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Neuroscience

성상 세포 운송업자 전류의 디컨 볼 루션 분석 글루타민산 정리의 시간 과정을 도출

Published: August 7, 2013 doi: 10.3791/50708
Automatic Translation
1, 1
1Synaptic Physiology Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

Summary

우리는 성상 세포의 글루타메이트 수송 전류의 전기 생리학 녹음에서 성상 세포 막에 글루타민산의 수명을 추정하는 분석 방법을 설명합니다.

Abstract

뇌의 글루타메이트 수송의 가장 높은 밀도는 성상 세포에서 발견된다. 3 나 + 1 H의 공동 수송 + 1 K의 반대 교통과 막에 걸쳐 글루타민산 글루타민산 염 수송 커플 운동 +. 전송 프로세스에 의해 생성 된 화학 양론 현재는 성상 세포에서 전체 세포 패치 - 클램프 녹음으로 모니터링 할 수 있습니다. 기록 된 현재의 시간 코스는 성상 세포가 노출하는 글루타메이트 농도 프로파일, 글루타민산 염 수송의 동역학, 그리고 성상 세포 세포막의 수동 electrotonic 속성의 시간 경과에 의해 형성된다. 여기에서 우리는 성상 세포의 글루타메이트 수송 전류를 기록하고 성상 세포 수송 전류의 파형을 형성하는 다른 모든 요인 글루타민산 정리의 시간 과정을 분리하는 데 사용할 수있는 실험 및 분석 방법에 대해 설명합니다. 여기에 설명 된 방법은 수명 (을)를 추정하는 데 사용할 수 있습니다F 플래시 uncaged 건강과 질병 동안 중추 신경계의 지역에서 성상 세포 막에 글루타민산 시냅스 발표.

Introduction

성상 세포는 별 모양의 형태와 neuropil를 통해 확장하고 이웃 시냅스 연락처 1,2에 도달 미세 막 돌기 두뇌에있는 가장 풍부한 세포 유형 중 하나입니다. 성상 '세포막 밀도가 글루타민산 염 수송 분자 3로 포장된다. 생리적 조건, 글루타민산 염 수송 빠르게 막 세포 측면에서 글루타민산 염을 바인딩하고 세포의 세포질에 전송할 수 있습니다. 이렇게함으로써, 수송은 세포 공간 4 글루타민산 낮은 기저 농도를 유지한다. 시냅스를 흥분성에 인접 좋은 성상 과정에서 글루타민산 염 수송은 이상적으로는 멀리 시냅스에서의 확산으로 시냅스 이벤트 기간 동안 출시 된 글루타메이트를 바인딩 할 수있는 좋은 위치에 있습니다. 이렇게하면, 전송기는 흥분성 신호의 공간적 확산을 감소 요정 여분의 시냅스 지역을 향해와 인근 시냅스 위에 글루타민산 유출을 제한5-7 뇌의.

글루타민산 염 수송 화학 양 론적 3의 움직임에 결합 electrogenic 과정 나 + 1 H의 자신의 전기 화학적 구배에 따라 + 1 K + 8 반 수송. (안산)> NO 3 - - (질산) ≈ CLO 4 - (과염소산)> I -> 대교 -> 염소 -> F -하지 글루타민산 염 수송은 SCN 투과 (그러나 화학 양 론적으로 결합되지 않음) 음이온 전도성과 연관되어 (메탄 설포 네이트)와 C 6 H 11 O - 7 - (글루 콘 산염) 9-11 CH 3 SO 3. 두 전류 (화학 양론 비 화학 양론) 시각 acut에 Dodt 조명이나 적외선 미분 간섭 대비 (IR-DIC)에서 확인 성상 세포에서 전체 세포 패치 - 클램프 녹음을 획득하여 기록 할 수 있습니다전자 뇌 조각 12. 막에 걸쳐 글루타민산 염 수송과 관련된 현재의 화학 양 론적 구성 요소가 CH 3 SO 3를 사용하여 분리 할 수 있습니다 - 또는 C 6 H 11 O 7 - 기반의 세포 내 솔루션과 성상 세포 13,14에 플래시 uncaging 글루타메이트에 의해 유발 될 수있다, 또는 인접 시냅스에서 글루타메이트 방출을 활성화하여, 하나 전기 12 대상 optogenetic 제어.

운송업자 현재의 화학 양 론적 구성 요소의 시간 과정은 성상 세포 멤브레인 (즉, 글루타민산 통관)에서 글루타메이트 농도 프로파일의 수명에 의해 형성되고, 글루타민산 염 수송, 성상 세포의 수동 막 속성의 동역학, 그리고에 의해 시냅스 자극,시 활성화 된 시냅스 13을 통해 글루타메이트 방출의 동시성. 여기에서 우리는 전체 상세 설명 : (1) 실험 APPR예를 들어 실험 준비로 급성 마우스 해마 슬라이스를 사용하여 성상 세포에서 전체 세포 패치 - 클램프 녹음에서 글루타민산 염 수송 전류의 화학 양 론적 구성 요소를 분리하는 oach (2) 분석 방법은 이러한 기록 13에서 글루타민산 정리의 시간 경과를 파생 14. 이 방법은 기록하고 중추 신경계의 지역에서 성상 세포의 글루타메이트 수송 전류를 분석하는 데 사용할 수 있습니다.

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Protocol

1. 슬라이스 준비

  1. 119의 NaCl, 2.5 KCl을, 0.5 염화칼슘, 1.3 황산 마그네슘 · 7H 2 O, 4 MgCl 2, 26.2 NaHCO3를 3, 1의 NaH 2 PO 4, 22 포도당, 320 : 포함 / 스토리지 솔루션 (MM)에 깔끔히 500 ML을 준비합니다 mOsm, 산도 7.4
  2. 슬라이스 침수 챔버를 준비하는 250 비이커를 사용하여 / 스토리지 솔루션을 깔끔히 200 ml의 그것을 채울, 34에서 물을 욕조에 따뜻하게 ° C 및 95 % O 2 5 % CO 2와 거품을.
  3. 4에서 유리 병에 남아있는 슬라이스 / 스토리지 솔루션 ° C를 유지
  4. vibratome 샘플 홀더에 작은 한천 블록 (6 %, ACSF에서 준비)를 부착하고이를 4 ℃에서 저장하는 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 사용
  5. 30 분 깔끔히 시작하기 전에, 얼음, 95 % O 2, 5 % CO 2 거품을 가득 양동이에 슬라이스 / 스토리지 솔루션을 포함하는 유리 병을 놓습니다.

  1. 할로 탄과 마우스 (P14-21, C57BL / 6) 마취 / isoflurane을 (isoflurane을가 성상 세포의 글루타메이트 흡수에 15를 강화하는 것으로보고되었습니다)를 참살하고, 산소, 차가운 슬라이스 / 스토리지 솔루션을 포함하는 50 ML의 비커에 머리를 찍어.
  2. 종이 타월로 감싸 -20 ° C.에 저장된 얼음 팩 뇌의 해부를 수행
  3. 정면에서 꼬리 끝으로, 머리의 등쪽면에 중간 시상 피부 절개를하고, 두개골을 노출하는 메스를 사용합니다.
  4. 후두 구멍에 수술 가위의 작은 쌍의 낮은 전단 블레이드를 배치하고 두 개의 절단, 왼쪽 방향과 오른쪽에 (45도 각도)를 확인합니다.
  5. 꼬리에서 정면 끝으로, 중간 시상 선을 따라 두개골을 잘라.
  6. 주걱으로 두뇌를 제거하고 산소, 차가운 슬라이스 / 보관 soluti입니다에 찍어합니다.
  7. 메스에 다섯 상처를 만들기 : (1) 후각 전구 및 전두엽 피질을 제거합니다 (2) 소뇌를 제거 (3) 왼쪽을 제거하고 (4) 오른쪽 측두엽, (5) 두 개의 뇌 반구를 분리 중간 시상 컷.
  8. DAB는 종이 타월로 두뇌의 두 부분은 과량의 용액을 제거합니다.
  9. 접착제 차가운 vibratome베이스 플레이트 각 뇌 영역의 측면 표면 :​​ 뇌의 등쪽면은 vibratome 블레이드를 직면해야한다 두뇌의 복부 측면 멀리 vibratome 블레이드에서 한천 블록과 접촉해야한다.
    참고 : 최고 품질의 조각을 얻기 위해, 그것은 뇌의 두 부분이 단단히 vibratome베이스 플레이트에 붙어 것이 중요합니다. 이 작업을 수행하는 너무 액체와 너무 빨리 건조하지 않는 아니다 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 사용합니다.
  10. 해부 챔버 vibratome베이스 플레이트를 고정, 슬라이스 일을 설정250 μm의 ickness 및 블레이드 실행의 폭을 조정합니다. 슬라이스를 진행합니다.
    참고 : 모든 것이 올바르게되어 있으면, vibratome은 뇌의 측면쪽으로 복부를 향해 지느러미로부터 내측에서 parasagittal 조각을 절단해야합니다.
  11. 블레이드 피질과 해마를 통과하면, 중뇌에서 대뇌 피질 / 해마를 잘라 34시 침수 챔버의 각 슬라이스를 배치 할 메스를 사용 ° C.
  12. 조각의 처음 몇 폐기하십시오. 일반적으로, 12 조각 (두께 250 μm의)는 P14-21 마우스 뇌에서 얻을 수 있습니다.
  13. 30 분 동안 34 ° C에서 조각을 유지하고이를 전기 생리학 녹음을 위해 그들을 사용하기 전에 30 분 동안 상온으로 냉각 할 수 있습니다.

2. 성상 식별 및 녹음

  1. 120 KCH 3 SO 3, 10 EGTA, 20 HEPES, 2 MgATP, 0.2 NaGTP : 포함하는 내부 솔루션 (mm 단위) 준비5 QX-314Br, 5 염화나트륨, 290 mOsm, 산도 7.2.
  2. 119의 NaCl, 2.5 KCl을 2.5 염화칼슘, 1.3 황산 마그네슘 · 7H 2 O, 1 MgCl 2, 26.2 NaHCO3를 1 NaHPO 4 및 22 포도당, 300 mOsm, 산도 7.4를 포함하는 세포 외 녹음 솔루션 (mm 단위) 준비 95 % O 2, 5 % CO 2로 포화.
  3. GluA, GluN, mGluRII, mGluRIII, GABA A, GABA B와 A1 아데노신 수용체 (μM)에서의 활성화를 차단하는 세포 레코딩 솔루션에 다음과 같은 약물을 추가 10 2,3 - 디 옥소-6-니트로-1, 2,3,4-tetrahydrobenzo [ƒ] -3 퀴녹 살린-7-술폰 아미드 나트륨 염 (NBQX), 10 (RS) - (2 - carboxypiperazin -4 - 일) 프로필-1-포스 폰산 (CPP), (2S ) -2 - 아미노 -2 - [(1S, 2S)-2-carboxycycloprop -1 - 일] -3 - (황색의 뜻 9 일) propanoic 산 나트륨 소금 (LY341495), 100 (R, S)-α- methylserine-O-인산 (MSOP), 100 picrotoxin, 5 - [[(3,4 - 디클로로 페닐) 메틸] 아미노] 프로필] diethoxymethyl) phosphinic 산 (CGP52432), 18-사이클로 펜틸-1 ,3-dipropylxanthine (DPCPX).
  4. - 36 ° C. 일반적으로 온도가 34 사이, 녹음 챔버에서 세포 용액의 온도를 설정
  5. 듀얼 스테이지를 사용하여 붕규산 유리 모세관 (R ≈ 2.5 MΩ), 유리 마이크로 피펫 풀러에서 패치 클램프 전극을 준비합니다.
  6. 조각 중 하나를 가지고 녹음 챔버에 배치합니다. 백금 와이어와 나일론 문자열로 만든 금속 하프로 누르고 있습니다.
  7. 시각 Dodt 조명이나 IR-DIC 아래의 조각을 검사합니다. 성상 세포들은 작은 세포 기관 (Ø는 = 10 ㎛)와 저명한 핵 (그림 1)에서 확인할 수 있습니다.
  8. 시냅스 자극을 위해, 바이폴라 스테인리스 전극을 배치 ~ 100 μm의 거리가 패치하려는 성상 세포에서.
  9. 성상을 패치하고 매우 부드러운 흡입을 적용하여 전체 셀 구성에서 휴식.
    주 : 성상은 일반적으로 낮은 입력 resistanc이E (~ MΩ 10), 과분극 휴식 막 잠재력 (~ -90 MV)없이 발사 활동. 성상 세포는 전압 클램프 모드 (즉, 유지 전류가 0 연평균 읽어야한다)의 실험을 통해 자사의 휴식 막 잠재력에 보관됩니다. 각 자극하기 전에 전압 단계 (-3 MV)를 hyperpolarizing 10 MS는 성상 세포의 시리즈와 입력 저항을 모니터링하는 데 사용됩니다.
  10. 직렬 저항의 변화> 20 % 성상 세포의 막 전위가 감극 될 경우 경우 녹음을 폐기하십시오. 성상 세포의 막 전위는 직접 전압 클램프의 전류 클램프 모드로 전환하여 측정 할 수 있습니다. 또는 전압 클램프 모드에서, 멤브레인 전위는 0 펜실베이니아에있는 결과는 현​​재 보유하는 지주 잠재력의 값을 읽어 모니터링 할 수 있습니다.
  11. 시냅스 자극을 고용하는 경우, 다른 하나 페어링 자극 (떨어져 예를 들어 100 밀리 초)마다 10-20 초.
  12. UV 광분해 experim에 대한엔트는 현미경의 epifluorescence에 포트에 uncaging 제논 램프를 연결하고 세포 솔루션에 갇힌 화합물을 추가합니다. 100 μM보기의 전체 필드에 MNI-L-글루타민산 (Ø = 662.5 μm의 40X 목표 14를 사용하는 경우).를 플래시 - uncaging 때 ~ 100 펜실바니아 진폭의 수송 전류를 얻을 수있다 개방과 차단 된 빛의 경로, 매 10와 다른 자극 - 20 초.
  13. 수송 전류 진폭을 줄이기 위해, 제어 조건과 광범위한 스펙트럼 글루타민산 염 수송 길항제 인 D, L-threo-β-Benzyloxyaspartic 산 (10 μM TBOA)의 하위 포화 농도의 존재 글루타민산 과도하고 기록 수송 전류를 보여주고 완전히 수송 전류를 차단하고 + 전류 지속 K를 분리하는 (3 절 참조) - 적어도 30의 컨트롤 값의 % (섹션 4, 5 참조) 또는 TBOA의 높은 농도 (100 μM 50)의 존재에 .

3. PHARMAC지속 K + 전류의 ological 분리

  1. 제어 조건과 TBOA의 높은 포화 농도 (- 100 μM 50)의 존재 성상 전류를 기록한다.
  2. TBOA의 평균 최소한 20 스윕 (50 - 100 μM).
  3. 기능 3.2에서 얻은 평균 흔적을 맞추기 :
    식 1
    참고 : TBOA 구분 구성 요소 (즉, TBOA의 존재 (50에 기록 된 한 - 100 μM)) + 전류 지속 K를 나타냅니다. 그 시간의 과정은 위에서 설명한 모노 지수 함수로 근사화된다.
  4. 다른 성상에 걸쳐이 적합을 반복하고 Τ 상승의 평균 값 (지속 K + 전류의 평균 상승 시간 (5 장 참조) 즉) 파생됩니다.

4. 나는시냅스 활성화 된 운송업자 전류의 촉진 된 부분 (fSTCs)의 solation

  1. 제어 조건과 TBOA의 짝을 자극 얻은 평균 최소한 20 스윕 (10 μM) (그림 2a 왼쪽).
  2. 제어 조건과 TBOA에서 하나의 자극 (10 μM) (그림 2A 중간)로 취득 스윕의 평균과 동일한 번호입니다.
  3. 개의 평균 추적 (제어 단일 펄스 제어 쌍 - 펄스 TBOA 단일 펄스, TBOA 쌍-펄스)의 -3 MV 전압 스텝 평균 전류 응답의 진폭을 비교합니다.
  4. 현재 응답의 진폭이 네 가지 흔적 같은 경우, 4.7 단계로 진행합니다.
  5. 평균 전류 응답의 진폭이 네 흔적의 다른 경우 모든 개별 트레이스의 평균에 포함하는 것이 적절 하였다 있는지 확인하십시오.
  6. 평균 전류의 진폭은 네 흔적의 차이입니다 만의 경우분리 된 흔적이 평균에 포함시킬 적절한 확인, 각 추적 선형 시험 전압 단계로 현재 응답의 크기에 FSTC 스케일의 크기를합니다.에게 이 경우 시험 전압 단계로 현재의 반응은 진폭이 모두 동일하도록 서로에 대해 모든 흔적을 확장 할 수 있습니다.
    참고 : 녹화 상태에서 (즉, 세포 CH 3 SO 3 - 또는 C 6 H 11 O 7 -) 여기에 설명, 흥분성 축색 돌기의 시냅스 자극은 현재 빠른 속도로 상승 과도 안쪽 양론과 느린 구성된 복잡한 파형과 성상 전류를 생성 - 상승, 안쪽 K를 지속 + 전류 K + 재 평형 주위의 축색 돌기를 따라 활동 전위 전파에 따라 세포 공간을 반영합니다. 그것은 어떤 잔류 전류로, + - 현재이 지속 K를 제거하는 것이 중요하면 될 것이다글루타민산 수명의 과대.
  7. 짝 자극 (그림 2a 오른쪽)에서 얻은 평균 추적에서 하나의 자극으로 얻은 평균 추적을 뺍니다. 이 단계는 화학 양론과 지속적인 K 두 번째 자극에 의해 유발 + 전류를 분리 할 수 있습니다.
  8. 짝 - 펄스 (즉, 100 밀리 초) (그림 2B)를 전달하는 데 사용되는 간 펄스 간격을 일치하는 시간 간격으로 단일 자극 얻은 평균 추적을 이동.
  9. 4.7 (그림 2C)에서 얻은 두 번째 자극에 대한 평균 응답에서 하나의 자극으로 얻은 시간 이동 평균 응답을 뺍니다. 이 단계는 두 번째 자극 (FSTC)에 의해 유발 운송업자 현재의 촉진 부분을 분리합니다.
  10. 대부분의 경우, 이전 단계 전적으로 지속 K + 전류를 제거합니다. 이 경우 FSTC의 분리는 완료되고 당신은 proce 수 있습니다디컨 볼 루션 분석 ED과 성상 세포에서 글루타민산 정리의 시간 경과를 파생. 어떤 경우에는, 그러나, 작은 지속 K + 전류는 여전히 존재한다 (그림 2D) 및 추가 분석 (제 5 장 참조)가 필요합니다.
    참고 : 4.7-4.10에서 설명하는 분석이 제어 조건과 TBOA (10 μM)에서 얻은 평균 추적을 수행해야 함을 기억하십시오.

5. 잔류 zdustained K 빼기 fSTCs에서 + - 전류

  1. 4 장에서 설명한 분석을 수행 한 후 나머지 + - 현재 지속적인 K의 진폭을 측정합니다.
  2. 잔류 지속적인 K의 진폭 + 전류 5.1 (그림 2D 왼쪽과 가운데)로 측정 하였다. 3.3에 설명 된 모노 지수 함수의 진폭을 확장 이 작업을 수행하려면, 식 3.3, 날 + 전류 지속 K의 진폭과 동일 기간 설정5.1 asured라는 용어 Τ 상승은 3.4 예상 Τ 상승의 평균 값과 같습니다.
  3. FSTC 지속적인 K의 + 전류 4.10 (그림 2D 오른쪽)에서 얻었다. 결과 모노 지수 함수 빼기 이 단계는 FSTC의 분리가 완료됩니다.

6. 플래시 활성화 트랜스 포터 전류의 절연 (FTCs)

  1. 제어 조건과 TBOA에 열려있는 빛의 경로 (10 μM)로 취득 평균 최소한 20 지나간다.
  2. 빛의 경로로 얻은 스윕의 평균과 동일한 번호를 제어 조건과 TBOA (10 μM)의 폐쇄.
  3. 개의 평균 추적 (제어 단일 펄스 제어 쌍 - 펄스 TBOA 단일 펄스, TBOA 쌍-펄스)의 -3 MV 전압 단계로 현재 응답의 진폭을 비교합니다.
  4. 현재 응답의 진폭이 네 가지 흔적 같은 경우, 6.7 단계로 진행합니다.
  5. 평균 전류의 진폭이 네 흔적의 차이이지만, 모든 개별 트레이스의 평균에 포함시킬 적절한 경우, 빛의 경로 각 추적에서의 크기에 따라 선형 적으로 FTC 스케일의 크기를 열 수 있는지 확인 시험 전압 단계로 현재 응답. 이 경우 시험 전압 단계로 현재의 반응은 진폭이 모두 동일하도록 서로에 대해 모든 흔적을 확장 할 수 있습니다.
    참고 : 녹화 상태에서 (즉, 세포 CH 3 SO 3 - 또는 C 6 H 11 O 7 -) 여기에 설명 된 플래시 자극은 빠르게 상승 과도 화학 양론 내향 전류의 단지로 구성 성상 전류를 생성합니다.
  6. 빛을 퍼트로 얻은 평균 추적을 빼기H가 열려 빛의 경로로 얻은 평균 추적 차단. 이 단계는 자극 아티팩트를 제거하고 FTCs를 분리 할 수​​ 있습니다.
    참고 : 6.7에서 설명한 분석은 제어 조건과 TBOA (10 μM)에서 얻은 평균 추적을 수행해야합니다.

7. 디컨 볼 루션 분석

  1. 맞춤 제어 조건 (그림 3A 왼쪽)과 같은 섹션 4에서 설명한 TBOA (10 μM) (그림 3A 오른쪽) 및 격리에 기록 된 현재의 수송 (FSTC 또는 FTC) - 멀티 지수 함수, 6 :
    식 2
  2. 붕괴는 모노 지수 함수에 따라 그 즉시 상승 함수를 만듭니다 :
    식 3
    과그 TBOA (10 μM) (그림 3B)에 기록 된 운송업자 현재의 부패 단계를 가장 잘 설명합니다.
    참고 : 7.2 (즉, H (t))에 설명 된 기능은 TBOA (10 μM)의 존재 성상 교세포에서의 글루타메이트 정리의 시간 경과를 나타냅니다.
  3. 7.1 (그림 3A, 오른쪽, C 왼쪽)에서 얻은 TBOA (10 μM)에 기록 된 운송업자 현재의 적합 7.2 (그림 3B 및 3C 중간)에서 얻은 모노 지수 함수를 Deconvolve.
    참고 : 디컨 볼 루션 (예를 들어 Matlab을, 파이썬) 같은 많은 분석 소프트웨어 패키지에 포함 된 수학적 작업입니다. IgorPro, 우리는 일반적으로 이러한 종류의 분석을 수행 할 때 사용하는 프로그래밍 코드는 디컨 볼 루션 연산을 효율적으로 이산 푸리에 변환을 사용하여 아래와 같이 계산 될 수있다. 첫째, 디 계산하는 FFT 연산을 사용screte 고속 푸리에 7.2에서 얻은 모노 지수 함수와 7.1에서 얻은 TBOA에 기록 된 운송업자 현재의 적합의 변형. 다음으로, 두 개의 FFT 기능의 비율의 역 이산 푸리에 변환을 계산하기 위해 IFFT 연산을 사용합니다. 결과 함수 I (t)는 다음과 같이 설명 할 수 있습니다 :
    식 4
    7.3에서 설명하는 단계는 TBOA (10 μM) (그림 3C 오른쪽) 전류 수송의 필터를 파생 할 수 있습니다. 6 (즉, FSTC 또는 FTC) - 필터 섹션 4에서 격리하는 수송 전류에 성상 세포 막에 글루타민산의 수명을 변환 왜곡 요소를 나타냅니다.
  4. (제어 조건에서 전류 수송의 적합에서 (그림 3C 오른쪽 그림 3D 중간) 필터 그림 3A를 Deconvolve 그림 3D)는 떠났다.
    참고 :이 단계는 통제 조건에서 성상 세포 (그림 3 차원 오른쪽)에서 글루타메이트 정리의 시간 과정을 유도 할 수 있습니다. 이 디컨 볼 루션 단계를 기본 가정은 필터의 시간적 프로파일을 제어 조건과 TBOA (10 μM)에서 변경되지 것입니다.
  5. 글루타민산 정리의 전체 시간 과정의 정량적 추정치를 얻기 위해 단계 7.4에서 얻은 파형의 중심 (<T>)를 계산합니다. 이 <T>를 같이 계산하면됩니다 :
    식 5
    여기서 G는 (t) 파형 단계 7.1에서 얻을 수 있습니다. 방정식은 위에서 설명한에서는, 기간 t는 적분을 계산하는 동안 시간 창에 해당합니다.
    참고 :이 메서드가 처음 설립되었을 때,<T>은 13 구속 남겨진 시간 창을 통해 계산 하였다. 통합 윈도우가 완전히 다시 기준선에 글루타민산 통관 및 통관 파형 붕괴의 기간보다 넓은 것으로 설정되어이 방법은 오랫동안 사용할 수 있습니다. 이 경우가 아닌 경우, 그러나, <T>을 추정하는이 방법은 몇 가지 제한 사항을 만난다. 통관 파형베이스 라인을 정확하게 다시 부패하지 않는 경우 예를 들어, <T>은 통합 윈도우의 폭이 증가합니다. <T>의 추정에 대한 부정확성의 잠재적 인 원인을 방지하기 위해, 우리는 지금 그 발병 14 이전과 이후, 현재 수송의 피크의 10 %에 해당하는 시간 창에 그것을 계산합니다. 후자의 방법은 <T>이 세포를 통해 측정되는 일관성을 향상시킵니다. 정리의 시간 경과에 약물 치료의 작은 효과를 분석 할 때 특히 유용합니다.

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Representative Results

분석 방법의 성공은 매우 중추 신경계의 지역에서 성상 세포에서 수송 전류 고품질의 전기 생리학 녹음을 얻기에 따라 여기에 설명. 급성 마우스 해마 슬라이스, 성상 세포는 쉽게 때문에 그들의 작은 세포 기관 (Ø = 10 ㎛)와 저명한 핵 (그림 1)의 Dodt 조명이나 IR-DIC에서 확인할 수 있습니다. 세포 솔루션 (그림 1)에 알렉사 594 (50 μM)과 같은 형광 물질을 추가 할 때 자신의 독특한 별 모양의 형태는 공 촛점 epifluorescence에, 또는 두 개의 광자 레이저 스캐닝 현미경으로 감상 할 수 있습니다. 전기 생리학 수준에서 성상 세포는 낮은 입력 저항, 과분극 막 전위 (~ -90 MV)와 활동 전위를 생성하는 무능력에 의해 특징입니다. 성상 세포는 이웃 뉴런의 전기 또는 optogenetic 자극과 CA의 UV 광분해에 대한 응답으로 전류를 생성MNI-L-글루타민산 같은 GED 화합물.

성상 세포 수송 전류는 고사 + 또는 K + 기반의 내부 솔루션을 사용하여 기록 할 수 있습니다. 고사 +, 인기 K + 대용품, 글루타민산 염 전송을 지원하지만 글루타민산 염 수송 순환께서는 16, 17을 느리게하는 주 (때문에 글루타민산 염 수송 바인딩 및 / 또는시키다 고사 + 막에 걸쳐보다 훨씬 느리게 K +). 고사 + 크게 바인딩 글루타민산 사용할 수 운송업자의 수를 줄일 수 있다면, 그것은 또한 K + 기반의 내부 솔루션을 16,17로 기록 된 것보다 더 작은 / 느린 수송 전류 발생합니다.

또는 C 6 H 11 O - 7 - 주 세포 내 이온으로, 성상 세포의 글루타메이트 수송에 의해 생성 된 전류는 1 글루타민산의 화학 양 론적 결합 된 운동으로 인해 3 나 CH 3 SO 3를 사용하는 경우 +와 막에 걸쳐 1 K의 +. 이 화학 양론 전류는 광분해 실험에서 성상 세포에서 기록 된 단 하나이며 우리는 FTC로를 참조하십시오. 광분해 실험을 수행 할 때, 그것은 개방과 차단 된 빛의 경로를 얻어 대체 UV의 자극에 좋습니다. 차단 된 빛의 경로로 얻어진 트레이스는 플래시 램프에 의해 생성하고 완벽하게 FTC를 분리 열린 빛의 경로로 얻은 것들에서 공제 할 수있는 자극 이슈를 분리하는 데 유용합니다.

글루타메이트 시냅스 방출을 불러 일으키는 경우 성상에 기록 된 전류는 더 복잡한 파형을 가지고 있습니다. 그것은 위에서 설명한 화학 양 론적 결합 글루타민산 염 수송 전류로 인해 빠른 속도로 상승, 과도 안쪽 구성 요소로 구성되어 있습니다. 또한, K의 유입으로 인한 느린 상승, 지속 안쪽 K + 전류 + 활동 전위 후 세포 공간에 축적를 포함이웃 축삭을 따라 전파. 약물 접근 방식은 지속 K + 전류의 전류 수송을 분리하는 데 사용 실험 12의 끝에 광범위 글루타민산 염 수송 길항제 TBOA (100 μM)의 높은 농도의 사용을 필요로 할 수 있습니다. 여기에 설명 된 방법은 + 전류 따라서 짧은 실험 (그림 2)을 허용 지속적인 K에서 현재 글루타민산 염 수송을 분리하는 순수 분석 방법을 사용합니다.

20 초, 단일과 짝 펄스 자극으로 얻은 스윕의 평균 동수 - 첫 번째 단계로, 우리는 하나의 페어링 펄스 시냅스 자극 (떨어져 100 밀리 초)마다 10 인터리브. 짝 자극에 의​​해 유발 제 1 전류의 진폭은 하나의 자극에 의​​해 유발 전류의 진폭을 일치해야합니다. 우리는에 의해 유발 그것에서 하나의 자극에 의​​해 유발되는 전류를 차감하여 분석을 시작짝 자극. 이 공제는 현재 빠른 속도로 상승, 과도 글루타민산 염 수송 및 느린 상승, 지속 K + 전류 (그림 2a 오른쪽).으로 구성되어 두 번째 자극에 반응을 분리 할 수 있습니다 다음으로, 우리는 하나의 응답의 발병 시간은 위에 고립 된 두 번째 반응의 개시의 시간을 일치하도록, 쌍 자극 간 펄스 간격에 해당하는 시간 간격으로 단일 자극에 대한 반응을 이동한다 (그림 2B ). 이 두 전류를 빼서, 우리는 우리가 FSTC (그림 2C)를 호출 여기에 운송업자 현재의 촉진 부분을 격리 할 것. FSTC의 반응 속도는 글루타민산 염 수송 길항제 TBOA (100 μM) 13의 높은 농도가 약리학 고립 현재 시냅스 활성 운송업자 (STCs)의 반응 속도와 비슷합니다. 이러한 이유와 단순성, 이전의 연구에서, 우리는 FSTC 함STC 13,14으로. 유사한 특성을 가진 전류에도 불구하고, fSTCs 및 STCs 같은 현재 없습니다. 이런 이유로과 정확성을 위해,이 연구에서, 우리는 fSTCs 및 STCs로 명시 적으로 참조합니다. 여기에 설명 빼기 방법은 대부분의 레코딩에 fSTCs 정확하게 분리 할 수​​ 있습니다. 하지만, 일부의 경우, 잔여 지속 K + 전류는 여전히 존재합니다. 이 경우에는 TBOA의 높은 농도 (- 100 μM 50)를 사용하여 별도의 실험에서 + - 현재 지속적인 K를 격리 할 필요가 있습니다. 약리학 적으로 절연 지속 K + 전류의 시간 코스는 형태의 모노 지수 함수에 의해 설명 될 수 있습니다 :

공식 6

다른 세포의 성상 세포 전류를 기록하여, 우리는 Τ 상승의 평균 값을 추정한다. 우리는 다음 creat에같은 개 모노 지수 함수는 Τ 상승이 다른 성상 세포에서 실험적으로 측정 Τ 상승의 평균 값에 해당하며 우리가 제거 할 + 전류있는 잔류 지속적인 K의 진폭 (그림 2D에 해당하는 위에서 설명한 ).

시냅스 촉진의 글루타메이트 방출을 불러 일으키고 또한 쌍 펄스 우울증을 겪는 시냅스에서 글루타메이트 방출을 연구하는 데 사용할 수있을 때 우리는 단지 fSTCs을 분리하는 기술 방법은 잘 작동합니다. 연구중인 글루타메이트 시냅스 단기 촉진이나 우울증의 명확한 형태를 표시하지 않는 경우 그러나, 그것은 거의 사용이다. 이 경우, TBOA의 높은 농도 (100 μM)와 수송 전류의 약물 격리 화학 양 론적 결합, 시냅스 - 유발 글루타민산 염 수송 전류를 분리하는 가장 실현 가능한 솔루션 남아있다.

