من استخدام هذه التحقيقات لاستخراج المعلومات الزمانية على تركيز الغلوتامات عابرة. ولذلك، فمن المحتمل أن يكون من خلال الجمع بين كل هذه الأساليب المختلفة التي يمكن للمرء الحصول على فهم أشمل لديناميات إشارات الجلوتاميرجي في الأغشية نجمي.

وباختصار، فإن الأساليب المقدمة هنا يمكن استخدامها لتقدير دورة الإجازة وقت من synaptically صدر أو فلاش uncaged الغلوتامات في الأغشية نجمي. أنها توفر أدوات قيمة أن كاليفورنيان أن تستخدم لتقدير عمر الغلوتامات في الفضاء خارج الخلية في مراحل مختلفة من التنمية 13 في مجموعة متنوعة من الأنواع الحيوانية 14 ومناطق الدماغ تحت الظروف الفسيولوجية والمرضية 21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية برنامج بحوث جماعية (NS002986). كما كتب مخطوطة وتنفيذ تحليل deconvolution. وضعت دكتوراه النسخة الأولية من تحليل deconvolution وعلق على النص.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CGP52432 Tocris 1246
(R,S)-CPP Tocris 173
DPCPX Tocris 439
LY341495 disodium salt Tocris 4062
MSOP Tocris 803
NBQX disodium salt Tocris 1044
D,L-TBOA Tocis 1223
Picrotoxin Sigma P1675
MNI-L-glutamate Tocris 1490
Alexa 594 Life Technologies A10438 Optional
Matrix electrodes Frederick Haer Company MX21AES(JD3)
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments PG10165-4
Dual-stage glass micro-pipette puller Narishige PC-10
Loctite 404 instant adhesive Ted Pella 46551
Xe lamp Rapp OptoElectronic FlashMic
Igor Pro 6 Wavemetrics

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ventura, R., Harris, K. M. Three-dimensional relationships between hippocampal synapses and astrocytes. J. Neurosci. 19, 6897-6906 (1999).
  2. Witcher, M. R., Kirov, S. A., Harris, K. M. Plasticity of perisynaptic astroglia during synaptogenesis in the mature rat hippocampus. Glia. 55, 13-23 (2007).
  3. Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).
  4. Herman, M. A., Jahr, C. E. Extracellular glutamate concentration in hippocampal slice. J. Neurosci. 27, 9736-9741 (2007).
  5. Arnth-Jensen, N., Jabaudon, D., Scanziani, M. Cooperation between independent hippocampal synapses is controlled by glutamate uptake. Nat. Neurosci. 5, 325-331 (2002).
  6. Barbour, B. An evaluation of synapse independence. J. Neurosci. 21, 7969-7984 (2001).
  7. Rusakov, D. A., Kullmann, D. M. Extrasynaptic glutamate diffusion in the hippocampus: ultrastructural constraints, uptake, and receptor activation. J. Neurosci. 18, 3158-3170 (1998).
  8. Zerangue, N., Kavanaugh, M. P. Flux coupling in a neuronal glutamate transporter. Nature. 383, 634-637 (1038).
  9. Eliasof, S., Jahr, C. E. Retinal glial cell glutamate transporter is coupled to an anionic conductance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 4153-4158 (1996).
  10. Wadiche, J. I., Amara, S. G., Kavanaugh, M. P. Ion fluxes associated with excitatory amino acid transport. Neuron. 15, 721-728 (1995).
  11. Wadiche, J. I., Kavanaugh, M. P. Macroscopic and microscopic properties of a cloned glutamate transporter/chloride channel. J. Neurosci. 18, 7650-7661 (1998).
  12. Bergles, D. E., Jahr, C. E. Synaptic activation of glutamate transporters in hippocampal astrocytes. Neuron. 19, 1297-1308 (1997).
  13. Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. J. Neurosci. 25, 2906-2916 (2005).
  14. Scimemi, A., Tian, H. Neuronal transporters regulate glutamate clearance, NMDA receptor activation, and synaptic plasticity in the hippocampus. J. Neurosci. 29, 14581-14595 (2009).
  15. Zuo, Z. Isoflurane enhances glutamate uptake via glutamate transporters in rat glial cells. Neuroreport. 12, 1077-1080 (2001).
  16. Barbour, B., Brew, H., Attwell, D. Electrogenic uptake of glutamate and aspartate into glial cells isolated from the salamander (Ambystoma) retina. J. Physiol. 436, 169-193 (1991).
  17. Bergles, D. E., Tzingounis, A. V., Jahr, C. E. Comparison of coupled and uncoupled currents during glutamate uptake by GLT-1 transporters. J. Neurosci. 22, 10153-10162 (2002).
  18. Diamond, J. S., Jahr, C. E. Synaptically released glutamate does not overwhelm transporters on hippocampal astrocytes during high-frequency stimulation. J. Neurophysiol. 83, 2835-2843 (2000).
  19. Benediktsson, A. M., et al. Neuronal activity regulates glutamate transporter dynamics in developing astrocytes. Glia. 60, 175-188 (2012).
  20. Hires, S. A., Zhu, Y., Tsien, R. Y. Optical measurement of synaptic glutamate spillover and reuptake by linker optimized glutamate-sensitive fluorescent reporters. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4411-4416 (2008).
  21. Scimemi, A., Meabon, J., Woltjer, R. L., Sullivan, J. M., Diamond, J. S., Cook, D. G. Amyloidβ1-42 slows clearance of synaptically-released glutamate by mislocalizing astrocytic GLT-1. J. Neurosci. 33, 5312-5318 (2013).

Tags

علم الأعصاب، العدد 78، علم الأعصاب، الكيمياء الحيوية، علم الأحياء الجزيئي، علم الأحياء الخلوي، علم التشريح، علم وظائف الأعضاء، الفيزياء الحيوية، النجمية، الوصلات العصبية، حمض الجلوتاميك، بروتينات النقل غشاء، النجمية، نقل الغلوتامات، امتصاص، والتخليص، الحصين، الطبقة المشععة، CA1، الجينات، الدماغ، شريحة، نموذج حيواني
اشتقاق مدار الساعة من تخليص الغلوتامات مع تحليل Deconvolution من التيارات الناقل نجمي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Scimemi, A., Diamond, J. S. Deriving … More

Scimemi, A., Diamond, J. S. Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents. J. Vis. Exp. (78), e50708, doi:10.3791/50708 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter