アストロサイトトランスポーター電流のデコンボリューション解析グルタミン酸クリアランスの時間経過の導出

Summary

私たちは、アストロサイトにおけるグルタミン酸トランスポーター電流の電気生理学的記録から、アストロサイトの膜にグルタミン酸の寿命を推定するための分析方法について説明します。

Abstract

脳内のグルタミン酸トランスポーターの最高密度はアストロサイトに含まれています。グルタミン酸トランスポーターのカップル3のNa ⁺と1 Hの共同輸送⁺と1のK ⁺の逆輸送と膜を横切ってグルタミン酸の動き。輸送プロセスによって生成された化学量論的な電流は、星状細胞からの全細胞パッチクランプ記録を監視することができる。記録された電流の時間経過は、星状細胞がさらされるグルタミン酸濃度プロファイル、グルタミン酸輸送体の速度論、及び星状膠細胞膜の受動的電気緊張特性の経時変化によって成形される。ここでは、アストロサイトにおけるグルタミン酸トランスポーター電流を記録し、アストロサイトトランス電流の波形を整形する他のすべての要素からグルタミン酸クリアランスの経時変化を単離することができる実験·分析方法が記載されている。ここで説明する方法は、寿命、oを推定することができるfの健康と病気の間に、中枢神経系の任意の領域におけるアストロサイトの膜にグルタミン酸フラッシュuncagedとシナプスリリース。

Introduction

アストロサイトは、星型の形態と神経網全体に拡張し、隣接したシナプスの接点^1,2達する細かい膜突起と脳の中で最も豊富な種類の細胞の一つである。アストロ'細胞膜が密グルタミン酸トランスポーター分子³が満載されています。生理学的条件下で、グルタミン酸輸送体は急速に膜の細胞側にグルタミン酸を結合し、細胞の細胞質に転送する。そうすることによって、輸送体は、細胞外空間⁴におけるグルタミン酸の低い基底濃度を維持する。シナプスの興奮に隣接細かいアストロサイトのプロセスにおけるグルタミン酸トランスポーターは、理想的に、それが離れてシナプス間隙から拡散するようにシナプスのイベントの際に放出グルタミン酸をバインドするために配置されている。そうすることにより、輸送体はまた興奮性信号の空間的な広がりを低減し、周囲と余分シナプス地域に向けて、隣接するシナプスへのグルタミン酸スピルオーバー制限^5-7脳内の。

グルタミン酸輸送は、化学量論的に3のNa ⁺と1 H ⁺彼らの電気化学的勾配に沿って1の逆輸送への動きK ^{+ 8}に結合された起電プロセスです。 （チオシアン酸）> NO ₃ ^{- - （}硝酸塩）≈のClO ₄ ^{- （}過塩素酸）> I ^- > Brの^- > Cl ^-の> F ^-はなく、グルタミン酸輸送はSCNに対して透過性（ただし、化学量論的に結合されていない）のアニオン性コンダクタンスに関連付けられています（メタンスルホン酸）とC ₆ H ₁₁ O ₇ ^{- - （}グルコン^）9-11 CH ₃ SO ₃へ。両方の電流（化学量論的および非化学量論的）Dodt照明やacutで赤外微分干渉コントラスト（DIC-IR）の下で視覚的に識別、星状細胞から全細胞パッチクランプ記録を取得することによって記録することができる電子脳スライス^12。膜を通過するグルタミン酸トランスポートに関連付けられた現在の化学量論的成分がCH ₃ SO _3を用いて単離することができる^{- 、}またはC ₆ H ₁₁ O ₇ ^-ベース内のソリューションとアストロ^13,14上のフラッシュアンケージンググルタミン酸によって誘発することができ、または近隣のシナプスからのグルタミン酸放出を活性化することによって、どちらか電気¹²またはターゲットoptogeneticコントロール付き。

現在のトランスポーターの化学量論的成分の時間経過は、によって、星状細胞膜（ すなわちグルタミン酸クリアランス）、グルタミン酸トランスポーターの動態、アストロサイトの受動的膜特性、時およびシナプスの刺激時のグルタミン酸濃度プロファイルの寿命によって形作られているアクティブシナプス¹³渡るグルタミン酸放出のシンクロニシティ。ここでは、完全な詳細に説明します：（1）実験グラムApproachは、例えば実験的製剤として急性マウス海馬スライスを使用して星状細胞から全細胞パッチクランプ記録からグルタミン酸トランス電流の化学量論的成分を単離するステップと、（2）分析的アプローチは、これらの記録から¹³グルタミン酸クリアランスの経時変化を導出するために^{、 14。}これらの方法は、中枢神経系の任意の領域におけるアストロサイトからのグルタミン酸トランス電流を記録して分析するために使用することができる。

Protocol

1。スライス標本

1. 119のNaCl、2.5 KClを、0.5のCaCl _2、1.3硫酸マグネシウム_{4·7H 2} O、4のMgCl _2、26.2のNaHCO _3、1のNaH ₂ PO _4、および22グルコース、320：含む/ストレージソリューション（単位：mm）スライス500ミリリットルを準備mOsm、pHは7.4
2. 200ミリリットルの溶液をスライス/ストレージで塗りつぶし、スライス浸水室を調製した250mlビーカーを使用し、34℃の水浴中°C、95％O _{2、5％CO 2}泡に温める。
3. 4でガラス瓶の残りのスライス/ストレージソリューション℃で保つ
4. ビブラトームサンプルホルダーに小さな寒天ブロック（6％、ACSFで準備）を添付して、それは4℃で保存するためにシアノアクリレート系接着剤を使用して、
5. スライスを開始する30分前には、95％O _{2、5％CO 2}と氷とバブルそれを充填したバケツにスライス/貯蔵溶液を含むガラス瓶を置く。

6. ハロタン/イソフルランでマウス（P14-21、C57BL / 6）を麻酔（イソフルランはアストロサイトのグルタミン酸摂取^15を高めることが報告されている）、それを斬ると、酸素、冷スライス/貯蔵溶液を入れた50mlビーカーにヘッドを浸し。
7. ペーパータオルで包み、-20℃で保存されたアイスパックで脳の解剖を行い
8. 正面から尾の端まで、頭部の背側の半ば矢皮膚切開を行い、頭蓋骨を露出するためにメスを使用してください。
9. 後頭部の穴に外科はさみの小さなペアの下せん断刃を置き、左に向かって、右側にある2つのカット、（45°角度）を作る。
10. 尾から正面最後に、半ば矢状線に沿って頭蓋骨をカットします。
11. へらで脳を取り出し、酸素でそれを浸し、スライシング/コールドストレージsoluti上。
12. メスで、に5カットを行います（1）嗅球と前頭皮質を除去し、（2）小脳を除去し、（3）左を削除し、（4）右の側頭葉、（5）2の脳半球を分離半ば矢状カットで。
13. 軽く余分な溶液を除去するためにペーパータオルで脳の二つの部分。
14. のり冷たいビブラトームベースプレートに各脳切片の側面：脳の背側はビブラトームブレードが直面すべきである、脳の腹側は車ビブラトームブレードから、寒天ブロックに接触しなければなりません。
    注：最高品質のスライスを得るために、それが脳の二つの部分がしっかりとビブラトームベースプレートに接着されていることが重要である。これを行うには、あまりにも液体ではなく、それがあまりにも速く乾くしないシアノアクリレート系接着剤を使用しています。
15. 解剖室へビブラトームベースプレートを固定し、スライス番目を設定250μmまでicknessとブレードランの幅を調整します。スライスに進みます。
    注：すべてが正しい方向である場合、ビブラトームは腹側に向かって背側から、脳の側方に向かって内側から矢のスライスをカットする必要があります。
16. ブレードは皮質と海馬を通過した後は、中脳から大脳皮質/海馬をカットし、34で水没チャンバー内に各スライスを配置するためにメスを使用し℃に
17. スライスの最初のカップルを捨てる。典型的には、スライス12（厚さ250μm以下）を、P14-21マウス脳から得ることができる。
18. 30分間34℃でスライスを維持し、それらが電気生理学の録音のためにそれらを使用する前に、30分間室温まで冷却することができます。