즉). 여기에서 목표는 녹음의 소음과 구별 할 수있는 능력을 잃지 않고 현재 수송의 상당히 시간 과정을 느리게하는 것입니다. 기본 가정은 성상 세포의 흡수 능력이 감소되어 TBOA의 작은 농도의 존재, 수송 전류의 붕괴를 형성하는 주요 요인은 성상 세포 막 12,18의 글루타메이트 농도의 점진적 하락 것입니다. 우리는 멀티 지수 함수 (10 μM) 제어 조건과 TBOA의 수송 전류에 맞게 :

"식

(그림 3A). 우리는 대략 모노 지수 붕괴 (그림 3B), 우리가 TBOA (10 μM, 그림 3C) 현재의 수송을 설명하는 멀티 지수 함수에서 deconvolve로 즉시 - 상승 기능 TBOA (10 μM)의 글루타메이트 정리. 결과 파형은 "필터"이며, 요인의 조합을 나타내는 왜곡 (예 : 필터) 현재 수송 (그림 3C)에 글루타메이트 농도 프로파일. 제어 조건에서 전류 수송의 멀티 지수 피팅에서 필터를 Deconvolving은 제어 조건에서 기록 된 성상 세포 (그림 3D)에서 글루타메이트 농도 프로파일의 시간 경과를 추정 할 수 있습니다. 이 디컨 볼 루션 분석을 위해, 우리는 가정 그 반응 속도론의 필터 부재와 TBOA (10 μM)의 면전에서 변경되지 않은 남아 있습니다. (즉, 수송 속도론, electrotonic 필터링 및 시냅스 자극하는 동안, 시냅스를 통해 글루타메이트의 비동기 버전) 필터에 기여하는 모든 요소가 TBOA의 존재의 수를 줄일 화합물에 의해 영향을받을 가능성이 있기 때문에이 합리적인 가정이다 바인딩 글루타민산 사용할 전송기.

우리는 다른 세포의 성상 세포 세포막의 글루타메이트 수명의 척도로 중심 (<T>)를 사용합니다. <T>는 통관 파형의 "질량 중심"을 나타냅니다, 그리고 상승 시간과 부패의 변화에 민감하다 글루타민산 정리 파형. 중심은 다음과 같이 표현된다 :

식 5

클래스 = "jove_content"> 우리는이 식의 분자와 분모에 적분을 계산할 수있는 동안 시간 간격을 결정하는 방법은 두 가지가 있습니다. 통관 파형은 후면과 부패 제로로 상승하기 때문에,이 메소드가 처음 설립되었을 때,가 통합 창을 설정하는 방법에 만든 어떤 사양은 없었으며, 사실이 오히려 느슨하게 13 이루어졌다. 이 문제를 해결하는 한 가지 방법은 10 %에게 예를 들어, 그것은 FTC / FSTC 최대의 임의의 비율에 도달하는 데 걸리는 시간을 14 통합 창을 제한하는 것입니다. 이 간단한 기준이 서로 다른 세포에서 이러한 분석을 수행 할 때 일관성이있게 정리 파형이 0 완벽하게 부패하지 않는 <T>의 추정 정확도를 향상하고, 통관 파형의 작은 차이 분석의 감도를 향상하는 수도 세포의 다른 그룹에서 발생합니다.

E 1 "FO : 콘텐츠 너비 ="3 인치 "FO : SRC ="/ "는 SRC ="/ files/ftp_upload/50708/50708fig1.jpg "/를 files/ftp_upload/50708/50708fig1highres.jpg>
그림 1. 급성 해마 슬라이스 성상 세포의 식별. (AB) CA1 계층 radiatum에있는 해마 성상 세포의 Dodt 이미지. Dodt 조명 및 IR-DIC에서 성상 세포들은 작은 세포 몸과 저명한 핵으로 식별 할 수 있습니다. 빨간색 화살표 슬라이스 준비에서 확인 할 수있는 여러 성상을 가리 킵니다. 노란색 화살표 (아래) 형광 염료로 패치하고 채워졌다 성상을 보여줍니다. 해마 슬라이스과 노란색 화살표 (AB)으로 강조 패치 성상 세포의 두 광자의 (CD) 오버레이를 Dodt 이미지입니다. 알렉사 594 (50 μM)를 첨가 기반으로 내부 솔루션 -이 실험을 위해, 성상은 KCH 3 SO 3로 패치 및 가득 차 있었다. 성상 과정은 멀리 t에서 ㎛의 수십 확장그는 세포 몸을. 왼쪽의 주석 조각에서 인식 할 수있는 해마 CA1 형성의 세 가지 주요 세포 레이어를 식별합니다.

그림 2
그림 2. 성상 세포에 기록 된 시냅스 활성 수송 전류에서 fSTCs의 분리. 성상에 기록 시냅스 활성 수송 전류에서 fSTCs을 분리하는 데 필요한 분석 단계 (AC) 계획. (D) (5 장 참조) fSTCs에서 + - 전류 잔류 지속적인 K를 제거하는 데 사용되는 분석 방식은. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 3 ENT 너비 = "6.5 인치"FO : SRC = SRC = "/ files/ftp_upload/50708/50708fig3.jpg"/ "를 /는 files/ftp_upload/50708/50708fig3highres.jpg">
그림 3. 에 사용 디컨 볼 루션 분석은 성상 세포에서 글루타민산 정리의 시간 과정을 유도 제어 조건 (왼쪽)과 TBOA의 존재 (10 μM, 오른쪽)의 고립 된 FSTC / FTC의 () 모노 지수 맞습니다.. (B) TBOA의 글루타메이트 정리 (10 μM)의 시간 코스는 모노 지수 붕괴로 즉시 - 증가 함수로 근사화된다. (C) TBOA 전류 수송의 멀티 지수 적합 (10 μM)에서 TBOA에있는 글루타민산 정리 (10 μM)의 시간 과정을 Deconvolving하면 필터를 추정 할 수 있습니다. (D) 제어 상태에서 전류 수송의 멀티 지수 피팅에서 필터를 Deconvolving은 제어 조건에서 성상 세포의 글루타메이트 정리의 시간 경과를 추정 할 수 있습니다.files/ftp_upload/50708/50708fig3large.jpg "대상 ="_blank "> 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

여기에 우리가 성상 세포의 전기 생리학 녹음을 얻기 위해 실험 방법을 설명 성상 세포의 글루타메이트 수송 전류를 분리하는 분석 프로토콜에 대한 수학적 방법은 성상 세포 수송 전류에서 글루타민산 정리의 시간 코스를 파생시킵니다.