2。アストロサイトの識別と記録

1. 120 KCH ₃ SO _3、10 EGTA、20 HEPES、2 MgATP、0.2 NaGTP、：含む内部溶液（単位：mm）を準備5 QX-314Br、および5のNaCl、290 mOsm、pHは7.2。
2. のNaCl、2.5 KClを、2.5のCaCl _2、1.3呈_4、および22グルコース、300 mOsm、pHは7.4のNaHCO _3、1 O、1のMgCl _{2、26.2·7H 2} MgSO ₄を119：含む細胞外記録溶液（単位：mm）を準備、95％O _{2、5％CO 2}で飽和。
3. GluA、GluN、mGluRII、mGluRIII、GABA _{A、GABA B、}およびA1アデノシン受容体（μM）での活性化を阻止するために、細胞外記録液には、次の薬を追加します：10 2,3 -ジオキソ-6 -ニトロ-1、 2,3,4 -テトラヒドロベンゾ[ƒ] -3キノキサリン-7 -スルホン酸二ナトリウム塩（NBQX）、10（RS） - （2 - carboxypiperazin -4 -イル） -プロピル-1 -ホスホン酸（CPP）、（2S ）-2 - アミノ-2 - [（1S、2S）-2 - carboxycycloprop -1 - イル] -3 - （xantho-の異形-9 - イル）プロパン酸二ナトリウム塩（LY341495）、100（R、S）-α-メチルセリン-O-リン酸（MSOP）、100ピクロトキシン、5 3 - [[（3,4 - ジクロロフェニル）メチル]アミノ]プロピル]エトキシメチル）ホスフィン酸（CGP52432）、18 - シクロペンチル-1,3 - ジプロピルキサンチン（DPCPX）。
4. 録音室における細胞外溶液の温度を設定し、典型的な温度は、34の間にある - 36℃、
5. デュアルステージを使用してホウケイ酸ガラスキャピラリー（R≈2.5MΩ）、ガラスマイクロピペットプラーからパッチクランプ電極を準備します。
6. スライスの1つを取り、記録室に配置します。白金線とナイロン弦で作られた金属製のハープでそれを押したままにします。
7. 視覚Dodt照明やIR-DIC下にスライスを検査します。星状細胞は、その小細胞体（φ= 10ミクロン）及び顕著な核（ 図1）によって識別することができる。
8. シナプス刺激の場合、パッチを計画しているアストロサイトから〜100μm程度離れて、双極ステンレス鋼電極を配置。
9. アストロサイトにパッチを適用し、非常に穏やかな吸引を適用することにより、全細胞の構成で破る。
   注：アストロサイトは、通常、低入力resistancを持っているE（MΩ〜10）、過分極静止膜電位（〜-90 mVで）、無発火活動。アストロサイトは、電圧クランプモード（ すなわち保持電流が0 pAのをお読みください）での実験を通してその静止膜電位に保たれている。各刺激の前に、10msの過分極電圧ステップ（-3 mVの）は、星状細胞の一連の入力抵抗を監視するために使用される。
10. 直列抵抗が変化する> 20％またはアストロサイトの膜電位が脱分極になった場合ば録音を破棄します。星状細胞の膜電位を直接クランプ電圧から電流クランプモードに切り替えて測定することができる。代替的に、電圧クランプモード中に、膜電位を0 pAをもたらすが、現在保持している保持電位の値を読み取ることによって監視することができる。
11. シナプス刺激が採用されている場合は、別のシングルとペアの刺激（離れ例えば 100ミリ秒）ごとに10から20秒。
12. UV光分解experim用エントは、顕微鏡の落射蛍光ポートにアンケージングのXeランプを接続し、細胞外液にケージド化合物を追加します。 100μM視野全体におけるMNI-L-グルタミン酸（Ø= 662.5μmの40X客観^14を使用している場合）。をフラッシュ-アンケージング時〜100 pAの振幅のトランスポーター電流を得ることが可能となるオープンとブロック光路、すべての10と交互に刺激 - 20秒。
13. トランスポーター電流振幅を低減するために、制御条件や広域グルタミン酸輸送体アンタゴニストD、L- トレオ -β-ベンジルオキシ安息香酸（10μMTBOA）のサブ飽和濃度の存在下でグルタミン酸トランジェントとレコード輸送電流を呼び起こす完全にトランスポーター電流を遮断し^、+電流持続Kを隔離する（セクション3を参照） -少なくとも30その制御値の％（セクション4,5を参照）またはTBOAの高濃度（100μM50）の存在下に。

3。 Pharmac持続的なK ⁺電流のological離

1. 制御条件やTBOAの高い、飽和濃度（ - 100μM50）の存在下でアストロサイトの電流を記録します。
2. TBOAの平均少なくとも20スイープを（50 - 100μM）。
3. 関数で3.2で得られた平均痕跡を合わせる：
   
   注：TBOA小文字を区別しないコンポーネントは、（すなわちTBOAの存在（50に記録されているもの- 100μM））持続的なK ⁺電流を表します。その経時変化は、上述したモノ指数関数によって近似される。
4. 異なるアストロ渡っこのフィットを繰り返し、Τ _上昇 （持続K（セクション5を参照^）+電流の平均立ち上がり時間をIE）の平均値を導出する。

4。私シナプス活性化トランスポーター電流のファシリテーター部分（fSTCs）のゾル化

1. 制御条件やTBOA（10μM）（ 図2aの左）で、対になった刺激を用いて得られた平均的な少なくとも20スイープ。
2. 制御条件およびTBOAの単一刺激（10μM）（図2a中央）で得られたスイープの平均同じ数。
3. 4平均痕跡で-3 mVの電圧ステップ（制御シングルパルス、制御ペアリング·パルス、TBOA単一パルス、TBOAペアリング·パルス）への平均電流応答の振幅を比較してください。
4. 電流応答の振幅がすべての4つのトレースで同じである場合には、4.7に進みます。
5. 平均電流応答の振幅は4つのトレースのいずれかに異なっている場合、すべての個々のトレースは、平均的に含めることが適切であったことを確認する。
6. 平均電流の振幅は、4つのトレースのいずれかが異なるが、すべての場合分離したトレースが平均に含めることが適切であり、試験電圧ステップに応答して電流の大きさを直線的に各トレースにfSTCスケールの大きさのことを検証する。このような場合には、試験電圧ステップに応答電流の振幅が全て等しくなるように、互いに対してすべてのトレースを縮小。
   注：ここで説明した記録条件では（すなわち、細胞内CH ₃ SO ₃ ^{- 、}またはC ₆ H ₁₁ O ₇ ^{- ）、}興奮性軸索のシナプスの刺激には、現在の、遅い速い立上り過渡内側ストイキから成る複雑な波形とアストロサイトの電流を発生昇、近隣の軸索に沿って活動電位の伝播後に細胞外空間内向きK ⁺電流を反映したK ⁺再平衡化を支えた。残留電流につながるとして、それは^、+ -現在、この持続的なKを除去することが重要ですグルタミン酸生涯の過大評価。
7. ペアの刺激（図2a右）で得られた平均的なトレースから単一の刺激を用いて得られた平均的なトレースを引きます。このステップでは、化学量論および第二刺激によって誘発持続K ⁺電流を分離することができます。
8. ペアリング·パルス（ すなわち 100ミリ秒）（図2b）を送達するために使用されるパルス間の間隔と一致する時間間隔によって、単一の刺激を用いて得られた平均的なトレースをシフトします。
9. 4.7（ 図2c）で得られた第二の刺激に対する平均応答から単一の刺激を用いて得られたタイムシフトの平均応答を引きます。このステップでは、第二の刺激（fSTC）により誘発されるトランスポーター電流の促進の部分を分離します。
10. ほとんどの場合、前のステップでは、完全に持続的なK ⁺電流を除去します。この場合は、fSTCの単離は完了し、proceすることができデコンボリューション解析とエドとアストロサイトからグルタミン酸クリアランスの経時変化を導き出す。場合によっては、しかしながら、小さい徐K ⁺電流がまだ存在している（ 図2D）、さらなる分析（第5節参照）が要求される。
    注：4.7から4.10に記載されて分析が制御条件やTBOA（10μM）で得られた平均トレース上で実行されなければならないことを覚えておいてください。

5。 fSTCsから残留zdustained K ⁺電流の減算

1. セクション4で説明した解析を実行した後、残りの持続K ⁺電流の振幅を測定します。
2. 5.1（ 図2D左と中央）で測定された残留持続K ⁺電流の振幅に3.3で説明モノ指数関数の振幅をスケーリングする。これを行うには、式3.3に、私は⁺電流持続Kの振幅に等しい期間を設定する5.1でasuredそして用語Τ _上昇は 3.4で推定Τ _上昇の平均値に等しい。
3. fSTCかつ持続K 4.10（ 図2dの右側）で得られた⁺電流に起因モノ指数関数を引きます。このステップは、fSTCの分離を完了します。

6。フラッシュ活性化トランスポーター電流のアイソレーション（FTCS）

1. 制御条件およびTBOAで開いて光路（10μM）を用いて得られた平均的な少なくとも20スイープ。
2. 光路を用いて得られたスイープの平均同一の数が制御条件やTBOA（10μM）で、閉じた。
3. 4平均トレース（制御シングルパルス、制御ペアリング·パルス、TBOA単一パルス、TBOAペアリング·パルス）で-3 mVの電圧ステップに対する電流応答の振幅を比較してください。
4. 電流応答の振幅がすべての4つのトレースで同じである場合には、6.7に進みます。
5. 平均電流の振幅は4つのトレースのいずれかが異なるが、すべての個々のトレースを平均的に含めることが適切である場合には、光路と各トレースでのサイズに対して直線的にFTCスケールの大きさを開いていることを確認試験電圧ステップに電流応答。このような場合には、試験電圧ステップに応答電流の振幅が全て等しくなるように、互いに対してすべてのトレースを縮小。
   注：ここで説明した記録条件では（すなわち、細胞内CH ₃ SO ₃ ^{- 、}またはC ₆ H ₁₁ O ₇ ^{- ）、}フラッシュ刺激は内向き電流、高速の立上り過渡ストイキのみで構成されるアストロサイトの電流を発生。
6. 光パット付き得られた平均トレースを減算hは開い光路を用いて得られた平均的なトレースからブロック。このステップでは、刺激アーチファクトを除去し、FTCSを分離することができます。
   注意：6.7で説明した分析が制御条件やTBOA（10μM）で得られた平均トレース上で実行する必要があります。

7。デコンボリューション解析

1. フィット制御条件（ 図3aは左）やなどのセクション4で説明TBOA（10μM）（ 図3Aの右）と隔離された中で記録された現在のトランスポーター（fSTCまたはFTC） -多指数関数と、6：
   