분석의 성공은 성상 세포에서 고품질의 패치 클램프 녹음을 취득 할 수있는 능력과 수송 전류를 설명하는 데 사용되는 피팅 알고리즘의 정확성에 의존합니다. 디컨 볼 루션 분석은 다음과 같은 두 가지 가정에 의존한다. (1) 실험적 기록 운송업자 현재에 글루타민산 정리의 시간 과정을 왜곡 여러 프로세스가 선형 시스템으로 표현 될 수있다. 절대 측면에서 비록 모양 운송업자 전류가 비선형 시스템 (원리 글루타민산 바인딩 및 전송에 모두 채도를 치룰 수있다), 실험적 증거 indica의 것을 요인의 많은그들의 선형 정권이 넓은 것을 TES. 따라서, 수송 전류와 글루타민산 정리의 시간 과정은 자극 강도, 방출 확률과 글루타메이트 농도 13,14,18의 넓은 범위에 걸쳐 동일하게 유지됩니다. 이 근사치는 우리의 실험 조건에 대한 합법적 인 것으로 보인다 있지만, 서로 다른 실험 준비이 분석을 반복하기 전에 검증해야한다. (2) 필터의 특성 TBOA (10 μM)의 존재에 의해 영향을받지 않습니다. (즉, 수송 속도론, electrotonic 필터링 및 시냅스 자극하는 동안, 시냅스를 통해 글루타메이트의 비동기 버전) 필터에 기여하는 모든 요소가 TBOA의 존재에 의해 영향을받을 가능성이 있기 때문에이 가정은 합리적인 것으로 보인다.

fSTCs 및 FTCs에서 글루타민산 통관 파형을 유도함으로써, 우리는 정보의 두 가지 유형을 구하십시오. fSTCs를 분석하여, 우리는 시간을 측정하는 astrocyTIC 막은 시냅스에서 방출 글루타민산에 노출되어 있습니다. 전체 필드 UV 조명과 FTCs을 되살리는하여 (전체 성상 세포 표면에 글루타민산 염을 uncaging하여 즉,) 우리는 성상 세포 세포막이 uncaged 글루타민산 염에 노출되는 시간을 측정한다. 이 uncaging 실험의 모든 글루탐산 분자는 동시에 (즉, uncaged) 출시되는 모든 운송은 같은 글루타메이트 농도에 의해 동시에 활성화됩니다. 따라서 FTCs를 분석하여, 우리는 성상 교세포의 글루타메이트 흡수 능력의 간접 판독 값을 얻을 수 있습니다.

이 방법은 글루타민산 통관 아니라 수송 전류를 되살리는 글루타메이트 농도의 실제 값의 시간 경과를 추정 할 수 여기에 설명 된 것을주의하는 것이 중요합니다. 예상 시간 과정은 우리가 전기 생리학 액세스 할 수있는 성상 세포 멤브레인의 모든 영역에서 글루타민산 정리의 시간 코스의 평균 측정하지 않습니다 : 그것은 않습니다성상 세포 막 19 내의 다른 사이트에서 글루타메이트 흡수의 이질성에 민감한 티셔츠. 이 정보는 글루타민산에 민감한 형광 기자 (20)의 고해상도 현미경을 얻을 수 가능성이 높습니다. 그러나 현재 글루타민산 염에 민감한 기자는 상대적으로 좁은 동적 범위를 나타냅니다. 이 과도 글루타메이트 농도에 시간 정보를 추출하는이 프로브의 사용을 제한, 글루타메이트 농도 프로파일과 형광 신호 사이의 비선형 왜곡을 도입 할 수 있습니다. 따라서, 하나는 성상 세포 세포막의 글루타메이트 신호의 역학의 가장 포괄적 인 이해를 얻을 수있는 모든 다른 접근 방식을 결합하여 아마.

요약하면, 여기에 제시된 방법은 성상 세포 막에 시냅스 발표 또는 플래시 uncaged 글루타민산의 통관 시간 과정을 추정하는 데 사용할 수 있습니다. 그들은 유용한 도구를 제공하는 CAN 생리적 및 병리 적 조건 21 세 미만의 동물 종 14 뇌 영역의 다양한 개발 13의 다른 단계에서 세포 공간에서 글루타메이트의 수명을 추정 할 수.

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Disclosures

저자는 이익에 대한 갈등을 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

이 작품은 신경 장애 및 뇌졸중 교내 연구 프로그램 (NS002986)의 국립 연구소에 의해 지원되었다. AS 원고를 쓴 디컨 볼 루션 분석을 구현했습니다. JSD는 디컨 볼 루션 분석의 초기 버전을 개발하고 텍스트에 댓글을 달았습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CGP52432 Tocris 1246
(R,S)-CPP Tocris 173
DPCPX Tocris 439
LY341495 disodium salt Tocris 4062
MSOP Tocris 803
NBQX disodium salt Tocris 1044
D,L-TBOA Tocis 1223
Picrotoxin Sigma P1675
MNI-L-glutamate Tocris 1490
Alexa 594 Life Technologies A10438 Optional
Matrix electrodes Frederick Haer Company MX21AES(JD3)
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments PG10165-4
Dual-stage glass micro-pipette puller Narishige PC-10
Loctite 404 instant adhesive Ted Pella 46551
Xe lamp Rapp OptoElectronic FlashMic
Igor Pro 6 Wavemetrics

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References

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Scimemi, A., Diamond, J. S. Deriving … More

Scimemi, A., Diamond, J. S. Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents. J. Vis. Exp. (78), e50708, doi:10.3791/50708 (2013).

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