2. 減衰モノ指数関数に従ってという瞬時上昇関数を作成します：
   
   とそれはTBOA（10μM）（図3b）に記録されているトランスポーター電流の減衰位相を最もよく表し。
   注：7.2（すなわち、H（t））がに記載関数はTBOA（10μM）の存在下でのアストロサイトからのグルタミン酸クリアランスの経時変化を表している。
3. 7.1（ 図3aは 、右、cは左）で得られたTBOA（10μM）に記録されているトランスポーター電流のフィットから7.2（図3b、3cの真ん中）で得られたモノ指数関数をデコンボリューション。
   注：デコンボリューション（例えばMatlabの、Pythonの）のような多くの解析ソフトウェア·パッケージに含まれている数学的な操作です。離散フーリエ変換を用いることにより、後述するようにIgorPro、我々は一般的にこの種の分析を実行するために使用するプログラミング·コードでは、デコンボリューション動作を効率的に計算することができる。まず、ジを計算するためにFFT演算を用いる7.2で得られたモノ指数関数および7.1で得られたTBOAに記録されているトランスポーター電流の適合screte高速フーリエ変換。次に進む二FFT関数の比の逆離散フーリエ変換を計算するためにIFFT演算を使用する。結果として機能I（t）は次のように説明することができます：
   
   7.3で説明したステップがTBOAで現在のトランスポーター（10μM）（ 図3c右）のフィルタを導出することができます。 6（すなわちfSTCまたはFTC） -フィルタは、セクション4で単離され、現在のトランスポーターにアストロサイトの膜にグルタミン酸の寿命を変換歪み要因を表します。
4. 制御条件（ 図3Aに現在のトランスポーターのフィットから（ 図3c右、 図3d中央）フィルタをデコンボリューション図3dの左）。
   注：このステップは、コントロール条件におけるアストロサイト（ 図3dの右）からグルタミン酸クリアランスの経時変化を導出することができます。このデコンボリューションのステップの基礎となる仮定は、フィルタの時間プロファイルは、コントロール条件のとTBOA（10μM）で変更されないということです。
5. グルタミン酸クリアランスの全体的な時間経過の定量的な推定値を得るためには、ステップ7.4で得られた波形の重心（<T>）を計算。これは、次のように<T>を計算することによって行われます。
   
   ここで、G（t）は 、ステップ7.1で得られた波形である。上述の式において、用語tは積分が計算される時間窓に対応する。
   注：メソッドが最初に確立された、<t>の制約を受け^、13残された時間枠にわたって計算した。積分窓が完全に戻ってベースライングルタミン酸クリアランスとクリアランス波形減衰の持続時間よりも広くなるように設定されているように、このアプローチであれば用いることができる。この条件が満たされない場合、しかしながら、<t>のを推定するこの方法にはいくつかの制限に遭遇する。クリアランス波形がベースラインに戻って正確に減衰していない場合、その後、統合<t>のウィンドウの幅が増大する。 <t>の推定のための不正確さの潜在的な源を避けるために、我々は現在、発病¹⁴前後の輸送電流のピークの10％に相当する時間窓の上にそれを計算する。後者のアプローチは<T>はセル間で測定されるとの整合性を向上させます。隙間の時間経過に薬理学的治療の小さな影響を分析する際には、特に便利です。

Representative Results

分析的アプローチの成功は非常に中枢神経系の任意の領域におけるアストロサイトからトランスポーター電流の高品質の電気生理学的記録を取得するに依存し、ここで説明。急性マウス海馬スライスでは、アストロサイトは容易にため、その小さな細胞体（Ø= 10μm）の著名な核（ 図1）のDodt照明や​​IR-DICの下で識別することができます。細胞内液、（ 図1）にアレクサ594（50μM）のような蛍光体を追加するときに、その特徴的な星型の形態は、共焦点落射蛍光、または二光子レーザー走査顕微鏡で理解することができる。電気生理学的レベルでは、星状細胞は、低入力抵抗、過分極膜電位（〜-90 mVの）および活動電位を生成することができないことを特徴とする。アストロサイトは、隣接するニューロンの電気的またはoptogenetic刺激とCAのUV光分解に応じて電流を発生MNI-L-グルタミン酸のようなGED化合物。

星状細胞輸送電流はセシウム⁺またはK ⁺ベースの内部溶液を用いて記録することができる。セシウム^+、人気K ⁺代替は、グルタミン酸輸送をサポートしていますが、グルタミン酸トランスポーターの循環率を^16,17を遅らせることに注意してください（なぜならグルタミン酸トランスポーターの結合および/ ​​または転位セシウム⁺膜を横切ってよりゆっくりK ^+）。 Csは^+が大幅に結合グルタミン酸に使用できるトランスポーターの数が減少した場合、それはまたK ⁺をベース内部の溶液^16,17に記録されたものよりも小さい低速/トランス電流をもたらす。

又はC ₆ H ₁₁ O ₇ ^{- -}主細胞内アニオンとして、アストロサイトにおけるグルタミン酸輸送体によって生成される電流は、1グルタミン酸の化学量論的に結合された運動に起因するのNa 3 CH ₃ SO _3を使用する場合に+と1 K ⁺膜を通過。このストイキ電流は光分解実験でアストロサイトから記録唯一のものであると我々はFTCとしてそれを参照してください。光分解実験を行う際に、それがオープンし、ブロック光路を用いて得られた代替UV刺激することを推奨します。ブロックされて光路を用いて得られたトレースは、フラッシュランプによって生成され、完璧にFTCを分離するために開いた光路を用いて得られたものから差し引くことができる刺激アーチファクトを分離するのに有用である。

グルタミン酸のシナプス放出を想起させるときアストロサイトに記録され、現在は、より複雑な波形を持っています。なお、上述した化学量論的に結合されたグルタミン酸輸送電流による高速立上り、過渡内方成分から構成される。また、Kの流入に起因遅い立ち上がり、持続的な内向きK ⁺電流⁺活動電位後に細胞外空間に蓄積さを備える近隣の軸索に沿って伝播。薬理学的ア ​​プローチは、持続K ⁺電流の電流輸送体を単離するために使用し、実験¹²の端部に広域スペクトルグルタミン酸輸送体アンタゴニストTBOA（100μM）の高濃度の使用を必要とすることができる。ここで説明する方法では、持続的なKから現在のグルタミン酸トランスポーター⁺電流を分離するために純粋に分析的なアプローチを使用していますので、短い実験（ 図2）を可能にします。

20秒、シングルとペアのパルス刺激を用いて得られたスイープの平均に等しい数 - 最初のステップとして、我々は、シングルとペアのパルスシナプス刺激（離れて100ミリ秒）ごとに10をインターリーブ。ペアの刺激により誘発される最初の電流の振幅は、単一の刺激により誘発される電流の振幅と一致する必要があります。我々は、により誘発されることから単一の刺激によって誘発された電流を差し引くことにより、この分析を開始するペアになって刺激。この減算はまた、高速立上り、過渡グルタミン酸輸送電流及び遅い立ち上がり、徐K（図2a右^）+電流なる第2の刺激に応答を単離することができる。次に、単一の反応の開始時には、上記分離された第二の反応の開始時間と一致するように、一対の刺激の間のパルス間隔に対応する時間間隔で、単一の刺激に対する応答をシフトする（図2b ）。これら2つの電流を減算することにより、我々はfSTC（ 図2c）を呼び出し、ここでトランスポーター電流の促進の部分を分離します。 fSTCの動態は、グルタミン酸トランスポーター拮抗^{TBOA（100μM）13}の高濃度での薬理学的に分離された現在のシナプス活性化トランスポーター（訓練センター）の動態と類似している。このような理由からと簡単にするために、前作では、我々はfSTC言及STC ^13,14として。類似の特性を持つ電流であるにもかかわらず、fSTCsと訓​​練センターでは同じ電流ではありません。この理由と精度のため、この作品では、我々はfSTCsと訓​​練センターとして明示的に参照されます。ここで説明したサブトラクション法は、ほとんどの録音でfSTCsの正確な分離が可能になります。しかし、いくつかのケースでは、残留徐K ⁺電流は依然として存在する。この場合には、TBOA高濃度の（ - 100μM50）を使用して、別々の実験において⁺電流持続Kを単離することが必要である。薬理学的に隔離された持続的なK ⁺電流の時間経過は、フォーム内のモノ指数関数によって記述することができます：

異なるセルにおけるアストロサイトの電流を記録することによって、我々はΤ _上昇の平均値を推定する。我々は次のクリートΤ _上昇が異なるアストロサイトで実験的に測定Τ _上昇の平均値に相当し、我々は削除する残留持続K ⁺電流の振幅（ 図2Dに対応するには、上記1、のようなEAモノ指数関数）。

シナプスを促進するからグルタミン酸放出を想起し、また対にパルスうつ病を受けるシナプスからのグルタミン酸放出を研究するために使用することができたときに我々はちょうどfSTCsを分離するために記載されている方法ではうまく動作します。検討中のグルタミン酸作動性シナプスは、短期的なファシリテーションやうつ病の明確な形を示していないときにしかし、それはほとんど役に立ちません。この場合には、TBOA高濃度（100μM）を有するトランス電流の薬理学的絶縁は、現在の化学量論的に結合され、シナプス誘発グルタミン酸輸送体を単離するための最も可能性の溶液のままである。

、IE）に電流振幅。ここでの目標は、録音のノイズからそれを区別する能力を失うことなく、現在のトランスポーターのかなりの時間経過を遅くすることである。基本的な仮定は、アストロサイトの吸収能が減少するTBOA、低濃度の存在下で、トランス電流の減衰を形成する主な要因は、星状細胞膜^12,18におけるグルタミン酸濃度が徐々に低下していることである。私たちは、多指数関数と（10μM）制御条件やTBOAにおけるトランスポーターは現在フィット：

（ 図3a）。我近似モノ指数関数的減衰（図3b）、我々はTBOA（10μM; 図3c）に現在のトランスポーターを記述する多指数関数からそれをデコンボリューションと瞬時に昇機能付TBOA（10μM）におけるグルタミン酸クリアランス。結果の波形は、 "フィルタ"であり、歪曲（ すなわちフィルタ）は、現在のトランスポーター（ 図3c）にグルタミン酸濃度プロファイルの要因の組み合わせを表します。制御条件における電流トランスポーターの多指数関数近似からフィルターをデコンボリューションする制御条件で記録された星状細胞（ 図3d）におけるグルタミン酸濃度分布の経時変化を推定することができる。このデコンボリューション解析のために、我々はその動態を前提としていのフィルタが存在しない場合とTBOA（10μM）の存在下で変更されないまま。 （ すなわち輸送動態、電気緊張フィルタリング、シナプス刺激中に、シナプスを越えグルタミン酸の非同期リリース）フィルタに寄与するすべての要因がTBOAの存在、数を減少させる化合物に影響されることはほとんどありませんので、これは妥当な仮定である結合グルタミン酸トランスポーターのために利用できる。

我々は、さまざまな細胞内のアストロサイトにおけるグルタミン酸膜寿命の尺度として重心（<T>）を使用します。<T>はクリアランス波形の"重心"を表しており、立ち上がり時間と減衰の両方の変化に敏感であるグルタミン酸クリアランス波形。重心は次のように表されます：

クラス= "jove_content">我々は、この式の分子と分母で積分を計算することができ、その上、時間間隔を決定する2つの方法があります。クリアランス波形が戻ってから減衰ゼロに上昇しているので、このメソッドが最初に確立されたときに、そこに統合ウィンドウを設定する方法で行わない仕様ではなかったし、実際には、これはむしろ緩く¹³行われました。この問題の周りの一つの方法は、例えば^、10％14のために、それはFTC / fSTCピークの任意の割合に到達するまでにかかる時間に統合·ウィンドウを制限することです。この単純な基準は、異なるセルにこの分析を実行するときに一貫していることができ、隙間の波形が完全にゼロに減衰しない<T>の推定値の精度が向上し、クリアランス波形のわずかな違いを分析の感度を向上させているかもしれ細胞の異なるグループで発生します。

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図1。急性海馬スライスにおけるアストロサイトの同定。（AB）CA1放線層における海馬アストロサイトのDodt画像。 Dodt照明やIR-DICの下では、アストロサイトは、その小さな細胞体と著名な核によって識別することができます。赤い矢印は、スライスの準備で識別することができ、複数のアストロサイトを指す。黄色の矢印は、蛍光色素（下記参照）でパッチ充填したアストロサイトを示しています。黄色の矢印で（AB）で強調パッチを適用したアストロサイトの海馬スライスと二光子の（CD）オーバーレイDodt画像、。アレクサ594（50μM）を加えて、内部のソリューション-この実験では、アストロサイトはKCH ₃ SO ₃でパッチと充填した。アストロサイトのプロセスが離れてトンから数十μmを延長彼は、セルの体を。左の注釈は、スライスで認識することができ海馬CA1形成の3つの主要な携帯層を識別します。

図2。アストロサイトに記録されているシナプス活性化トランスポーター電流からfSTCsの単離アストロサイトに記録されているシナプス活性化トランスポーター電流からfSTCsを分離するために必要な分析の手順（AC）スキーム。 fSTCs（セクション5を参照）から残留持続K ⁺電流を除去するために使用される（d）の分析アプローチ。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。

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図3。 。デコンボリューション解析はアストロサイトからグルタミン酸クリアランスの経時変化を導出する制御条件（左）およびTBOAの存在（;右10μM）で分離されたfSTC / FTCの（）モノ指数フィット使用 。 （b）は TBOAにおけるグルタミン酸のクリアランス（10μM）の経時変化を、モノ指数関数的減衰で瞬時に昇関数によって近似される。 （c）は TBOAで現在トランスポーター（10μM）の多指数関数近似からTBOA（10μM）におけるグルタミン酸クリアランスの時間経過をデコンボリューションするフィルタを推定することができます。 （d）は、対照条件下における電流トランスポーターの多指数関数近似からフィルターをデコンボリューションは、制御条件のアストロサイトからのグルタミン酸クリアランスの経時変化を推定することができる。files/ftp_upload/50708/50708fig3large.jpg "ターゲット=" _blank ">より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

ここでは、アストロサイトから電気生理学的記録を取得するための実験的なアプローチ、アストロサイトおよびアストロサイトのトランスポーター電流からグルタミン酸クリアランスの経時変化を導出する数学的方法ではグルタミン酸トランスポーター電流を分離する分析プロトコルを記述します。

分析の成功は、アストロサイトからのトランスと電流を記述するために使用されるフ​​ィッティングアルゴリズムの精度に高品質のパッチクランプ記録を得る能力に依存する。デコンボリューション解析は、以下の2つの仮定に依存している。（1）現在、実験的に記録されたトランスポーターにグルタミン酸クリアランスの経時変化を歪める複数のプロセスを線形システムとして表すことができる。絶対的ではあるが形状トランスポーター電流が非線形システム（原則グルタミン酸結合と輸送の両方が飽和を受けることができる）、実験的証拠インディカであることが要因の多く彼らの線形領域が広いことをTES。したがって、輸送電流のとグルタミン酸クリアランスの時間経過は、刺激の強さ、放出確率、及びグルタミン酸濃度^13,14,18の広い範囲にわたって同じまま。この近似は、我々の実験条件のために合法的であると思われるが、それは別の実験の準備にこの分析を繰り返す前に検証する必要があります（2）フィルタの特性がTBOA（10μM）の存在によって影響を受けません。 （ すなわち輸送動態、電気緊張フィルタリング、シナプス刺激中に、シナプスを越えグルタミン酸の非同期リリース）フィルタに寄与するすべての要因がTBOAの存在によって影響されることはほとんどありませんので、この仮定は妥当に思えます。

fSTCsとFTCSからグルタミン酸クリアランス波形を導出することによって、我々は、情報の2つの異なるタイプを取得する。 fSTCsを分析することによって、我々は時間を測定することastrocyチック膜はシナプスから放出されたグルタミン酸にさらされている。フルフィールドのUV照度（全アストロサイトの表面上にグ ​​ルタミン酸アンケージングによってIE）でFTCSを想起させることにより、我々はアストロサイト膜がuncagedグルタミン酸にさらされている時間を測定します。これらの実験では、すべてのアンケージンググルタミン酸分子は、同時に（ すなわち uncaged）がリリースされ、すべてのトランスポーターは、同一のグルタミン酸濃度によって、同時に活性化される。したがって、FTCSを分析することによって、我々は、アストロサイトグルタミン酸取り込み能力の間接的な読み出しを得ることができる。

方法は、グルタミン酸クリアランスはなく、トランス電流を喚起グルタミン酸濃度の実際の値の経時変化を推定することができ、ここで説明したことに留意することが重要である。推定時間コースは、我々は、電気生理学的アクセス権を持っているアストロサイト膜のすべての分野におけるグルタミン酸クリアランスの時間的経過の平均尺度ではありません：それはないですアストロサイト膜¹⁹内の異なる部位におけるグルタミン酸取り込みにおける不均一性に敏感トン。この情報は、グルタメート感受性蛍光レポーター²⁰の高分解能顕微鏡法で得られる可能性が高くなる。しかし、現在利用可能なグルタミン酸に敏感な記者は比較的狭いダイナミックレンジを示す。これは一時グルタミン酸濃度に関する時間情報を抽出するためにこれらのプローブの使用を制限する、グルタミン酸濃度プロファイルと蛍光信号との間の非線形歪みを導入することができる。したがって、それは1つが星状細胞膜におけるグルタミン酸作動性シグナルのダイナミクスの中で最も包括的な理解を得ることができるすべてのこれらの異なるアプローチを組み合わせることで、おそらくです。

要約すると、ここに提示方法は星状細胞膜におけるシナプスリリースあり又はフラッシュuncagedグルタミン酸のクリアランス時間変化を推定することができる。彼らは貴重なツールを提供し、そのCAnの生理学的および病理学的条件の下で²¹動物種¹⁴と脳領域の様々な開発¹³のさまざまな段階で細胞外空間におけるグルタミン酸の寿命を推定するために使用することができる。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CGP52432	Tocris	1246
(R,S)-CPP	Tocris	173
DPCPX	Tocris	439
LY341495 disodium salt	Tocris	4062
MSOP	Tocris	803
NBQX disodium salt	Tocris	1044
D,L-TBOA	Tocis	1223
Picrotoxin	Sigma	P1675
MNI-L-glutamate	Tocris	1490
Alexa 594	Life Technologies	A10438	Optional
Matrix electrodes	Frederick Haer Company	MX21AES(JD3)
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments	PG10165-4
Dual-stage glass micro-pipette puller	Narishige	PC-10
Loctite 404 instant adhesive	Ted Pella	46551
Xe lamp	Rapp OptoElectronic	FlashMic
Igor Pro 6	Wavemetrics